Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie
17 april 2018
Hier beschrijven we een chromatografische test in combinatie met de ion mobiliteit scheiding van peptide precursoren gevolgd door de hoge resolutie (~ 30.000) MS-detectie van peptide fragmenten voor de kwantificering van puntige peptide normen in een monoclonal antilichaam Digest.
Het algemene doel van de HS-MRM-test is om het MRM-interferentiefenomeen te verminderen dat de kwantificering van peptiden of eiwitten beïnvloedt door ionmobiliteitsscheiding van peptide-precursoren te combineren met hoogwaardige massaspectrometrische detectie van fragment-ionen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van biotherapeutische karakterisering, evenals kwantificering van eiwit- of peptide-biomarkers en kwantitatieve proteomics. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de detectie mogelijk maakt van laag-abundantie gastheercel-eiwitten die mogelijk aanwezig zijn in biofarmaceutische eiwitten.
Klik eerst op 'analysemethode maken' in de data-acquisitiesoftware en kies voor 'genereren en verwerven en verwerken methode'. Typ de methodenaam en beschrijving, blader naar de methodemap en klik op volgende. Kies voor analysetype peptide map IMS en klik op volgende.
Selecteer vervolgens de huidige systeeminstellingen en klik op volgende en voltooien. Klik in de nieuw gemaakte methode op het instrumententabblad, selecteer de binaire oplosmiddelmanager en bewerk de gradiëntinstellingen om peptidescheiding bij een stroomsnelheid van 0,2 milliliter per minuut te bereiken. Gebruik een gradiëntverdunning van één tot 40% oplosmiddel B in 30 minuten, gevolgd door een twee-minuten kolomwas en een 10-minuten evenwicht met een totale looptijd van 45 minuten.
Selecteer vervolgens de monstersmanager en stel de monstertemperatuur in op 10 graden Celsius en de kolomtemperatuur op 60 graden Celsius. Selecteer in het instrumententabblad het Vion IMS QTof-instrument. Selecteer in het instellingengedeelte gevoeligheid voor analyzeerdermodus en voer drie kilovolt in voor capillaire spanning, 100 graden Celsius voor brontemperatuur, 250 graden Celsius voor ontbindingstemperatuur, 50 liter per uur voor kegelgasstroom en 500 liter per uur voor ontbindingsgasstroom.
Klik op het experimenttabblad en selecteer high definition MSE voor modus. Voer vervolgens 100 in voor laag massa, 2000 voor hoog massa en 0,4 seconden voor scantijd. Typ in het sectie botsingsenergie zes elektronvolt voor de laag energie-instelling en kies een hoge energie-oploop van 15 tot 40 elektronvolt.
Voor de verwervingstijd gebruikt u een aangepaste looptijd tussen vijf en 30 minuten. Klik vervolgens op het optiestabblad en selecteer de automatische vergrendelingscorrectiemodus met een automatische vergrendelingscorrectie-interval van vijf minuten. Selecteer vervolgens de optie doorgaan met vergrendelingscorrectie en om ervoor te zorgen dat de automatische detectorcontrole is uitgeschakeld.
Selecteer in het huidige systeemconfiguratiemenu het Vion IMS QTof-instrument en klik op gereedschappen. Voer drie kilovolt in voor capillaire spanning, 40 volt voor bemonsteringskegel, 100 volt voor bronoffset, 100 graden Celsius voor brontemperatuur, 250 graden Celsius voor ontbindingstemperatuur, 50 liter per uur voor kegelgasstroom, 500 liter per uur voor ontbindingsgasstroom en drie kilovolt voor referentie capillaire spanning. Analyseer een eerder bereide 10 nanomolaire faux gespikte monster met behulp van de LC-HDMSE-test zojuist beschreven door 10 microliter monster in het instrument te injecteren.
De individuele sequenties van zes phosphorylase B-peptidestandaarden die in de faux-peptidemixtuur zijn opgenomen, worden hier samen met hun retentietijden en hun meest abundant voorkomende precursors die in het HDMSE-experiment zijn waargenomen, getoond. De HDMSE-spectra die zijn verkregen voor een van de faux-peptiden die zijn gespikt in de Infliximab-digest, worden hier weergegeven. Klik in de data-acquisitiesoftware op 'analysemethode maken' en kies voor 'genereren en verwerven en verwerken methode'.
Typ de methodenaam en beschrijving, blader naar de methodemap en klik op volgende. Kies voor analysetype kwantificeren, selecteer Quantify Assay Tof 2D Chromatographic en klik op volgende. Selecteer vervolgens de huidige systeeminstellingen en klik op volgende en voltooien.
Klik in het nieuw gemaakte methode op het instrumententabblad. Selecteer de binaire oplosmiddelmanager en bewerk de gradiëntinstellingen om peptidescheiding bij een stroomsnelheid van 0,2 milliliter per minuut te bereiken. Gebruik gradiëntverdunning van één tot 40% oplosmiddel B in 30 minuten, gevolgd door een twee-minuten kolomwas en een 10-minuten evenwicht met een totale looptijd van 45 minuten.
Selecteer in het instrumententabblad de monstersmanager en stel de monstertemperatuur in op 10 graden Celsius en de kolomtemperatuur op 60 graden Celsius. Selecteer nu het Vion IMS QTof-instrument en selecteer in het instellingengedeelte gevoeligheid voor analyzeerdermodus. Typ vervolgens drie kilovolt voor capillaire spanning, 100 graden Celsius voor brontemperatuur, 250 graden Celsius voor ontbindingstemperatuur, 50 liter per uur voor kegelgasstroom en 500 liter per uur voor ontbindingsgasstroom.
Klik op het experimenttabblad en voor experimenttype kies functietabel één of meer MS, MSMS of MRM-functies. Verwijder de standaardverwervingsfunctie, klik op toevoegen plus MRM en bewerk de retentie-vensterparameters in het looptijdgedeelte. Voer in de Tof MRM-functie-editor het masterladingsverhouding van peptide-precursor in, selecteer laag voor precursorresolutie en voer de precursorladingstoestand in.
Voer vervolgens de productmasterladingsverhouding in, 16 elektronvolt voor de startbotsingsenergie, 0,1 seconden voor de vaste scantijd en breed voor de spectrumkolom. Gebruik de knop dupliceren om 10 meer MRM-overgangen toe te voegen en gebruik verschillende botsingsenergiewaarden in het bereik van 18 tot 36 elektronvolt. Nadat de drie beste overgangen voor elk peptide zijn vastgesteld, werd een Tof MRM-experiment uitgevoerd om de optimale botsingsenergie te vinden om de signalen voor elk peptide te maximaliseren.
Stel vervolgens een HS-MRM-methode in die slechts één fragment-ion per peptide bevat. Wijzig de eerder gemaakte Tof MRM-methode door de HS-MRM-functie te selecteren in plaats van de Tof MRM-functie. Voer in de HS-MRM-functie-editor de masterladingsverhouding in, selecteer laag voor precursorresolutie en voer de precursorladingstoestand in.
Voer vervolgens de precursor CCS-waarde in en selecteer laag voor precursor CCS-res
Overzicht
Deze studie presenteert een high-sensitivity multiple reaction monitoring (HS-MRM) assay die ionenmobiliteitsscheiding integreert met massaspectrometrie met hoge resolutie voor peptidekwantificering. De methode is bijzonder nuttig voor het analyseren van laag-abundante gastheercelproteïnen in biofarmaca.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Massaspectrometrie
- Peptidekwantificering
- Karakterisering van biotherapeutica
Achtergrond
- MRM-interferentie kan een nauwkeurige peptidekwantificering belemmeren.
- Ionmobiliteitsseparatie verbetert de detectie van peptideprecursors.
- Hoge-resolutie massaspectrometrie maakt gedetailleerde analyse van peptidefragmenten mogelijk.
- Deze methode biedt een oplossing voor uitdagingen in de kwantitatieve proteomica.
Doel van de studie
- Om een assay te ontwikkelen die MRM-interferentie minimaliseert.
- Om de kwantificering van peptide-biomarkers te vergemakkelijken.
- Om de karakterisering van biotherapeutica te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het creëren van analysemethoden in de software voor gegevensverwerving.
- Gradiëntinstellingen voor peptidescheiding bij gespecificeerde stroomsnelheden.
- Optimalisatie van instrumentparameters voor sensitiviteit en resolutie.
- Uitvoering van HS-MRM-experimenten om de optimale botsingsenergieën te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van gastcelproteïnen met een lage abundantie.
- Demonstratie van effectieve peptide-scheiding en -kwantificering.
- Validatie van de HS-MRM-methode met gespikede peptidestandaarden.
- Acquisitie van massaspectra met een hoge resolutie voor analyse.
Conclusies
- De HS-MRM-assay verbetert de nauwkeurigheid van de peptidekwantificering aanzienlijk.
- Deze methode is toepasbaar voor de karakterisering van biotherapeutica.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek benutten voor bredere proteomische toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Een nauwkeurige kwantificering van gastcelproteïnen (HCP's) bij lage concentraties (1-100 ppm) is essentieel voor het waarborgen van de veiligheid en werkzaamheid van proteïne-biotherapeutica. De HS-MRM-assay pakt een belangrijke analytische uitdaging in de biofarmaceutische ontwikkeling aan door MRM-interferentie te minimaliseren via ionmobiliteitsseparatie en MS-detectie met hoge resolutie. Dit maakt een betrouwbare detectie van laag-abundante onzuiverheden mogelijk, wat risicobeoordelingen en de consistentie tussen batches in de productie ondersteunt.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door sporen van HCP's te detecteren die de productveiligheid of immunogeniciteit kunnen beïnvloeden.
- Operationele waarde: Biedt een gevoelige methode om procesgerelateerde onzuiverheden te monitoren tijdens de vroege selectie van moleculen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve peptide-metingen met een hoge selectiviteit, waardoor fout-positieven door isobare interferenties in complexe digesten worden verminderd.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van assays door een reproduceerbare RSD van het piekareaal <15% over een dynamisch bereik van 3 grootteordes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door HCP-profielen te koppelen aan potentiële functionele effecten in ziekte-relevante systemen.
- Operationele waarde: Faciliteert translationele continuïteit van discovery tot preklinische fasen door gebruik te maken van een consistent kwantificeringsplatform.
Integratie van Pipeline & Workflow
De HS-MRM-analyse past binnen het continuüm van ontdekking tot prekliniek en ondersteunt vroege onzuiverheidsprofielering, wat bijdraagt aan de selectie van lead-verbindingen en de preklinische veiligheidsbeoordeling.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing mogelijk met betrekking tot de impact van HCP op de productkwaliteit door middel van gevoelige en specifieke detectie van soorten met een lage abundantie.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via kwantitatieve resultaten en een hoge reproduceerbaarheid, wat een betrouwbare vergelijking tussen procescondities mogelijk maakt.
- Analytics: Genereert gegevens over piekoppervlak en retentietijd met een massatolerantie (10 ppm) en CCS-tolerantie (5%) voor nauwkeurige piekintegratie.
- Translational Research: Ondersteunt preklinische continuïteit door consistente HCP-monitoring over verschillende ontwikkelingsstadia mogelijk te maken met behulp van dezelfde analytische methode.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbaar platform voor het monitoren van meerdere HCP's over verschillende batches, waardoor de inspanning voor de herontwikkeling van methoden wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de productkwaliteit door fout-negatieve resultaten bij de detectie van lage concentraties onzuiverheden te minimaliseren.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via gestandaardiseerde LC-IMS-HRMS-workflows.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door nauwkeurige HCP-gegevens vroeg in de ontwikkeling te leveren, waardoor het risico op falen in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van kandidaten mogelijk via kwantificeerbare onzuiverheidsprofielen gekoppeld aan veiligheidsbeoordelingen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de ontwikkeling van LC-IMS-HRMS-methoden en data-analyse voor peptidekwantificering.
- Afhankelijk van Vion IMS QTof-instrumentatie met capaciteit voor ionenmobiliteit en hoge-resolutie MS/MS-acquisitie.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van de monstervoorbereiding, inclusief digestie- en spike-in-protocollen voor HCP's.
- Omvat aanpassingen voor verschillende mAb-achtergronden en HCP-mengsels vanwege potentiële matrixeffecten.
- Beperkt door de behoefte aan surrogaten op peptideniveau en weerspiegelt mogelijk niet de heterogeniteit van intacte HCP's zonder complementaire benaderingen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Setup of the LC/HDMSE (High Definition MSE) Data Acquisition Method
3:59
Setup of the Tof-MRM Method for Collision Energy Optimization and the Final HS-MRM Acquisition Method for Peptide Quantification
7:42
Creation of a Processing Method for the Analysis of the HS-MRM Dataset
9:57
Results: An HS-MRM Assay for Quantification of Host-cell Protein Peptides in a Monoclonal Antibody Digest
10:29
Conclusion
