Name: Evaluatie van intracellulaire locatie van reactieve zuurstof soorten in Solea Senegalensis Spermatozoa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer de intracellulaire lokalisatie van reactieve zuurstofsoorten in Solea senegalensis spermatozoa met behulp van confocale microscopie en fluorescente kleuring. Deze methode helpt onderzoekers bij het beoordelen van oxidatieve stress.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Dit werk werd financieel ondersteund door AGL201568330 + C2 + 1 + R project (MINECO/FEDER). David G. Valcarce werd gefinancierd door de Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) en Fondo sociale Europeo. Auteurs erkennen Dr. Ana Riaza en Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero en José Ramón Guiérrez. Wij danken ook Paula Fernández Colado voor videografie.

Opmerking: Fluorescerende incubatie en confocal analyse zal duren ten minste 2-3 uur voor een besturingselement en een behandelde monster. Verwerking van gegevens is niet opgenomen in de berekening van deze tijd. Benodigde materialen kunnen worden gevonden in de Tabel van materialen. Dit protocol kan worden toegepast op vers of cryopreserved spermacellen. Solea senegalensis is een vissoort die in koud water, werk altijd onder koude omstandigheden (4-7 ° C paait). Zie afbeelding 1 voor een algemeen beeld van het protocol.
1. voorbereidende werkzaamheden voor het Experiment
<ol><li>Bereiden een 1 mM mitochondriën vlek stockoplossing in p.a. DMSO.</li>
	<li>Bereiden een 1 μg/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI) stockoplossing in gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Bereid een 200 mOsm/kg Ringer-oplossing (116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.7)</li>
	<li>Bereiden een 4 mM 2′, 7-dichlorodihydrofluorescein DIACETAAT (DCFH-DA) voorraad oplossing in methanol p.a.. Opmerking: Houd de voorraadoplossingen in aliquots bij-20 ° C totdat het nodig is.</li>
	<li>Instellen van de microcentrifuge bij 4-7 ° C.</li>
</ol>2. monstervoorbereiding voordat fluorescerende incubatie
Opmerking: Zachte behandeling van spermatozoïden is wenselijk wanneer pipetting en resuspending.
<ol><li>Als u werkt met cryopreserved cellen, voorbereiden op een waterbad ontdooien bij 40 ° C voor Solea senegalensis spermacellen10. Dompel de stro monsters in het waterbad voor 7 s.</li>
	<li>Met behulp van schaar te knippen, het leegmaken van het monster in een microfuge buis samen en centrifugeer bij 1000 x g, 4-7 ° C gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Rudimentaire plasma of rudimentaire plasma met cryoprotectant uit het cryopreserved monster verwijderen door pipetteren om te negeren van elke component die met het protocol van de kleuring interfereren kan.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in de 50-100 μl van 4 ° C 200 mOsm/kg Ringer-oplossing.</li>
	<li>Bepaal de concentratie sperma met een Neubauer of een soortgelijk tellen kamer onder een stereoscopische Microscoop.</li>
	<li>Verdun de celsuspensie van 1-2 x 106 cellen/mL in een eindvolume van 0,5 mL in 4 ° C Ringer-oplossing.</li>
</ol>3. fluorescerende incubatie
Opmerking: Fluorochromes moet worden omgegaan in omstandigheden met weinig licht, vooral wanneer in oplossing.
<ol><li>Toevoegen van 3.125 μL van DCFH-DA-stockoplossing (eindconcentratie in de steekproef: 25 μM) tot de werkverdunning monster. Incubeer bij 4-7 ° C gedurende 40 min. in duisternis10.</li>
	<li>Na 30 min, Voeg 0,5 μL van de DAPI-stockoplossing (eindconcentratie in de steekproef: 2 μM) en 0,5 μL van de mitochondriën vlek stockoplossing (eindconcentratie in de steekproef: 100 nM) aan het monster. Incubeer beide fluorochromes gedurende 10 minuten in de duisternis.</li>
</ol>4. monstervoorbereiding voor confocale microscopie
<ol><li>Centrifugeer de celsuspensie bij 1000 x g, 4-7 ° C gedurende 1 minuut na de incubatietijd.</li>
	<li>Verwijder het supernatant zorgvuldig door pipetteren.</li>
	<li>Het toevoegen van een 10-20 μL van 200 mOsm/kg Ringer-oplossing.</li>
	<li>Plaats 5 μl van een geconcentreerde celsuspensie op een dia neerzet.</li>
	<li>Zorgvuldig, zet een deksel dia over de voorbereiding en zegel met lak. Zodra de Poolse droog is, is de voorbereiding is klaar voor confocale microscopie.</li>
</ol>5. confocal Setup voorafgaand aan het Experiment
Opmerking: Afhankelijk van de Microscoop, DCFH-DA kon worden "verbrand". Eerst bij het vaststellen van de beste voorwaarden met een niet-waardevolle steekproef.
<ol><li>Inschakelen van de Microscoop, lasers, camera en de computer met de Microscoop.</li>
	<li>Excitatie lasers, rekening houdend met de excitatie en emissie-maxima voor elke fluorescerende instellen<ol>
<li>Gebruik voor de DAPI, een maximum van de excitatie van 358 nm en een maximum emissie van 465 nm.</li>
		<li>Gebruik voor de mitochondriale vlek, een maximum van de excitatie van 644 nm en een maximum emissie van 662 nm.</li>
		<li>Voor DCFH-DA, gebruiken een excitatie maximaal 504 nm en een maximum emissie van 525 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aan de slag met 25 X doelstelling te richten op de spermacellen. Kies de DAPI kanaal te richten omdat deze fluorescerende de hoogste intensiteit rapporteert. Zodra de cellen zijn gericht, gebruik een 63 X of 100 X doelstelling voor een grondige evaluatie omdat Solea senegalensis spermacellen grootte ongeveer 2 μm is.</li>
	<li>Voor elk kanaal door het gaatje, de winst en de spanning te optimaliseren. Aanpassen op dezelfde manier, de digitale offset ter vermindering van de achtergrond. Zodra alle parameters zijn geoptimaliseerd voor de fluorescerende gebruikt, moet u de instellingen opslaan. Voor een routine experiment voor een enkele zaadcel Solea senegalensis gebruikten we de volgende (deze parameters kunnen veranderen in elk experiment): gaatje van 1 en de spanning van de winst van 750 V.</li>
</ol>6. verwerving van beelden
<ol><li>Selecteer de gewenste kwaliteit criteria voor de verwerving van de afbeelding. Overname-instellingen zoals bitdiepte, beeldformaat, lichte plaatdikte definiëren en kies één dubbelzijdige verlichting. Voor een routine experiment voor een enkele Solea senegalensis spermacellen gebruikten we de volgende (deze parameters kunnen veranderen in elk experiment): framegrootte van 1024 px; bits per pixel van 16; Scansnelheid voor 2-4).</li>
	<li>Open en centreer het scangebied om te beginnen en een afbeelding van het veld.</li>
	<li>Met behulp van het gereedschap Uitsnijden, selecteer de regio van belang en druk leven.</li>
	<li>Aanpassen met behulp van het hulpprogramma bereik indicator, de digitale offset ter vermindering van de achtergrond. Doe dit voor elk kanaal en het beeld te nemen.</li>
	<li>Controleer de kwaliteit van de afzonderlijke kanalen voor elke fluorescerende en combinaties daarvan.</li>
</ol>7. het maken van een 3D-beeld-Video
<ol><li>Z-stack overname-instellingen.<ol>
<li>Kies de optie van de Z-stack in de software.</li>
		<li>Selecteer een enkele cel, de groep cellen of de regio van belang en richten.</li>
		<li>Scheiden van de Z-stapel met de opties 'Eerste segment' en 'Laatste Slice' en de z-stap interval tot 0,2 µm met behulp van de fijne focus te zetten. Kies DAPI kanaal te richten omdat deze fluorescerende de hoogste intensiteit melden kan en u gemakkelijk het hele hoofd van de spermacellen kunt. Kies de optimale overname parameters voor elk kanaal en voer het experiment uit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer het experiment Z-stack. De kanalen splitsen en observeren van de lokalisatie van elk signaal binnen de cellen.</li>
	<li>Z-stapel proces.<ol>
<li>Volume render: zodra het experiment is voltooid, selecteert u de opties van de Z-stapel verwerking software en kies het volume renderen optie. Selecteer het aantal stappen en de rotatie graden (360°). Sla het bestand met de extensie video.</li>
		<li>Stereo anaglyph: Kies stereo anaglyph in de opties proces venster. Deze tool laat maken van een 3D-beeld video met kanalen splitsen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li>
<li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li>
<li>Gürler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability%2C+synthesis+of+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+damage+of+bovine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383(2015).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li>
<li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li>
<li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation%2C+intracellular+hydrogen+peroxide%2C+and+DNA+integrity+in+canine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li>
<li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li>
<li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li>
<li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li>
<li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li>
<li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0044848614002105">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het is algemeen bekend dat mitochondriën belangrijke organellen voor de beweeglijkheid van de zaadcellen en functie zijn. Deze organellen zijn gelijktijdig direct betrokken bij de productie van ROS. Interessant, zijn gecontroleerde niveaus van ROS nodig voor goede zaadcellen functie1. Positieve relaties tussen vruchtbaarheid en oxidatieve stress zijn aangetoond in zoogdieren11 maar buitensporige niveaus beïnvloeden sperma kwaliteit12. Een cruciale fa...

De productie van reactieve zuurstof soorten is in verband gebracht met de kwaliteit van het sperma onlangs1. Hoewel ROS productie in mitochondriën kan worden beschouwd als een normale fysiologische proces, is oxidatieve stress door een overmaat aan ROS productie een duidelijke oorzaak van de schade in spermacellen op verschillende niveaus. Bij de mens wordt oxidatieve stress geassocieerd met mannelijke infertiliteit, wijzigen van de beweeglijkheid en de mogelijkheid om het ondergaan van de rechtsbevoegdheid2; bij zoogdieren, heeft verandering van DNA integriteit in ingevroren sperma monsters ook verband met de synthese van H2O23.
Cryopreservatie is een gemeenschappelijke techniek voor gen bankbedrijf in de aquacultuur. Deze technologie is met name belangrijk in soorten met vruchtbaarheidsproblemen zoals Solea senegalensis. Deze waardevolle soorten op de markt toont reproductieve dysfunctie in individuen geboren in gevangenschap als gevolg van een gebrek aan verkering. Dit feit maakt sperma cryopreservatie noodzakelijk dat sperma beschikbaarheid voor kunstmatige bevruchting. Cryopreservatie zou echter een bron van oxidatieve stress die schadelijk voor spermacellen4 zou kunnen zijn, zoals studies hebben een gunstig effect van antioxidant suppletie gemeld. ROS remming door middel van mitochondriale-gerichte antioxidant was naar verluidt gunstig voor sperma cryopreservatie in gele meerval5.
De niveaus van ROS in spermastaaltje zijn daarom belangrijk om te weten, vooral na cryopreservatie6,7 , omdat deze moleculen zijn erkend als een nadeel voor zaadcellen overleven en vruchtbaarheid8. Bovendien, het bestuderen van de verdeling van de ROS binnen de cel kan doorslaggevend zijn voor afleiden van het niveau van de potentiële schade. Als voorbeeld, lage niveaus van ROS in de mitochondriën kunnen worden aangenomen, normale en compatibel met sperma functie, maar hoge niveaus van ROS binnen de kern zou indicatoren van de schade van DNA van spermacellen. H2O2 is een van de meest relevante ROS die kunnen vrijkomen uit de mitochondriën en het doordringen van de kern, want het is een kleine en lading-minder molecuul9. Dichlorofluorescein DIACETAAT (DCFH-DA) kan specifiek intracellulaire peroxide uitstoten groene fluorescentie onthullen. In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol voor het opsporen van H2O2 intracellulaire lokalisatie in Solea senegalensis sperma met behulp van de confocal microscopie gepresenteerd.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscopy</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Dekselglaasjes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Analysekwaliteit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, Analysekwaliteit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MitoTrackerDeep Red&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge (gekoeld)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neubauerkamer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717810</td><td></td></tr><tr><td>Glijbanen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10143562BEF</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluatie van intracellulaire locatie van reactieve zuurstof soorten in solea senegalensis spermatozoa

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Oxidatieve stress is één van de belangrijkste factoren in het verminderen van de kwaliteit van het sperma. Het ontwikkelen van efficiënte protocollen voor het opsporen van reactieve zuurstof soorten (ROS) in spermacellen is van groot belang in alle soorten, maar deze methoden zijn zelden gebruikte en nog minder in teleost. Cryopreservatie is een nuttige techniek in de aquacultuur voor verschillende doeleinden, met inbegrip van gene bancaire en gegarandeerde sperma beschikbaarheid gedurende het hele jaar. Invriezen/ontdooien procedures kunnen veroorzaken ROS productie en schadelijk voor de zaadcellen. Gezien de potentiële die schade zou kunnen een overmaat van ROS productie veroorzaken bij spermacellen afhankelijk van hun lokalisatie, hier een gedetailleerde methodologie te detecteren H2O2 en te evalueren van de intracellulaire lokalisatie door confocale microscopie wordt verstrekt. Voor dit doel, een combinatie van 3 fluorochromes (2′, 7-Dichlorodihydrofluorescein DIACETAAT (DCFH-DA), een live mitochondriën vlek en 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI)) worden gebruikt om te evalueren van de co lokalisatie van H2O2 met spermacellen kernen of mitochondriën in Solea senegalesis spermastaaltje.

Confocale microscopie is een ideale methode voor intracellulaire ROS beoordeling in teleost sperma. De combinatie van de drie fluorochromes (DAPI mitochondriën vlek en een DCFH-DA) gepresenteerd in deze studie (Figuur 1) biedt veel nuttige informatie die kan worden toegepast bij het basisonderzoek en kan hebben toepassingen in de verbetering van de methoden die worden toegepast in industriële aquacultuur planten, zoals cryopreservatie protocollen. Verschillen...

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methodologie voor het opsporen van H2O2 localisatie binnen Solea senegalensis spermacellen met behulp van een gevoelige fluorescerende DCFH-DA ROS, een levende mitochondriën vlek voor mitochondria en DAPI voor kernen visualisatie, respectievelijk. Het protocol is ontworpen om te worden uitgevoerd binnen de 2 uur met verse of ontdooide spermacellen.

Evaluatie van intracellulaire locatie van reactieve zuurstof soorten in Solea Senegalensis Spermatozoa

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Het algemene doel van dit experiment is om met behulp van confocale microscopie de intracellulaire lokalisatie van reactieve zuurstofverbindingen in spermatozoa van Solea senegalensis te evalueren. Reactieve zuurstofverbindingen hebben invloed op de effectieve spermafunctie en veroorzaken cellulaire schade op verschillende niveaus. Spermatozoa kunnen bijzonder gevoelig zijn voor oxidatieve stress, aangezien lipideperoxidatie een negatief effect kan hebben op de motiliteit en bevruchting.Reactieve zuurstofsoorten kunnen zelfs een intrinsieke apoptotische cascade triggeren. Peroxide wordt vrijgelaten uit de mitochondriën en kan, vanwege het feit dat het een klein, ongeladen molecuul is, de kern binnendringen en het DNA beïnvloeden. In dit protocol gebruiken we een fluorofoor die, na opname in de cel, door een oxidatieve reactie kan worden gemodificeerd, waarbij groene fluorescentie wordt uitgezonden.Hierdoor kunt u de exacte lokalisatie van reactieve zuurstofspecies bepalen. In deze video werken we met spermatozoa van Solea senegalensis, maar u kunt dit protocol ook toepassen bij verwante soorten met commercieel belang, of bij moeders zoals Sibrifis of Mirica. Enkele voorbeelden van het gebruik van deze techniek in de fysiek-reactieve biologie of in de imkerij zijn.De evaluatie van cryoprecipitatie volgens de protocollen. De vergelijking van labels voor reactieve zuurstofspecies vóór en na deze sperma-activatie. Of u kunt de labels voor reactieve zuurstofspecies correleren met goede en slechte ademhalers.Bereid eerst de voorraadoplossingen van uw fluorochromen voor. Houd er rekening mee dat u de manipulatie van fluorochromen moet uitvoeren volgens de aanbevelingen van het veiligheidsinformatieblad. Er dient bijzondere zorg te worden betracht bij het wegen en bereiden van de voorraadoplossingen.Bewaar de stamoplossingen in aliquots bij -20 °C tot gebruik. In dit protocol gebruiken we drie fluorochromen. De ver-rode fluorescerende kleurstof kleurt mitochondriën in levende cellen en kan worden gebruikt voor mitochondriale lokalisatie.DAPI is een veelgebruikte sonde in fluorescentiemicroscopie voor DNA-kleuring. Het bindt sterk aan adenine-thymine-rijke regio's in DNA. Daarnaast is 27-dichloorfluoresceïne-diacetaat een celpermeabele, niet-fluorescerende sonde.Het wordt intracellulair gede-esterificeerd en verandert na oxidatie in het sterk fluorescente 27-dichloorfluoresceïne. Dit protocol kan worden gestart met verse of cryogeperserveerde spermatozoa. In dit geval hebben we een cryogeperserveerd monster gebruikt.Bereid een bad voor om te ontdooien bij 40 °C. Reinig het materiaal. Selecteer, met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, uw cryogebewaarde rietje.Dompel het rietje zeven seconden lang in het bad. Giet het ontdooide monster met een schaar in een microcentrifugebuis. Werk altijd bij vier graden Celsius.Centrifugeer het monster gedurende één minuut. Verwijder voorzichtig de cryoprotectantia zonder de gepelletteerde sowels te beïnvloeden. Resuspendeer in een klein volume van 50 of 100 µL RINGA-oplossing.Breng een verdunning van uw cel-suspensie over in een nieuwe bower of een soortgelijke telkamer en tel de cellen. Bereken de concentratie van de monsteroplossing. Verdun de cel-suspensie tot één tot twee miljoen cellen per millimeter in een eindvolume van 0,5 milliliters in vooraf gekoelde RINGA-oplossing.De spermatozoïa moeten voorzichtig worden behandeld tijdens het pipetteren en resuspenderen. Voeg 3,125 µL van de dichlorofluoresceïne-diacetaat-stamoplossing toe aan de werkoplossing van het monster. De uiteindelijke concentratie in het monster is 25 µM.Incubeer gedurende 40 minuten bij vier tot zeven graden Celsius. Voeg na 30 minuten 0,5 µL van de DAPI-stomaoplossing en 0,5 µL van de mitochondria-kleuringsstomaoplossing toe aan het monster. Beide fluorochromen hebben een incubatietijd van 10 minuten.Plaats een druppel van 5 µL geconcentreerde cel-suspensie op een objectglas. Plaats voorzichtig een dekglas op het preparaat en verzegel dit. Zet het apparaat aan en selecteer het objectief met 100-voudige vergroting in het bedieningspaneel.Lokaliseer het monster in de microscoop en zet de lamp aan. De systeemsoftware maakt het mogelijk om de benodigde fluorochromen rechtstreeks uit een lijst te selecteren. Kies de set.DAPI, met een emissiemaximum van 465 nanometers, MitoTracker Deep Red met een emissiemaximum van 662 nanometers, en DCF met een emissiemaximum van 525 nanometers. Richt de lichtbundel naar de oculairs. Stel scherp op een gebied van interesse.Keer terug naar de software en selecteer de framegrootte. Stel de bidirectionele scanmodus in voor een betere resolutie. Kies de gewenste scansnelheid.Open en centreer het scangebied om te beginnen. Maak een opname van het veld. Selecteer met de bijsnijtool het gebied van interesse en druk op Live.Vervolgens heeft u uw werkgebied geselecteerd. Pas met behulp van de bereikindicator de digitale offset aan om de achtergrond te verminderen. Doe dit voor elk kanaal en maak uw opname.Dit is een voorbeeld van de resultaten. Voor een samengevoegde afbeelding, individuele kanalen voor elk fluorochroom en hun combinaties. Dit is een labelingsschema van een zaadcel van Solea senegalensis.Na het bekijken van de verkregen beelden is waarneembaar dat DAPI en MitoTracker, zoals verwacht, respectievelijk in de nucleus en de mitochondriale ring gelokaliseerd zijn. De eerste stap is het uitvoeren van een z-stack experiment. Ga naar het z-stack venster en selecteer met behulp van de fijnfocus de eerste en de laatste acquisitiepositie.Kies de optimale acquisitieparameters en voer het experiment uit. U krijgt beelden voor elke slide. Dit is een voorbeeld van een z-stack resultaat.U kunt de kanalen splitsen en de locatie van elk signaal binnen de cellen observeren. In het 3D-venster kunt u verschillende grafiekopties selecteren. U kunt veel parameters aanpassen, en kanalen splitsen en samenvoegen.Dit is een voorbeeld van 3D-weergaven die verschillende patronen laten zien van de lokalisatie van reactieve zuurstofverbindingen binnen de sperma van Solea senegalensis. In het bovenste veld is DCF hoofdzakelijk gecolokaliseerd met mitochondriën; terwijl in het veld daaronder het signaal is uitgebreid tot de nucleus. Na het bekijken van deze video weet u hoe u de intracellulaire lokalisatie van peroxiden in deze spermatozoën kunt evalueren met behulp van confocale microscopie.U vindt adviezen voor het oplossen van problemen en overige informatie in de tekst.

evaluation-intracellular-location-reactive-oxygen-species-solea

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We aangepast een reeks protocollen voor de meting van reactive oxygen species (ROS) die in verschillende amoebe en zoogdieren cellulaire modellen kan worden toegepast voor de kwalitatieve en kwantitatieve studies.

Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Hier rapporteren we een protocol om oxidatieve stress in levende zebravisembryo's te meten. Deze procedure maakt de detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) mogelijk in zowel volledige embryoweefsels als enkele-celpopulaties. Dit protocol zal zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses mogelijk maken.

Analyse van oxidatieve stress in zebravis embryo&#39;s

Elektron paramagnetisch resonantie (EPR) spectroscopie is een eenduidige methode voor het meten van vrije radicalen. Het gebruik van selectieve spin sondes zorgt voor detectie van vrije radicalen in andere cellulaire compartimenten. Presenteren we een praktische, efficiënte methode voor het verzamelen van biologische monsters die behandeling, opslaan en overzetten van monsters voor EPR metingen te vergemakkelijken.

Gebruik van Electron paramagnetisch resonantie in biologische monsters bij kamertemperatuur en 77 K

Hier presenteren we methodologieën voor evaluatie van spermatozoan membraan integriteit, een cellulaire functie sperma bevruchting bevoegdheid is gekoppeld. We beschrijven drie technieken voor de beoordeling van de fluorimetrische van sperma membranen: gelijktijdige kleuring met specifieke fluorescerende sondes, fluorescentie microscopie en geavanceerde sperma-dedicated stroom cytometry. Voorbeelden van het combineren van de methoden worden ook gepresenteerd.

Fluorimetrische technieken voor de beoordeling van sperma membranen

Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.

Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Escherichia coli is de belangrijkste oorzaak van neonatale gramnegatieve bacteriële meningitis. Tijdens de bacteriële infectie spelen reactieve zuurstofsoorten geproduceerd door neutrofielen een belangrijke bacteriedodende rol. Hier introduceren we een methode om de reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen te detecteren als reactie op meningitis E. coli.

Real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische Escherichia Coli

Hier stellen we een gesystematiseerd, toegankelijk en reproduceerbaar protocol voor om cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in Müller gliacellen (MGC's). Deze methode kwantificeert de totale cellulaire ROS-niveaus met een flowcytometer. Dit protocol is zeer eenvoudig te gebruiken, geschikt en reproduceerbaar.

Kwantificering van reactieve zuurstofsoorten met behulp van 2′,7′-dichlorofluoresceïnediacetaatsonde en flowcytometrie in Müller-gliacellen

De analyse van de mitochondriale functie van sperma door middel van respirometrie met hoge resolutie maakt het mogelijk om het zuurstofverbruik van vrij bewegende spermatozoa in een gesloten kamersysteem te meten. De techniek kan worden toegepast om de ademhaling in menselijke spermatozoa te meten, wat informatie geeft over de mitochondriale kenmerken en integriteit van sperma.

Respirometrie met hoge resolutie om de mitochondriale functie in menselijke spermatozoa te beoordelen

Dit artikel presenteert een economisch en efficiënt protocol voor het onderzoeken van peroxidase-positieve leukocyten in sperma. Met behulp van een computerondersteund sperma-analysesysteem (CASA) kan de concentratie van peroxidase-positieve leukocyten in sperma binnen een totaal van 60 minuten worden verkregen, waardoor de efficiëntie van andrologielaboratoria en andrologen effectief wordt verbeterd.

Het onderzoek van peroxidase-positieve leukocyten in sperma

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren met behulp van dihydroethidium (DHE) als fluorescentiekleurstofsonde met behulp van een high-throughput screeningbenadering. Het protocol beschrijft de methoden voor kwantitatieve beoordeling van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de drie verschillende hepatocellulaire carcinoomcellijnen.

High Throughput Screening Assessment van het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof

Leer de intracellulaire lokalisatie van reactieve zuurstofsoorten in Solea senegalensis spermatozoa met behulp van confocale microscopie en fluorescente kleuring. Deze methode helpt onderzoekers bij het beoordelen van oxidatieve stress.

Evaluatie van intracellulaire locatie van reactieve zuurstof soorten in Solea Senegalensis Spermatozoa

Meer video's verkennen