Het schalen van Engineered Vascular Enten Met behulp van 3D-Gedrukt Gidsen en de Ring Stapelen Method

Het algemene doel van deze methode is om robuust en consistent geconstrueerde bloedvaten van elke grootte te genereren. Deze techniek maakt het betrouwbaar en effectief ontwerpen van bloedvaten mogelijk. Het grote voordeel van deze techniek is dat bloedvaten van elke grootte eenvoudig en betrouwbaar kunnen worden vervaardigd.

We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we het hadden over hoe we een buisvormig weefsel konden ontwerpen en onze methode vergeleken met het bouwen van tunnels voor wegen, één segment per keer. Om de 3D-geprinte inzetstukken voor te bereiden, voegt u eerst een dunne laag van twee, vier of zes ml ongevuld siliconen toe aan de bodem van respectievelijk een 35, 60 of 100 millimeter Petri-schaal. Om palen voor de 35 mm platen te maken, giet u PDMS in een andere 100 mm plaat tot een hoogte van zeven mm en verwarm de PDMS op een hotplate bij 60 graden Celsius gedurende twee tot drie uur.

Wanneer de PDMS is uitgehard, gebruikt u een biopsiepons van vijf mm om cilindrische palen te maken. Gebruik een kleine hoeveelheid ongevulde PDMS om de cilinders in het midden van elke 35 mm plaat te bevestigen. Plaats een 3D-geprinte buitenschaal van ongeveer 66,7 mm in diameter op gelijke afstand van de paal in de 100 mm platen.

Voordat de PDMS op de bodem van de 60 en 100 mm platen is uitgehard, plaatst u palen van 10 en 20 mm diameter centraal in elke 60 en 100 mm plaat. Laat de schalen gedurende twee tot drie uur op een hotplate van 60 graden Celsius in de open lucht uitharden, gevolgd door achttien uur polymeerdegassing. Aan het einde van de degassing steriliseert u de binnenkant van alle platen met 70%ethanol en bedekt u elke plaat gedurende 30 minuten.

Zuig vervolgens zorgvuldig het ethanol uit elke plaat om luchtdroging mogelijk te maken. Wanneer de platen droog zijn, brengt u ze over in een biologisch veiligheidskabinet naast hun bijbehorende, met de achterkant naar boven, deksels en stelt u de materialen bloot aan UV-licht gedurende 30 minuten om de sterilisatie te voltooien.

Om de fibrinehydrogel voor te bereiden, voegt u eerst 0,5, 1,1 en 1,81 ml groeimedium, aangevuld met fibrinegel en TGF Beta 1, toe aan respectievelijk 35, 60 en 100 mm kweekschalen. Voeg vervolgens 40, 88,4 en 145 microliters trombine toe aan de 35, 60 en 100 mm platen en slinger elke plaat voorzichtig met de hand. Wanneer de trombine gelijkmatig is verdeeld, voegt u 160, 354 en 580 microliters fibrinogeen toe met een druppelsgewijze cirkelvormige beweging in het trombine-mediummengsel in de 35, 60 en 100 mm platen en slinger de platen voorzichtig om het hydrogel gelijkmatig te verdelen.

Laat het hydrogel gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur uitharden. Trypsiniseer vervolgens de gladde spiercellen van belang, uitgebreid in 150 mm celkweekplaten, en verzamel de afgescheiden cellen door middel van centrifugatie. Suspensieer de pellets opnieuw in drie ml differentiatiemedium en gebruik een pipet van twee ml om de cellen krachtig te trituren om eventuele celklompjes te breken.

Na het tellen, verdeelt u de cellen in 2/10 10 tot de 6e, 1/10 10 tot de 7e en 1,4 x 10 tot de 7e cellen per ml aliquoten in 50 ml kegelbuisjes, gelabeld volgens hun bijbehorende kweekplaten. Voeg differentiatiemedium toe aan elke buis om uiteindelijke zaaivolumes van twee, vier en vijf ml voor elke 35, 60 en 100 mm plaat te verkrijgen. Voeg vervolgens voorzichtig de celoplossingen druppelsgewijs toe aan het voorbereide hydrogel in elke bijbehorende plaat voor expansie in de celkweekincubator. Na twee tot vier dagen zullen de ringen zich volledig hebben samengetrokken naar hun palen toe.

Voeg vervolgens 10, 20 of 35 ml TGF Beta 1 toe aan elke 35, 60 en 100 mm ring. Om de vasculaire constructie voor het 35 mm vat samen te stellen, snijdt u een twee inch sectie van de bovenkant van een 50 ml polycarbonaat kegelbuisje en lijmt u de bovenrand met PDMS in een 35 mm plaat om een hoge plaat voor het stapelen van ringen te maken. Voor de 60 en 100 mm vat hoge ring stapelen platen snijdt u een polycarbonaat buis van 1,75 inch diameter in lengterichting in 2,5 inch secties om als de hoge plaatwanden te dienen.

Voor de onderkanten van de hoge platen snijdt u een polycarbonaat plaat van 0,125 inch dikte in cirkelstukken van twee inch diameter. Bindt u de polycarbonaat buissecties met acrylische oplosmiddellijm aan de cirkelvormige stukken. Druk 5, 10 en 20 mm diameter posten met een lengte van 50 mm af.

Voeg vervolgens 10 ml ongevuld siliconen toe aan elke container en plaats elke 3D-geprinte paal centraal in elke 35, 60 en 100 mm container voordat de PDMS volledig is uitgehard. Plaats de schalen vervolgens gedurende twee tot drie uur op een hotplate van 60 graden Celsius. Wanneer de PDMS is uitgehard, steriliseert u de platen met 70%ethanol zoals zojuist is gedemonstreerd, gevolgd door blootstelling van de gedroogde ethanol gesteriliseerde containers aan UV-licht gedurende 30 minuten.

Gebruik nu twee paar zeer fijne pincetten om voorzichtig eerst de ene kant en vervolgens de andere kant van een strak opgerolde gladde spierhydrogelring van zijn paal te tillen. Schuif vervolgens voorzichtig een kant van de ring en vervolgens de andere kant op de hoge paal van de overeenkomstige volgende grotere container. Werkend in een cirkelvormige beweging, met zachte geleidelijke bewegingen, duwt u de ring langzaam over de paal, en stapelt vervolgens extra weefselringen totdat de gewenste vaatlengte is verkregen.