Met behulp van Primary neurosfeerculturen om te studeren Primary Cilia

Het algemene doel van deze procedure is om neurosfeer gebaseerde kweekmethoden te gebruiken voor primaire neurale stamcellen en precursorcellen om primaire cilia biogenese en verkeer te bestuderen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het cilia veld te beantwoorden, zoals cilia biogenese en verkeer van cilia moleculen naar de primaire cilia. In primaire neurale stamcellen, neurale precursoren en neuronen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de primaire celcriteria van de neurale stamcellen, neurale precursoren en neuronen kunnen gebruiken om biogenese en ciliaire paden te analyseren in de context van de primaire cilium. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het kweken van neurale stamcellen technisch uitdagend is voor beginners. We zullen een demonstratie van deze methode laten zien, omdat dissectie van de laterale ventrikel en stappen zoals het kweken van neurosferen en kwantificering van primaire cilia gemakkelijk te leren zijn door het observeren van de kritieke stappen.

Begin deze procedure met een subventriculaire zone van de laterale ventrikel die wordt gedissecteerd van een volwassen muis met behulp van de whole mount dissectie methode. Plaats het weefsel dat de SVZ bevat in een buisje van 1,5 milliliter. Voeg 500 microliter van 0,05% Trypsin-EDTA in PBS toe en incubeer 15 minuten bij 37 graden Celsius in een waterbad.

Na de incubatie, voeg 500 microliter van stopmedium toe en pipet zachtjes 20 tot 30 keer met behulp van een 1 milliliter tip. Vermijd het vormen van luchtbellen tijdens het pipetteren. Hierna worden de cellen 8 minuten bij 500 keer G gecentrifugeerd.

Gooi het supernatant weg en voeg 1 milliliter PBS toe en resuspendeer de cellen door 5 keer zachtjes te pipetteren met behulp van een 1 milliliter tip. Centrifugeer 8 minuten bij 500 keer G. Aspibeer vervolgens het medium met behulp van een 1 milliliter tip en voeg 1 milliliter basaal medium toe.

Na het tellen van de cellen, plateer de cellen van één SVZ in een 10 centimeter schaal met 10 milliliter NSC medium en kweek bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Na vijf tot zeven dagen kunnen neurosferen worden waargenomen. Om cellen in gehechte neurosferen te analyseren door immunokleuring, draag 1 milliliter medium over dat meerdere neurosferen bevat naar een buisje van 1,5 milliliter en centrifugeer 8 minuten bij 500 keer G.

Na het verwijderen van het medium, fixeer de sferen met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten. Na het verwijderen van paraformaldehyde, incubeer de sferen met 30% sucrose, overnacht. En centrifugeer vervolgens opnieuw.

Was met PBS. Vervolgens, na centrifugeren zoals eerder, verwijder en gooi het supernatant weg. Pas vervolgens een pipet toe met een gesneden 1 milliliter tip en pipet 500 microliter OCT oplossing op de neurosferen.

Breng de OCT oplossing die de neurosferen bevat over in een wegwerpbare plastic vriesvorm. Vries vervolgens de mal aan droog ijs gedurende minimaal 15 minuten. Snijd secties met een cryostat.

Om de stamcellen in de neurosfeer te visualiseren, voer immunokleuring uit tegen de stamcelmarker Nestin. Om de primaire cilia in een neurosfeer te visualiseren, voer immunokleuring uit tegen ARL13B. Begin dit experiment een tot twee dagen na het zaaien van adhesief gedissocieerde neurale stamcellen op Poly-L-Lysine en Laminine gecoate coverslips.

Verander het medium in de experimentele putten naar honger medium, en naar vers NSC medium in de controleputten. Incubeer gedurende nog eens 24 uur. De volgende dag, fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Na fixatie, was twee keer gedurende vijf minuten met PBS, bij kamertemperatuur. En voer vervolgens immunofluorescentie uit volgens standaard protocollen. Monteer de coverslips met montage oplossing.

Droog vervolgens de glasplaat een nacht bij kamertemperatuur in het donker. De volgende dag, maak beelden op een compound microscoop bij de noodzakelijke vergroting. De microscoopcamera en objectieven moeten worden bediend met behulp van de bijbehorende software.

Neem voldoende z-secties met tussenpozen van 0,5 tot 0,8 micron. Voor de kwantitatieve analyse van ciliaire lokalisatie in adhesieve cellen, selecteer drie tot acht opeenvolgende velden met confluente cellen door het bekijken van het DAPI kanaal. Verzamel beelden van elk veld.

Kwantificeer het aantal primaire cilia met behulp van ImageJ. Open het dialoogvenster Plugins Analyze en selecteer het gereedschap Cell Counter om de cellen met GPCR positieve cilia te tellen. Gebruik vergelijkbare beeldintensiteit en contrastparameters voor alle beelden van hetzelfde experiment voor het tellen en exporteren.

24 uur na het kweken van gedissocieerde cellen in NSC medium of honger medium, werden cellen gefixeerd en geïmmunokleurt tegen GPR161 getoond in groen, ARL13B dat rood verschijnt, en DNA getoond als blauw. GPR161 positieve cilia worden waargenomen in controlecellen aan de linkerkant, en hongerige cellen aan de rechterkant. Zoals te zien is in deze vergrote weergaven.

De witte pijlen en pijltjes geven respectievelijk GPR161 positieve en negatieve cilia aan. Deze afbeelding toont kwantificering van ARL13B positieve geciliaerde cellen. De kwantificering wordt uitgevoerd vanuit twee gezichtsvelden, elk van twee technische replica's van een enkel experiment.

De percentage ARL13B positieve geciliaerde cellen neemt toe bij honger. Deze afbeelding toont kwantificering van GPR161 lokalisatie in ARL13B positieve cilia in controle en hongerige cellen. Het percentage GPR161 lokalisatie in ARL13B positieve cilia, neemt ook toe bij honger.

Eenmaal beheerst kan deze techniek in minder dan twee uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure kan een andere methode voor het kweken van primaire tumorafgeleide cellen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de rol van cilia in tumorgenese. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geopend voor onderzoekers op het gebied van primaire cilia om ciliaire biogenes