Microfluïdische Platform met multiplexverzending elektronische detectie voor ruimtelijke Tracking van Deeltjes

Het algemene doel van deze procedure is om een microfluïdisch platform te demonstreren dat resistieve pulssensoring combineert met code division multiple access om de detectie en het bepalen van de grootte van deeltjes in meerdere microfluïdische kanalen te multiplexen. Deze technologie, genaamd microfluidic CODES, kan helpen bij het realiseren van volledig geïntegreerde en echt draagbare lab-on-a-chip apparaten die zeer geschikt zijn voor point-of-care testen van biologische monsters in omgevingen met beperkte middelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de ruimtelijke en temporele manipulatie van deeltjes op de microfluïdische chip elektronisch kan volgen, waardoor een extern instrument zoals een microscoop overbodig wordt.

Onze technologie is compatibel met zachte lithografie en kan eenvoudig worden geïntegreerd in een microfotisch apparaat waarin deeltjes worden gefractioneerd om een directe elektronische uitlezing te verkrijgen, vergelijkbaar met een Coulter-teller. Om te beginnen met de constructie van het microfluïdische apparaat, genereert u een set van vier goudcodes van zeven bits. Ontwerp vervolgens vier unieke elektrode-indelingen op basis van de goudcodes met behulp van computerensteunthend ontwerp, of CAD-software zoals AutoCAD.

Laat tot slot het fotomasker met de ontworpen elektrode-indeling vervaardigen door een leverancier van fotomaskers. Week vervolgens een borosilicaatglaswafel van vier inch gedurende 20 minuten in een piranha-oplossing met een verhouding van vijf op één bij 120 °C. Verhit de wafel na het reinigen 20 minuten lang op een warmteplaat bij 200 °C om resterend water te laten verdampen.

Plaats de schone, droge wafer in een spin-coater. Breng 2 milliliters negatieve fotoresist-oplossing aan op de wafer en spin-coat bij 3000 revoluties per minuut gedurende 40 seconden. Droog de spin-gecoate wafer op een hotplate bij 150 graden Celsius gedurende één minuut.

Bedek de wafer met een chroommasker in het gewenste elektrodepatroon. Stel het gemaskerde fotolakoppervlak bloot aan UV-licht van 365 nanometer om een dosis van 225 millijoule per centimeter kwadraat te bereiken. Bak vervolgens de belichte fotolak op een warmteplaat bij 100 graden Celsius gedurende één minuut.

Dompel de wafer 15 seconden onder in photoresist-ontwikkelaar, was de gepatroneerde wafer vervolgens met een zachte spray van gedeïoniseerd water en droog de wafer onder een stroom nitrogengas. Plaats de gepatroneerde wafer daarna in een elektronenstraal-metaalverdampingsinstallatie. Zet een chroomlaag van 20 nanometer dik en een goudlaag van 80 nanometer dik op de wafer met een snelheid van één Angstrom per seconde.

Ets vervolgens de onderliggende fotolak door de metaalgecoate wafer 30 minuten lang in aceton te behandelen met ultrasone verhitting bij 40 kilohertz en 100% amplitude. Gebruik een dicing-zaag om de wafer naar behoefte in kleinere stukken te snijden. Om te beginnen met het vervaardigen van de mal voor het microfluïdische kanaal, dient een vier inch siliciumwafer op dezelfde wijze te worden gereinigd en gedroogd als de eerder beschreven borosilicaatwafer.

Plaats de siliciumwafer in een spin-coater en breng vier milliliters negatieve fotoresistoplossing aan. Spin-coat de wafer op 500 rpm gedurende 15 seconden, vervolgens op 1.000 rpm gedurende 15 seconden en tot slot op 3.000 rpm gedurende 60 seconden. Zet de wafer met de bovenzijde naar boven op een met aceton doordrenkt cleanroom-doekje om resterende fotoresist van de achterkant en de randen van de wafer te verwijderen.

Bak de wafer gedurende één minuut bij 65 °C en vervolgens gedurende twee minuten bij 95 °C. Plaats een chroommaskerpatroon voor de microfluïdische kanalen op de droge wafer. Stel de fotoresist bloot aan 365 nm UV-licht bij 180 mJ/cm² en bak de wafer daarna opnieuw bij respectievelijk 65 en 95 °C gedurende één en twee minuten.

Plaats de gepatterneerde wafer in een bak met fotoresist-ontwikkelaar en schud de bak voorzichtig gedurende drie minuten. Spoel de ontwikkelde wafer af met isopropanol en droog de wafer onder een stroom nitrogengas. Bak de wafer 30 minuten bij 200 °C en gebruik vervolgens een profilometer om te controleren of de dikte van de gepatterneerde fotoresist over de hele wafer uniform is.

Plaats de wafer in een vacuümdesiccator samen met 200 µL trichloorsilaan in een open petrischaal. Laat de wafer acht uur lang in de desiccator met het trichloorsilaan rusten om het waferoppervlak te silaniseren. Om te beginnen met de assemblage van het device, gebruikt u algemene cleanroomtape om de mal van de siliciumwafer in een petrischaal met een diameter van 150 mm te bevestigen.

Voeg 50 gram van een mengsel van polydimethylsiloxaan-prepolymeer in een verhouding van 10 op 1 toe aan de Petrischaal en ontgas het mengsel gedurende één uur in een vacuümdesiccator. Laat het ontgaste mengsel uitharden bij 65 °C gedurende ten minste vier uur. Gebruik een scalpel om de uitgeharde PDMS-laag uit te snijden en pel vervolgens de uitgeharde laag met een pincet van de mal af.

Snijd de PDMS in kleine stukjes. Pons de gaten voor het inlaat- en uitlaatmicrofluïdische kanaal met een biopsiepons. Plaats de PDMS-laag met de patroonzijde naar beneden op cleanroomtape om het gemachineerde oppervlak te reinigen.

Spoel het eerder voorbereide glazen substraat met elektroden af met aceton, isopropanol en gedeïoniseerd water. Droog het substraat onder een stroom nitrogengas. Plaats de PDMS-laag en het substraat in een RF-plasmagenerator die is ingesteld op 100 milliwatt, met de zijden van de micromachine naar boven gericht.

Activeer de oppervlakken van de micromachine in zuurstofplasma gedurende 30 seconden. Gebruik vervolgens een optische microscoop om de gepatroneerde PDMS-laag uit te lijnen met de oppervlakte-elektroden. Zodra deze zijn uitgelijnd, laat men de oppervlakken in fysiek contact komen om de PDMS-laag op het glazen substraat te verzegelen.

Het is cruciaal dat het patroon van de coatingelektrode op het glazen substraat correct is uitgelijnd met de microfluïdische kanalen van PDMS. Wanneer deze correct zijn uitgelijnd, zal de interactie van de deeltjes met de oppervlakte-elektrode de gewenste codegolfvorm voor multiplexing genereren. Bak het geassembleerde apparaat vijf minuten bij 70 °C, met de glaskant naar beneden.

Soldeer tot slot de draden aan de contactpads van de elektrode om de assemblage van het apparaat te voltooien. Om het experiment te starten, plaatst u het microfluïdische apparaat op de tafel van een optische microscoop. Verbind de referentie-elektrode van het apparaat met de signaaluitgangspoort van een lock-in versterker en breng een sinusgolf van 400 kilohertz aan.

Sluit de positieve en negatieve sensorelektroden aan op twee onafhankelijke transimpedantieversterkers. Verbind beide transimpedantieversterkers met de differentiële spanningsingangen van de lock-in versterker, waarbij het positieve sensorsignaal van het negatieve sensorsignaal moet worden afgetrokken. Sluit de demodulatoruitgang van de lock-in versterker aan op een data-acquisitie-eenheid.

Stel in de software voor gegevensacquisitie een bemonsteringssnelheid van 1 Megahertz in voor de uitgang van de lock-in versterker. Stel een hogesnelheidscamera in om de werking van het apparaat, zoals gezien onder de microscoop, optisch vast te leggen. Trek een voorbereide celsuspensie op in een spuit.

Plaats de monsterspuit in een spuitenpomp en verbind de spuit met het inlaatkanaal. Leid het uitlaatkanaal naar een afvalreservoir. Gebruik de spuitenpomp om de celsuspensie met een constante stroomsnelheid door het apparaat te stuwen, terwijl het impedantiemodulatiesignaal wordt geregistreerd.

Na voltooiing van het experiment worden de elektrische gegevens verwerkt met analysesoftware. Vergelijk het verwerkte elektrische signaal met beelden van de hogesnelheidscamera om een kalibratiecurve voor de celgrootte op te stellen. Een celsuspensie werd door een microfluïdisch sensoroppervlak geleid met vier unieke elektrodepatronen, afgeleid van orthogonale sensorcodes.

Alle vier de sensorsignalen werden geregistreerd via een enkele elektrische uitgang. De individuele sensor die bij elk geregistreerd signaal hoorde, werd geïdentificeerd door correlatie van de geregistreerde sensorsignalen met alle mogelijke codes, wat resulteerde in duidelijk onderscheidbare autocorrelatiepieken. Golfvormen veroorzaakt door interferentiesignalen bij gelijktijdige detectie van cellen in alle vier de kanalen werden opgelost met een iteratief algoritme.

Een opgenomen golfvorm werd gecorreleerd met alle mogelijke codes en de grootste autocorrelatiepiek werd geïdentificeerd. Het corresponderende individuele sensorsignaal werd gereconstrueerd en van de invoergolfvorm afgetrokken. Het residusignaal werd als invoer doorgegeven naar de volgende iteratie en dit proces werd voortgezet totdat het residusignaal geen autocorrelatiepieken meer produceerde.

De geschatte signalen werden verfijnd op basis van een optimalisatiealgoritme dat zocht naar de beste passing tussen de gereconstrueerde en de oorspronkelijk geregistreerde golfvormen met behulp van de methode van de kleinste kwadraten. De celpositie, grootte en de tijd om de sensor te passeren werden vervolgens bepaald op basis van het kanaalnummer, de amplitude, de duur en de relatieve timing van de geschatte sensorsignalen. De procedure werd gevalideerd door de elektrische signalen te vergelijken met optische metingen van de hogesnelheidscamera.

Zodra deze techniek onder de knie is, is deze zeer eenvoudig te implementeren, aangezien deze vanuit hardwareperspectief zeer simpel is. Er is geen actief on-chip component aanwezig. De techniek is direct compatibel met soft lithografie en de signaalverwerking is gebaseerd op een eenvoudig computationeel algoritme.

Door dit protocol te volgen kunt u microfluïdische chips vervaardigen met op codes gebaseerde multiplex elektrische sensoren en elektrische signalen decoderen voor bioanalytische metingen. Deze veelzijdige, schaalbare elektronische sensortechnologie kan eenvoudig worden geïntegreerd in diverse microfluïdische apparaten om kwantitatieve assays te realiseren door deeltjes ruimtelijk en temporeel te volgen terwijl ze op de chip worden verwerkt. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in het ontwerpen, vervaardigen en implementeren van een microfluïdische CODES-technologie.