Name: Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Leer een HS-MRM assay voor kwantificering van gastheercel eiwitten in biofarmaceutica met ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie. Deze methode detecteert laag geconcentreerde eiwitten nauwkeurig.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Lesley Malouin en Tony Catlin van wateren Corporation voor het voorbereiden van figuur 6 van het manuscript.

1. bereiding van de infliximab digest (~ 24 h procedure)
<ol><li>Bereiden van verse oplossingen van 50 mM Ammoniumbicarbonaat, 1% anionogene oppervlakteactieve stof in 50 mM NH4HCO3, 500 mM dithiothreitol (DTT) in 50 mM NH4HCO3en 500 mM iodoacetamide (IAM) in 50 mM NH4HCO3.</li>
	<li>750 µL van 50 mM NH4HCO3, 200 µL van infliximab mAb (10 mg/mL) en 50 µL van 1% anionogene oppervlakteactieve stof-oplossing toevoegen te denatureren van het eiwit gedurende 15 minuten bij 60 ° C in de aanwezigheid van 0,05% anionogene oppervlakteactieve stof.</li>
	<li>Voeg 40 µL van 500 mM DTT en het monster gedurende 60 minuten bij 60 ° C in de aanwezigheid van 20 mM DTT te verminderen.</li>
	<li>Voeg 20 µL van 500 mM IAM en alkylate van het monster gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker in de aanwezigheid van ~ 10 mM IAM.</li>
	<li>De inhoud van de tube microcentrifuge toevoegen aan een glazen ampul met 20 µg MS sequencing-grade Lys C/trypsine en verteren het monster gedurende 3 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Toevoegen van een tweede enzym aliquoot (20 µg) door het verteerd monster te brengen naar een andere glazen ampul met 20 µg MS sequencing-grade Lys C/trypsine en verteren het monster 's nachts (12-15 h) bij 37 ° C.</li>
	<li>Na de overnachting proteolyse, voeg 5 µL van 100% mierenzuur (FA) en de digest gedurende 30 minuten bij 37 ° C te ontleden de zure labile anionogene oppervlakteactieve stof uit te broeden.</li>
	<li>Spin down de digest gedurende 15 minuten bij 4000 x g in een centrifuge neerslaan van het onoplosbare bestanddeel van de anionogene oppervlakteactieve stof.</li>
	<li>~ 1.000 µL van de infliximab digest herstellen en plaats deze in een LC auto-sampler flesje; de digest-concentratie moet ~ 2 mg/mL. De digest opslaan in een diepvriezer op-20 ° C, totdat de LC/MS-systeem klaar voor analyse is.</li>
</ol>2. spiking van peptide normen (~ 30 min)
<ol><li>Ontdooi de infliximab digest door het plaatsen van het bevroren monster in de glazen ampul op een bankje bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg 1 mL 0,1% FA in H2O naar één konijn werkte b (PHO) digest flesje 1-µM stamoplossingen om voor te bereiden alle zes peptide normen uit de PHO in het flesje opgenomen (de flacon bevat 1 nmol van elke peptide).</li>
	<li>Maak 4 x 1 mL van de stockoplossing van PHO om oplossingen met 0,1, 1, 10 en 100 nM peptides, met behulp van 0,1% te bekomen verdunningen FA als het oplosmiddel verdunning. Maak alle verdunningen in glazen flesjes (LC auto-sampler flesjes) en voeg 100 µL van infliximab digest als de matrix van de achtergrond aan alle flesjes. Laden 2 µg digest achtergrond op kolommen met elk 10-µL injectie. Bereiden van een blancomonster waarin de verdunde infliximab digest (het dezelfde 1:10 verdunning), met geen puntige peptiden.</li>
</ol>3. installatie van de LC/HDMS E data acquisitie, methode
Opmerking: De workflow de benodigde stappen voor het instellen van een overname van de HS-MRM samenvatten is afgebeeld in figuur 1 en is beschreven in detail in secties 3-6. De verwerving van een gegevens-onafhankelijke HDMSE -dataset is vereist om de retentietijd van elke gecontroleerde peptide, de bovenliggende m/z van de meest voorkomende peptide ion na electrospray ionisatie, en de bijbehorende CCS (collisional Kruis sectie) is afgeleid van de ion mobiliteit scheiding. Bovendien geeft de gegevens-onafhankelijke dataset informatie over de m/z van de drie meest voorkomende fragment ionen voor elke peptide voorloper. In de tweede stap van de werkstroom (CE optimalisatie), wordt de gevoeligheid van de test verhoogd door de energie van de cel van botsing te verkrijgen van de hoogste intensiteit van het ion voor elk fragment ion tuning. Ten slotte, in de laatste stap, alle parameters die hierboven beschreven worden voorgesteld aan de HS-MRM method editor voor elke peptide gecontroleerd.
<ol><li>LC/MS experimenten uitvoeren op een vierpolige time-of-flight (QTOF) massaspectrometer gekoppeld aan een ultra-prestatie vloeistofchromatografie-systeem met behulp van een overname van gegevens-onafhankelijke methode (HDMSE). Opmerking: Meer details met betrekking tot de configuratie van het instrument zijn opgenomen in het materiële gedeelte. Dit instrument maakt gebruik van een reizende waveapparaat ion mobiliteit voor de scheiding van peptide precursoren10.</li>
	<li>Bereiden van twee mobiele fasen met 0,1% FA in water (oplosmiddel A) en 0,1% FA in acetonitril (oplosmiddel B). Opmerking: Gebruik een geladen oppervlakte hybride (CSH) C18 kolom (2.1 x 150 mm, boordevol 1.7-µm deeltjes) voor de scheiding van de puntige mAb verteert.</li>
	<li>In de data acquisitie software, klik op "Create/analysemethode" en kies "Genereren van een overname en verwerkingsmethode." Typ de naam van de methode, blader naar de methode map (directory) en klik op "Next."</li>
	<li>Kies "Peptide kaart (IMS)" voor "Type van de analyse," en selecteer in het tabblad "Instrument systeem" het instrument "Quaternaire oplosmiddel Manager". De verloopinstellingen naar peptide scheiding op een debiet van 200 µL/min. gebruik een kleurovergang elutie van 1 tot 40% oplosmiddel B in 30min gevolgd door een 2-min kolom wassen en een 9-min evenwichtsinstelling bereiken, met een totale runtime van 50 min. voeren deze experimentele bewerken parameters in de LC method editor.</li>
	<li>Selecteer in het tabblad "Instrument systeem" het instrument "Sample Manager". Stel de temperatuur van het monster tot 10 ° C en de kolomtemperatuur tot 60 ° C.</li>
	<li>Werken de QTOF massaspectrometer in positieve ion ESI gevoeligheidsscène, met een typische oplossend vermogen van 30.000 FWHM. Opmerking: LC/HDMSE is een gegevens-onafhankelijke acquisitie (DIA)-modus die wordt toegepast door het snel verzamelen van scans met afwisselende botsing energieën (in de botsing cel) tussen een lage energetische waarde (6 V voor MS kanaal 1 scans) en een verhoogde energie (15 - tot 40-V helling produceren van de spectra van de fragmentatie zonder voorloper selectie in MS kanaal 2).<ol>
<li>Geef de bron-gerelateerde MS standaardparameters in de data-acquisitie software: "Mijn werk/Instrument systeem," Selecteer het tabblad "Vion IMS Qtof" en voer deze parameters in het menu "Extra": 3,0 kV capillaire spanning, bron temperatuur van 100 ° C, 100 V-source compenseren, cone 50 L/h gasstroom en 40 V kegel spanning. De desolvation temperatuur ingesteld op 250 ° C, de gasstroom van desolvation tot 500 L/h, en de referentie capillaire spanning naar 3.0 kV.</li>
		<li>In de data acquisitie software, klik op "Create/analysemethode" en kies "Genereren van een overname en verwerkingsmethode." Typ de naam van de methode, blader naar de methode map (directory) en klik vervolgens op "Next."</li>
		<li>Kies "Peptide kaart (IMS)" voor "Type van de analyse," en selecteer het instrument "Vion IMS QTof" in het tabblad "Instrument systeem". Klik op "Finish". Opmerking: De nieuw gecreëerde LC/HDMSE -methode wordt automatisch geopend in het scherm "Instrument methode Configuration".</li>
		<li>Voer deze parameters in het tabblad "Instellingen": 3,0 kV capillaire spanning, 100 ° C bron temperatuur, desolvation temperatuur van 250 ° C, 50 L/h kegel gasstroom en 500 L/h desolvation gasstroom.</li>
		<li>In de instellingen op het tabblad "Experiment", selecteer "High Definition MSE"en kies "Analyse methode runtime." Voer deze parameters in het tabblad "Scaninstellingen": lage massa, 100; hoge massa, 2.000; scannen tijd, 400 ms. In het tabblad "CE", typ "6 V" voor de instelling van de lage-energie en kies een hoog-energetische helling van 15 tot 40 V. Zorg ervoor dat "Disable data reductie" gecontroleerd.</li>
		<li>Infusie van een oplossing van 50 ng/mL leucine enkephalin (LE) bereid in 50% acetonitril met 0,1% FA op een debiet van 10 µL/min voor lock-mass kalibratie tijdens data-acquisitie. Opmerking: De gegevens vergrendelen-massa wordt elke 5 minuten met behulp van hetzelfde verwerving tarief over het dezelfde massa bereik verworven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het monster van het 10-nM, PHO-verrijkt met behulp van de bepaling van de LC/HDMSE hierboven beschreven door injecterend 10 µL van monster (de geladen op-kolom bedrag is 100 fmol voor elke standaard peptide) analyseren.</li>
</ol>4. installatie van de Tof-MRM-methode voor de optimalisering van de energie (CE) van de botsing
<ol><li>De LC/HDMSE dataset, verkrijgen de retentietijd, de voorloper en het fragment ion m/z voor elke PHO-peptide. De m/z en de staat van de kosten voor de meest voorkomende behouden voorloper ion en de bijbehorende drie overvloedigste fragment ionen. Opmerking: Een voorbeeld van lage-energie- en hoog-energetische spectra meestal opgenomen door de LC/HDMSE bepaling is opgenomen in afbeelding 2.</li>
	<li>Botsing energie (CE) optimalisatie in een experiment SRM/MRM gebruikt te bereiken van het beste signaal voor elke peptide23.<ol>
<li>In de data acquisitie software, klik op "Create/analysemethode" en kies "Genereren van een overname en verwerkingsmethode." Typ de naam van de methode, blader naar de methode map (directory) en klik op "Next."</li>
		<li>Kies bij "Soort analyse," "Quantify." Kies "Quantify Assay Tof 2D chromatografische" en klik op "Next." Selecteer "Vion IMS QTof" in het tabblad "Instrument systeem" en klik op "Finish". Opmerking: De zojuist gemaakte Tof-MRM-methode wordt automatisch geopend in het scherm "Instrument methode Configuration".</li>
		<li>Voer deze parameters in het tabblad "Instellingen": 3,0 kV capillaire spanning, 100 ° C bron temperatuur, desolvation temperatuur van 250 ° C, 50 L/h kegel gasstroom en 500 L/h desolvation gasstroom.</li>
		<li>In de instellingen op het tabblad "Experiment", selecteer "Functietabel" en kies "een of meer MS, MSMS of MRM functies." Een "Tof-MRM" functie voor elke peptide met behulp van de pijlen omlaag, ingesteld door het invoeren van drie "overgangen" (combinaties van de overvloedigste voorloper en drie van de meest voorkomende fragment ionen). Opmerking: In de Tof-MRM modus, de hoogste gevoeligheid wordt gerealiseerd via een geplande MRM-aanpak.</li>
		<li>Kies in de editor "Tof-MRM" functie een venster van de tijd van de retentie voor elke peptide (ten minste 1 min lang), gerangschikt volgens de volgorde van de elutie peptide. In de editor "Tof-MRM" functie invoegen de peptide voorloper m/z en het product m/z; Selecteer het venster quad isolatie als "Low" (4-Da venster) voor de voorloper van de peptide; Selecteer een vaste scan tijd van 100 ms; en kies twaalf verschillende botsing energie waarden in het bereik van 14-36 V als volgt: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 en 36, zoals in het voorbeeld uit afbeelding 3. Opmerking: Met de hierboven beschreven methode Tof-MRM, ten minste 10 gegevenspunten per chromatografische piek worden verzameld voor elke overgang op elke CE opgegeven. De gegevens om bestandsgrootte te reduceren, de optie "Wide" (6-Da venster) voor het signaal van het fragment-ion. Voorbeelden van de CE-geoptimaliseerde waarden zijn weergegeven in tabel 2.</li>
		<li>Het monster van het 10-nM, PHO-verrijkt met behulp van de bepaling van de Tof-MRM hierboven beschreven door injecterend 10 µL van monster (de geladen op-kolom bedrag is 100 fmol voor elke standaard peptide) analyseren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. installatie van de laatste methode van de overname van de HS-MRM voor peptide kwantificering met behulp van de ion mobiliteit scheiding van peptide precursoren
<ol><li>In het menu "Onderzoeken" van de data-acquisitie software weergeven van alle 11 chromatografische sporen gegenereerd voor elke CE voor elke peptide en integreren van de pieken met behulp van de "Integreren" knop van de werkbalk "verwerking opties/operaties"; de hoogste piekoppervlakte geeft de beste CE voor elke overgang.</li>
	<li>Visueel vergelijken van de beste wijken van de piek voor de 3 fragmenten van elke peptide en behouden van alleen de beste "overgang" (het fragment ion die de meest intense signaal produceert); Tabel 2 toont het beste "overgangen" verkregen van vier PHO peptiden.</li>
	<li>Setup een HS-MRM-methode met slechts één fragment ion per peptide. Gebruik de CCS-waarden van elk peptide voorloper van de LC/HDMSE dataset.<ol>
<li>Het wijzigen van de methode van de Tof-MRM gemaakt in de vorige sectie (hoofdstuk 4) door de functie "HS-MRM" in plaats van de "Tof-MRM"-functie te selecteren.</li>
		<li>In de "HS-MRM" functie-editor, voert u de volgende voorloper-gerelateerde parameters: m/z, vierpolige resolutie: lage (4 Da), kosten van de staat, de voorloper van CCS waarde en de voorloper van CCS resolutie: laag. Voer voor het product ion, haar m/z, de optimale botsing energie, kiest u een tijd van de scan van 0,4 s en selecteer een "Breed" spectrum instelling (6 Da) alle van de isotopen worden opgenomen. Een voorbeeld van de laatste methode van de overname van de HS-MRM voor alle vier peptides is opgenomen in afbeelding 4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyseren van alle monsters met behulp van de methode van de HS-MRM, beginnend met de lege mAb-digest (niet-spiked monster), gevolgd door 4 repliceren injecties (elke 10 µL) van de volgende concentraties: 0.1, 1, 10 en 100 nM PHO peptiden.</li>
</ol>6. het creëren van een verwerkingsmethode voor de analyse van de HS-MRM dataset
<ol><li>Het maken van een verwerkingsmethode voor de analyse van de HS-MRM dataset.<ol>
<li>In de analysemethode voor de "HS-MRM" methode voor de verwerving van de gegevens gemaakt, klik op het tabblad van de "Doel" en kies "Beheren onderdelen."</li>
		<li>Selecteer in het vak het dropdown-menu onder "Type Experiment", de "HS MS/MS/HS-MRM" optie.</li>
		<li>Klik op ' Maken/New Entry' en de invoering van de volgende parameters in de verwerking method editor: peptide retentietijd (RT), voorloper van lading staat, voorloper m/z en voorloper drift tijd (DT). Voer de m/z en opladen staat voor het fragment ion, en de trace "XIC" opgeven als de extractie-modus.</li>
		<li>Op het tabblad van de "Doel" van dezelfde "HS-MRM" overname methode, klik op "Default bedragen" en voer de volgende concentraties: 0.1, 1, 10 en 100 nM PHO peptiden.</li>
		<li>Voer de volgende parameters in het "Processing/extractie Settings": standaard massa tolerantie, 10 ppm (voor de m/z van alle fragment ionen) en standaard drift tijd, 5%; een voorbeeld van de PHO peptide verwerkingsmethode is afgebeeld in figuur 5.</li>
		<li>Kies voor het type kalibratie, de lineaire curve-fitting met 1 / X2 weging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De HS-MRM-gegevens te integreren alle chromatogrammen en voor de bouw van de kalibratiekrommen van elke PHO peptide verwerken.</li>
</ol>

<ol><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutic+proteins+by+comprehensive+online+two-dimensional+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry.</a> MAbs. 4, 24-44 (2012).</li>
<li>Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+host-cell+protein+impurities+in+biotherapeutics+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry.</a> Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+tracking+of+host-cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6, 659-670 (2014).</li>
<li>Farrell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+host-cell+protein+analysis+using+two-dimensional+data+independent+LC-MS%28E%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E).</a> Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).</li>
<li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+low-abundance+host+cell+protein+impurities+in+high-purity+monoclonal+antibodies+down+to+1+ppm+using+ion+mobility+mass+spectrometry+coupled+with+multidimensional+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography.</a> Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).</li>
<li>Doneanu, C. E., et al. Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2015-1202.ch013?src=recsys">Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques</a>. , Washington DC. ACS Symposium series 1202 357-393 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+co-elution+of+host-cell+proteins+with+monoclonal+antibodies+during+protein+A+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification.</a> Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).</li>
<li>Reisinger, V., Toll, H., Mayer, R. E., Visser, J., Wolschin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry+based+approach+to+host+cell+protein+identification+and+its+application+in+a+comparatibility+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry based approach to host cell protein identification and its application in a comparatibility exercise.</a> Anal Biochem. , 1-6 (2014).</li>
<li>Madsen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+complete+characterization+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutics+via+affinity+depletions%2C+LC%2FMS%2FMS+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis.</a> MAbs. 7, 1128-1137 (2015).</li>
<li>Giles, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+trevelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Applications of a trevelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18, 2401-2414 (2004).</li>
<li>Anderson, V., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 573-588 (2006).</li>
<li>Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18854821">Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 4, 1-14 (2008).</li>
<li>Picotti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+selected+reaction-monitoring+assays+for+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes.</a> Nat Methods. 7, 43-46 (2010).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+proteins+using+peptide+immunoaffinity+enrichment+coupled+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Liebler, D. C., Zimmerman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+quantitation+of+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry.</a> Biochemistry. 52, 3797-3806 (2013).</li>
<li>Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+for+absolute+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification.</a> J Vis Exp. (102), (2015).</li>
<li>Ebhardt, H. A., Sabido, E., Huttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22577020">Range of protein detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry in an unfractioned human cell culture lysate.</a> Proteomics. 12, 1185-1193 (2012).</li>
<li>Picotti, P., Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+dynamic+range+proteome+analysis+of+S.+cerevisiae+by+targetted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targetted proteomics.</a> Cell. 138, 795-806 (2009).</li>
<li>Sherman, J., McKay, M. J., Ashman, K., Molloy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+specific+is+my+SRM%3A+the+issue+of+precursor+and+product+ion+reductancy%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">How specific is my SRM: the issue of precursor and product ion reductancy.</a> Proteomics. 9, 1120-1123 (2009).</li>
<li>Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+innacurate+and+imprecise+transitions+in+peptide+quantification+by+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated detection of innacurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry.</a> Clin Chem. 56, 291-305 (2010).</li>
<li>Rost, H., Malmstrom, L., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+tool+to+detect+and+avoid+redundancy+in+selected+reaction+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A computational tool to detect and avoid redundancy in selected reaction monitoring.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 540-549 (2012).</li>
<li>Bao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+correction+of+interference+in+SRM+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and correction of interference in SRM analysis.</a> Methods. 61, 299-303 (2013).</li>
<li>Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+collision+energy+optimization+on+the+measurement+of+peptides+by+selected+reaction+monitoring+%28SRM%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).</li>
<li>Mbasu, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quadrupole+and+time-of-flight+mass+spectrometry+for+peptide+MRM+based+translational+reserch+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advances in quadrupole and time-of-flight mass spectrometry for peptide MRM based translational reserch analysis.</a> Proteomics. 16, 2206-2220 (2016).</li>
</ol>

Alle auteurs zijn werknemers van wateren Corporation, die de producent van diverse reagentia en instrumenten die worden gebruikt in dit artikel is.

Hoge resolutie (Rs > 20.000) massaspectrometrie routinematig wordt gebruikt voor de structurele karakterisering van therapeutische proteïnen op een verscheidenheid van instrument platforms. In tegenstelling, worden op basis van MS eiwit kwantificering doorgaans uitgevoerd door SRM/MRM op lage resolutie (Rs ~ 1.000) tandem vierpolige massaspectrometers gebruikend peptides van de handtekening gegenereerd door de enzymatische splitsing van eiwitten11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. als single-dimensie chromatografische scheidingen niet volledig van complexe peptide mengsels geproduceerd door enzymatische spijsvertering oplossen, peptide co elutie is een gemeenschappelijk optreden, zelfs in het geval van een single-eiwit verteren. Voor zeer complexe eiwit digests (bijvoorbeeld voor de kwantificering van 1-100 ppm's van hcp in aanwezigheid van een peptide-rijke achtergrond geproduceerd door de therapeutische eiwitten), de gevoeligheid, de nauwkeurigheid of de lineariteit van de SRM/MRM kan assay worden beïnvloed door interferentie.
De SRM/MRM testen hebben landbouwbrandstof selectiviteit, zich het baseren alleen op een "unieke" combinatie van voorloper/fragment massa's. Om deze reden, deze tests mislukken in situaties wanneer de peptide achtergrond onverwacht verandert (bijvoorbeeld voor biofarmaceutische monsters verkregen uit verschillende zuiveringsprocedures). Deze beperkingen wilt opheffen, stellen we hier een hoge-selectiviteit (HS) MRM test uitgevoerd op een ion mobiliteit ingeschakelde high-resolution vierpolige time-of-flight (QTOF) hybride massaspectrometer (voor het diagram van het instrument, zie figuur 6).
Het instrument scheidt van de voorlopers van de peptide van belang van andere co eluting (storende) peptide voorlopers in de cel ion mobiliteit, isoleert de volledige isotopische envelop van de voorloper in de vierpolige, en fragmenten van het met een vaste CE in de botsing cel. Het signaal dat geproduceerd door de overvloedigste peptide fragment wordt nog versterkt door het aanpassen van de Opdringer van de frequentie (Target Enhancement), die selectief duwt massa regio's van belang in de buis van de vlucht, in plaats van alle ionen, zoals bij een volledige scan. Peptide kwantificering wordt uitgevoerd met behulp van de signalen van de hoge-MS-resolutie (Rs ~ 30.000) geproduceerd door dit fragment-ion. Vergeleken met de SRM/MRM testen, de bepaling van de HS-MRM biedt twee extra niveaus van selectiviteit: een wordt verzorgd door de voorloper-niveau ion mobiliteit scheiding, terwijl de tweede wordt aangeboden door de resolutie van de grotere massa van de TOF analyzer. De resultaten gebracht door deze selectiviteit verbeteringen zijn zichtbaar in de HS-MRM chromatogrammen weergegeven in figuur 7, die vrij van storingen in drie ordes van grootte zijn.
In tegenstelling tot de SRM/MRM testen, er zijn verschillende parameters die kunnen worden aangepast voor het optimaliseren van de HS-MRM testen: het venster RT rond de voorloper van de peptide (meestal ingesteld op 0.2 min), de vierpolige isolatie venster (4 Da), het venster van de drift-tijd rond de precursor (± FWHM van de piek van de voorloper van de bijbehorende ion mobilogram), en de resolutie van de MS van het fragment-ion (20.000-40.000). De HS-MRM testen zijn zeer gevoelig: het laagste gedetecteerde bedrag voor elke PHO peptides is 1 femtomole op-kolom (of 0,1 nM in termen van peptide concentratie). Bij het overwegen van peptide MW (zie tabel 1 voor nauwkeurige MWs), het bedrag vastgesteld op-kolom volgorde van 1-2 pg, terwijl de kolom is geladen met een aanzienlijk hoger bedrag (2 µg) van achtergrond peptides van de mAb-digest.
Door te overwegen het molecuulgewicht van de full-length PHO proteïne (97.2 kDa) waarvan de puntige peptiden zijn afgeleid, is de bepaling kundig voor speurder 50 ppm van een eiwit onzuiverheid in aanwezigheid van hoge-overvloed achtergrond ionen. Onderlimiet van detectie (5-10 ppm) zijn haalbaar voor een lager moleculair gewicht HCP (10-20 kDa). De bepaling heeft betrekking op drie ordes van grootte (zoals weergegeven in de kalibratiekrommen van figuur 8), wat betekent dat het HCP in het bereik 1-1.000 ppm meten kan. Ook past de reproduceerbaarheid van de HS-MRM tests, geïllustreerd in tabel 3, heel goed bij de reproduceerbaarheid van kleine-molecuul SRM/MRM tests, met piekoppervlakte RSDs beter dan 15%.
Wij onderzocht de mogelijkheden van een roman assay voor de kwantificering van puntige peptide normen in een monoklonaal antilichaam (mAb) digest en blijk gegeven van haar gevoeligheid en utility ter dekking van het brede dynamische bereik (ten minste drie ordes van grootte) meestal aangetroffen in HCP analyse. Alle zes peptide normen werden waargenomen bij concentraties zo laag als 0,1 nM (1 femtomole geladen op een chromatografische kolom 2.1-mm ID) in aanwezigheid van een hoge-overvloed peptide achtergrond (2 µg van een mAb digest geladen op-kolom). Door de integratie van zowel gerichte HRMS en ion mobiliteit voorloper scheiding, heeft de bepaling van de HS-MRM een groot potentieel voor steeds een snelle, hoge-doorvoer toezicht assay voor meerdere HCP over meervoudige batches van biofarmaceutica.

Kwantificering van grote biomoleculen (eiwitten) in industriële instellingen is momenteel gebaseerd op immunoassay (bijvoorbeeld ELISAs), voornamelijk te wijten aan verschillende voordelen: gevoeligheid, high-throughput, gemak-of-gebruik en lage kosten per monster. Wanneer toegepast om te analyseren van de lage-overvloed eiwit (1-100 ppm van gastheercel eiwitten (HCP)) aanwezige onzuiverheden in eiwit therapeutiek, geven deze biologische tests doorgaans de totale concentratie van HCP (meestal uitgedrukt in ppm of ng HCP/mg mAb), maar ze kunnen identificeren en meten van individuele HCP contaminanten. Diverse MS gebaseerde testen zijn onlangs ontwikkeld ter aanvulling van de ELISAs of inlichtingen die ELISAs niet te bieden van1,2,3,4,5,6 te verstrekken , 7 , 8 , 9. wegens de complexiteit van het monster en de verplichting tot het detecteren van HCP peptiden in een breed dynamisch bereik in concentratie (ten minste 3 ordes van grootte), multidimensionale chromatografische methoden aanbesteding uitgebreide steekproef fractionering hebben traditioneel zijn aangewend om te helpen bij het identificeren van lage-overvloed HCP1,2,3,4,5,6,7.
Een natuurlijke stap na HCP identificatie en validatie is HCP tracking (monitoring) over meervoudige batches van biofarmaceutica. In deze situatie, single-dimensie LC/MS-methoden voorgesteld ter verbetering van de steekproef doorvoer8,9. Echter, de nauwkeurigheid en dynamische bereik van HCP metingen kunnen worden beïnvloed in een 1D-LC/MS-analyse door de overweldigende aanwezigheid van biofarmaceutische peptiden. Vergeleken met een multidimensionale scheiding, het potentieel voor signaal storing19,20,21,22 wordt vergroot in de gaschromatografische scheiding van een single-dimensie omdat de kans voor meer peptide voorlopers worden mede eluting wordt verhoogd. De opneming van orthogonale middelen voor het scheiden van peptide precursoren zonder uitbreiding van de gaschromatografische scheiding tijd duidelijk zou voordelig zijn. Golf ion mobiliteit (TWIM)10 reizen heeft de mogelijkheid om op te lossen van overbelaste MS-spectra in milliseconden. Ongeveer 500 mobiliteit kleurscheidingen kunnen worden uitgevoerd tijdens de elutie van een enkele peptide, uitgaande van een volledige chromatografische piekbreedte van 10 s en gezien het feit dat de runtime van de scheiding van een IM op het ion mobiliteit instrument 20 ms.
Massaspectrometrische testen voor eiwit kwantificering met succes zijn ontwikkeld in de afgelopen tien jaar met behulp van de goed aanvaarde geselecteerd (meerdere) reactie benadering (methode SRM/MRM) uitgevoerd op tandem massaspectrometers11, toezicht 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23. Een van de beperkingen van deze lage resolutie massaspectrometrische bepaling is de storing fenomeen19,20,21,22 waargenomen wanneer de peptide van belang heeft "hetzelfde" voorloper en fragment massa andere mede eluting peptiden aanwezig in het monster (binnen een 1-Da-venster). Er zijn twee manieren om te verbeteren van de nauwkeurigheid van de SRM/MRM methoden: ã‰ã © n optie impliceert een stap extra scheiding op het niveau van de voorloper te verwijderen van storende voorloper ionen, terwijl de andere optie is om het verhogen van de resolutie van de MS van de opsporing van voorloper/fragment het vermijden van overlappende MS signalen. De hoge-selectiviteit (HS) MRM overname modus beschreven hier profiteert van beide van deze benaderingen door koppeling van de ion mobiliteit scheiding van peptide precursoren met de hoge resolutie (Rs ~ 30.000) MS detectie van peptide fragmenten. Hier beschreven de test covers ten minste drie ordes van grootte, die meestal het dynamisch bereik is waargenomen in SRM/MRM proteomics experimenten17,18,24.
Het nut van de HS-MRM assay voor HCP kwantificering werd aangetoond door de controle van de lineariteit van het signaal dat geproduceerd door zes peptide normen spiked in verschillende concentraties (0.1 - naar 100-nM-bereik) in een monoclonal antilichaam digest.

<table><tbody><tr><td>Vion IMS Qtof massaspectrometer</td><td>Waters</td><td>186009214</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class quaternaire oplosmiddelbeheerder (QSM)</td><td>Waters</td><td>186015041</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class FTN-monsterbeheerder (SM)</td><td>Waters</td><td>186015040</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class kolombeheerder (CM)</td><td>Waters</td><td>186015043</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40867-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC-kolom, 1.8 &micro;m deeltjes</td><td>Waters</td><td>186005298</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>Forminezuur, eluentadditief voor LC/MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56302-10X1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Hi3 konijnfosforylase (PHO) MassPREP-standaard</td><td>Waters</td><td>186006011</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide (IAM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I-1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>LC-vials (12x32 mm glazen vials, schroefhals)</td><td>Waters</td><td>186000327c</td><td></td></tr><tr><td>Leucine enkefalinaceetaat zouthydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9133-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 2,0 mL buizen (2x50)</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/Lys-C enzymmix, massaspectrometriekwaliteit (5 x 20 &micro;g)</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Water, LC/MS-kwaliteit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39253-1L-R</td><td></td></tr></tbody></table>

een hs-mrm assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie ion mobiliteit qtof massaspectrometrie

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

De analyse van laag niveau (1-100 ppm) eiwit verontreinigingen (bijvoorbeeld gastheercel eiwitten (HCP)) in eiwit biotherapeutics is een uitdagende test waarbij hoge gevoeligheid en een breed dynamisch bereik. Massa spectrometrie gebaseerde kwantificering testen voor eiwitten zijn gewoonlijk eiwit spijsvertering gevolgd door de selectieve reactie controle/meerdere reactie monitoring (SRM/MRM) kwantificering van peptiden met een lage resolutie (Rs ~ 1.000) tandem vierpolige massaspectrometer. Een van de beperkingen van deze aanpak is het verschijnsel van de interferentie waargenomen wanneer de peptide van belang heeft de voorloper van de "dezelfde" en fragment massa (in termen van m/z-waarden) als andere mede eluting peptiden aanwezig in het monster (binnen een 1-Da-venster). Om te voorkomen dat dit fenomeen, stellen wij een alternatieve massaspectrometrische aanpak, een hoge selectiviteit (HS) MRM assay die de ion mobiliteit scheiding van peptide precursoren met de hoge resolutie (Rs ~ 30.000 combineert) MS detectie van peptide fragmenten. Verkenden we de mogelijkheden van deze aanpak te kwantificeren van lage-overvloed peptide normen spiked in een monoklonaal antilichaam (mAb) digest en aangetoond dat het de gevoeligheid en het dynamisch bereik (ten minste 3 ordes van grootte) meestal bereikt in HCP analyse. Alle zes peptide normen werden waargenomen bij concentraties zo laag als 0,1 nM (1 femtomole geladen op een chromatografische kolom 2.1-mm ID) in aanwezigheid van een hoge-overvloed peptide achtergrond (2 µg van een mAb digest geladen op-kolom). Bij het overwegen van het MW van konijn werkte (97.2 kDa), waarvan de puntige peptiden zijn afgeleid, is de kwantificering van deze bepaling lager dan 50 ppm. Relatieve standaardafwijkingen (RSD) van de pieken (n = 4 wordt gerepliceerd) waren minder dan 15% over het gehele concentratiebereik onderzocht (0.1-100 nM of 1-1.000 ppm) in deze studie.

De individuele sequenties van zes werkte b peptide normen opgenomen in het mengsel van de peptide PHO staan vermeld in tabel 1, samen met hun retentietijden en hun overvloedigste precursoren waargenomen HDMSE experimenteren. De eerste stap in de ontwikkeling van een hoge-selectiviteit (HS) MRM bepaling is de overname van een dataset HDMSE om de tijden van de elutie van elke PHO peptide, samen met de bijbehorende meeste overvloedige voorloper en de drie meest voorkomende fragmenten. Figuur 2 toont de HDMSE spectra verworven voor een van de PHO peptiden (Pep 6) spiked in de infliximab digest. Na de oprichting van de 3 beste "overgangen" (combinaties van voorloper en fragment massa's) voor elke peptide, is een Tof-MRM experiment uitgevoerd om te zoeken naar de optimale botsing energie te maximaliseren de signalen gegenereerd voor elke peptide. De resultaten van de CE-optimalisatie-experiment worden samengevat in tabel 2. De definitieve bepaling van de HS-MRM (zie figuur 4) behoudt alleen de beste "overgang" voor elke peptide en wordt gebruikt voor het analyseren van alle verrijkte monsters. Voorbeelden van HS-MRM chromatogrammen gegenereerd voor 4 PHO peptides in alle concentraties die onderzocht worden gepresenteerd in figuur 7. Vier kalibratiekrommen verkregen voor elke peptide na de integratie van de HS-MRM pieken in figuur 7 gemarkeerd worden weergegeven in figuur 8. Daarnaast is de piek gebied relatieve standaardafwijking, berekend op basis van 4 repliceren injecties, samengevat in 4 tabellen weergegeven in tabel 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Peptide</td>
			<td colspan="2">Peptide</td>
			<td>Retentie</td>
			<td colspan="4">Gratis bestuurlijk</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Volgorde</td>
			<td>tijd (min)</td>
			<td>+ 1</td>
			<td>+ 2</td>
			<td>+ 3</td>
			<td>+ 4</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 1</td>
			<td colspan="2">VLYPNDNFFEGK</td>
			<td>19.4</td>
			<td>1442.6951</td>
			<td>721.8512</td>
			<td>481.5699</td>
			<td>361.4292</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16,0</td>
			<td>1874.9065</td>
			<td>937.9569</td>
			<td>625.6404</td>
			<td>469.4821</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 3</td>
			<td colspan="2">IGEEYISDLDQLRK</td>
			<td>18,9</td>
			<td>1678.8646</td>
			<td>839.9360</td>
			<td>560.2931</td>
			<td>420.4716</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21.1</td>
			<td>1440.7369</td>
			<td>720.8721</td>
			<td>480.9172</td>
			<td>360.9397</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19,7</td>
			<td>1890.0080</td>
			<td>945.5076</td>
			<td>630.6742</td>
			<td>473.2574</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17,7</td>
			<td>1262.5939</td>
			<td>631.8006</td>
			<td>421.5362</td>
			<td>316.4039</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. PHO peptide normen opgenomen in de mix van de massa PREP spiked in de infliximab digest. Peptide retentietijden en hun overvloedigste precursoren (gemarkeerd in vet) worden weergegeven in tabelvorm.
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Peptide</td>
			<td colspan="2">Peptide</td>
			<td>Retentie</td>
			<td colspan="2">De voorloper van de peptide</td>
			<td colspan="3">Meest voorkomende fragment ionen/heffing</td>
			<td>Optimale</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Volgorde</td>
			<td>tijd (min)</td>
			<td>m/z & charge</td>
			<td>Drift tijd (ms)</td>
			<td>Ik</td>
			<td>II</td>
			<td>III</td>
			<td>CE (V)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16,0</td>
			<td>625.6404 (+ 3)</td>
			<td>6.2</td>
			<td>714.3781 (+ 1)</td>
			<td>807.4177 (+ 2)</td>
			<td>827.4621 (+ 1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21.1</td>
			<td>720.8721 (+ 2)</td>
			<td>7.5</td>
			<td>865.4050 (+ 1)</td>
			<td>964.4734 (+ 1)</td>
			<td>1214.5688 (+ 1)</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19,7</td>
			<td>630.6742 (+ 3)</td>
			<td>6.3</td>
			<td>642.3570 (+ 1)</td>
			<td>689.8391 (+ 2)</td>
			<td>832.4236 (+ 2)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17,7</td>
			<td>631.8006 (+ 2)</td>
			<td>7.0</td>
			<td>830.3931 (+ 1)</td>
			<td>945.4200 (+ 2)</td>
			<td>1016.4571 (+ 1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Resultaten van de Tof-MRM optimalisatie-experiment: de drie meest voorkomende fragmenten van elke PHO peptide gekwantificeerd in deze studie worden vermeld, samen met de bijbehorende geoptimaliseerde botsing energie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Conc</td>
			<td>Bedrag</td>
			<td colspan="6">Pep 2 Peak gebieden (tabel 3A)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>op-kolom (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Gemiddelde</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>439</td>
			<td>462</td>
			<td>431</td>
			<td>456</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>5121</td>
			<td>4842</td>
			<td>5198</td>
			<td>4842</td>
			<td>5001</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>63853</td>
			<td>64279</td>
			<td>66111</td>
			<td>62509</td>
			<td>64188</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>612392</td>
			<td>605553</td>
			<td>613229</td>
			<td>611004</td>
			<td>610545</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Conc</td>
			<td>Bedrag</td>
			<td colspan="6">Pep 4 piek gebieden (tabel 3B)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>op-kolom (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Gemiddelde</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>275</td>
			<td>359</td>
			<td>325</td>
			<td>288</td>
			<td>312</td>
			<td>12.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>3559</td>
			<td>3694</td>
			<td>3287</td>
			<td>3754</td>
			<td>3574</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>45259</td>
			<td>45775</td>
			<td>42976</td>
			<td>45548</td>
			<td>44890</td>
			<td>2.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>459374</td>
			<td>467927</td>
			<td>436272</td>
			<td>458994</td>
			<td>455642</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Conc</td>
			<td>Bedrag</td>
			<td colspan="6">Pep 5 piek gebieden (tabel 3 c)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>op-kolom (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Gemiddelde</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>3194</td>
			<td>3243</td>
			<td>3202</td>
			<td>3257</td>
			<td>3224</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>31464</td>
			<td>31150</td>
			<td>31464</td>
			<td>31433</td>
			<td>31378</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>313638</td>
			<td>320712</td>
			<td>311943</td>
			<td>311943</td>
			<td>314559</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>2845736</td>
			<td>2840031</td>
			<td>2882006</td>
			<td>2864052</td>
			<td>2857956</td>
			<td>0,7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Conc</td>
			<td>Bedrag</td>
			<td colspan="6">Pep 6 piek gebieden (tabel 3D)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>op-kolom (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Gemiddelde</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>583</td>
			<td>440</td>
			<td>440</td>
			<td>488</td>
			<td>13,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>6429</td>
			<td>6429</td>
			<td>6848</td>
			<td>6623</td>
			<td>6582</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>71295</td>
			<td>70400</td>
			<td>71563</td>
			<td>70400</td>
			<td>70915</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>707640</td>
			<td>707640</td>
			<td>694461</td>
			<td>729490</td>
			<td>709808</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3. Tabel met de gebieden van de piek van HS-MRM chromatogrammen opgenomen voor 4 PHO peptides (Pep 2, 4, 5 en 6) voor elke injectie LC/MS (16 LC/MS loopt en 4 concentraties getest). De relatieve standaardafwijking was beter dan 15% voor alle peptides over het gehele concentratiebereik onderzocht.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig1.jpg"> Figuur 1. Werkstroomdiagram samenvatten van de drie stappen die nodig zijn voor het opzetten van een HS-MRM overname methode. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig2.jpg"> Figuur 2. Voorbeeld van HDMSE gegevens: (A) lage-energie spectrum tonen de Pep 6 voorloper ion. (B) hoog-energetische fragmentatie spectrum van de dezelfde peptide, weergeven van de top 3 meest voorkomende fragment ionen (omcirkeld) geselecteerd voor Tof-MRM botsing energie optimalisatie. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig3.jpg"> Figuur 3. Parameters die worden gebruikt voor het opzetten van een Tof-MRM optimalisatie experimenteren. Voor elke overgang, werden elf botsing energiebronnen (in het bereik van 16 tot en met 36 V) getest. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig4.jpg"> Figuur 4. Voorbeeld van de laatste HS-MRM-methode. Verschillende parameters zijn vereist voor elke "overgang," met inbegrip van de peptide voorloper m/z, zijn staat van kosten en ion mobiliteit drift tijd, de m/z van de meest voorkomende fragment ion, de optimale botsing energie en de MS-Acquisitietijd. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig5.jpg"> Figuur 5. Instellingen die worden gebruikt door de verwerkingsmethode voor het analyseren van de HS-MRM dataset. Elke peptide wordt gevolgd door een single "overgang" beschreven door de peptide voorloper m/z, opladen staat, en verwacht van de retentietijd, langs met de m/z van de meest voorkomende fragment en haar lading staat. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig6.jpg"> Figuur 6. Diagram van de ion mobiliteit massaspectrometer. In de HS-MRM overname modus, de voorlopers van de peptide dat wordt gekwantificeerd zijn gescheiden van andere co eluting (storende) peptide precursoren in de ion mobiliteit cel, geïsoleerd door de vierpolige en gefragmenteerd met een vaste botsing energie in de botsing cel. Het signaal dat geproduceerd door de peptide fragment ionen wordt versterkt door de Opdringer frequentie aan te passen, en kwantificering van de peptide wordt uitgevoerd met behulp van de hoge MS-resolutie (> 30.000) signalen geproduceerd door de meest intense ion van het fragment van elke peptide. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2.jpg"> Figuur 7. HS-MRM chromatogrammen opgenomen voor 4 PHO peptides op 4 verschillende concentraties verspreid over 3 ordes van grootte (0.1, 1, 10 en 100 nM). (A) pep 2 chromatogrammen, (B) Pep 4 chromatogrammen, (C) Pep 5 chromatogrammen en (D) Pep 6 chromatogrammen. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2.jpg"> Figuur 8. Kalibratiekrommen voor 4 PHO peptides over 4 verschillende concentraties (0.1, 1, 10 en 100 nM). De tabellen onder elke kromme weergeven de gebieden met individuele piek (Y-waarden) opgenomen voor elke injectie, terwijl de tweede kolom van elke tabel het percentage afwijking van de verwachte lineaire respons toont. (A) pep 2 kalibratie, (B) Pep 4 kalibratie, (C) Pep 5 kalibratie en (D) Pep 6 kalibratie. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Hier beschrijven we een chromatografische test in combinatie met de ion mobiliteit scheiding van peptide precursoren gevolgd door de hoge resolutie (~ 30.000) MS-detectie van peptide fragmenten voor de kwantificering van puntige peptide normen in een monoclonal antilichaam Digest.

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Het algemene doel van de HS-MRM-assay is om het MRM-interferentieverschijnsel, dat de kwantificering van peptiden of eiwitten beïnvloedt, te verminderen door ionmobiliteitscheiding van peptideprecursoren te combineren met massaspectrometrische detectie van fragmentionen met hoge resolutie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen op het gebied van biotherapeutische karakterisering, evenals bij de kwantificering van eiwit- of peptidebiomarkers en kwantitatieve proteomica. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de detectie mogelijk maakt van laag-abundante gastheleiwitten die aanwezig kunnen zijn in biofarmaceutische eiwitten.Klik eerst op 'create analysis method' in de software voor gegevensverwerving en kies 'generate and acquire and process method'. Voer de methode-naam en beschrijving in, blader naar de map voor de methode en klik op 'next'. Kies voor het analysetype 'peptide map IMS' en klik op 'next'.Select vervolgens de huidige systeemconfiguratie en klik op volgende en voltooien. Klik in de nieuw aangemaakte methode op het tabblad instrumenten, selecteer de binaire oplosmiddelbeheerder en bewerk de gradiëntinstellingen om peptide-scheiding te bereiken bij een stroomsnelheid van 0,2 milliliters per minuut. Gebruik een gradiëntverdunning van 1 tot 40% oplosmiddel B in 30 minuten, gevolgd door een kolomspoeling van twee minuten en een equilibratie van 10 minuten, met een totale looptijd van 45 minuten.Select vervolgens de sample manager en stel de monstertemperatuur in op 10 °C en de kolomtemperatuur op 60 °C. Selecteer in het tabblad instrumenten het Vion IMS QTof-instrument. Selecteer in het gedeelte instellingen de gevoeligheid voor de analyzer-modus en voer 3 kV in voor de capillaire spanning, 100 °C voor de brontemperatuur, 250 °C voor de desolvatatietemperatuur, 50 L/u voor de cone-gasstroom en 500 L/u voor de desolvatatiegasstroom.Klik op het tabblad experiment en selecteer high definition MSE als modus. Voer vervolgens 100 in voor lage massa, 2000 voor hoge massa en 0,4 seconden voor de scantijd. Typ in het gedeelte voor botsingsenergie zes elektronenvolt in voor de instelling voor lage energie en kies een hoog-energieramp van 15 tot 40 elektronenvolt.Gebruik voor de acquisitietijd een aangepaste looptijd tussen de 5 en 30 minuten. Klik vervolgens op het tabblad opties en selecteer de automatische lock-correctiemodus met een automatische lock-correctieinterval van vijf minuten. Selecteer daarna de optie om door te gaan met de lock-correctie en zorg ervoor dat de automatische detectivcontrole is uitgeschakeld.Selecteer in het huidige configuratiemenu van het systeem het Vion IMS QTof-instrument en klik op tools. Voer drie kilovolt in voor de capillairspanning, 40 volt voor de sampling cone, 100 volt voor de source offset, 100 °C voor de brontemperatuur, 250 °C voor de desolvatietemperatuur, 50 L/u voor de cone-gasstroom, 500 L/u voor de desolvatiegasstroom en drie kilovolt voor de referentiecapillairspanning. Analyseer een eerder bereide 10 nM faux-gespikede monstername met de zojuist beschreven LC-HDMSE-assay door 10 µL monster in het instrument te injecteren.De individuele sequenties van zes fosforylase B-peptide-standaarden die in het faux-peptidemengsel zijn opgenomen, worden hier getoond samen met hun retentietijden en hun meest abundante precursoren waargenomen in het HDMSE-experiment. De HDMSE-spectra verkregen voor een van de faux-peptiden die aan het Infliximab-digestaat zijn toegevoegd, worden hier weergegeven. Klik in de software voor gegevensacquisitie op create analysis method en kies generate and acquire and process method.Typ de naam en beschrijving van de methode, navigeer naar de methodemap en klik op next. Kies voor het analysetype voor quantify, selecteer Quantify Assay Tof 2D Chromatographic en klik op next. Selecteer vervolgens de huidige systeemconfiguratie en klik op next en finish.Klik op het tabblad instrumenten in de nieuw aangemaakte methode. Selecteer de binaire solventmanager en pas de gradiëntinstellingen aan om peptide-scheiding te bereiken bij een stroomsnelheid van 0,2 milliliters per minuut. Gebruik een gradiëntverdunning van 1 tot 40% solvent B in 30 minuten, gevolgd door een kolomwassing van twee minuten en een equilibratie van 10 minuten, met een totale looptijd van 45 minuten.Selecteer in het tabblad instrumenten de sample manager en stel de monstertemperatuur in op 10 °C en de kolomtemperatuur op 60 °C. Selecteer nu het Vion IMS QTof-instrument en selecteer in het instellingengedeelte 'sensitivity' voor de analyzer-modus. Voer vervolgens 3 kV in voor de capillaire spanning, 100 °C voor de brontemperatuur, 250 °C voor de desolvatie-temperatuur, 50 L/h voor de cone-gasstroom en 500 L/h voor de desolvatie-gasstroom.Klik op het tabblad experiment en kies bij experimenttype één of meer MS-, MSMS- of MRM-functies in de functietabel. Verwijder de standaard acquisitiefunctie, klik op add plus MRM en bewerk de parameters van het retentievenster in het gedeelte runtime. Voer in de Tof MRM-functie-editor de master charge ratio van de peptide-precursor in, selecteer low voor de precursorresolutie en voer de ladingsstatus van de precursor in.Voer vervolgens de product master charge ratio van 16 electron volts in voor de initiële botsingsenergie, 0,1 seconds voor de vaste scantijd, en wide voor de spectrumkolom. Voeg met behulp van de duplicate-knop 10 extra MRM-transities toe en gebruik verschillende waarden voor de botsingsenergie in het bereik van 18 tot 36 electron volts. Nadat de drie beste transities voor elk peptide waren vastgesteld, werd een Tof MRM-experiment uitgevoerd om de optimale botsingsenergie te bepalen om de gegenereerde signalen voor elk peptide te maximaliseren.Stel vervolgens een HS-MRM-methode in die slechts één fragmention per peptide bevat. Pas de eerder gemaakte Tof MRM-methode aan door de HS-MRM-functie te selecteren in plaats van de Tof MRM-functie. Voer in de editor van de HS-MRM-functie de master charge ratio in, selecteer 'low' voor de precursorresolutie en voer de precursor-ladingsstaat in.Voer vervolgens de CCS-waarde van de precursor in en selecteer 'low' voor de resolutie van de precursor-CCS. Voer voor het production de master charge ratio in, selecteer de optimale botsingsenergie, kies een scantijd van 0,4 seconden en selecteer een brede spectruminstelling om alle isotopen ervan op te nemen. De uiteindelijke HS-MRM-assay behoudt alleen de beste transitie voor elk peptide en wordt gebruikt voor de analyse van alle gespikede monsters.Klik in de analysemethode die is gemaakt voor de HS-MRM-gegevensverwervingsmethode op het tabblad 'purpose' en kies 'manage components'. Selecteer in het vervolgkeuzemenu onder 'experiment type' de optie HS MSMS/HS MRM. Klik op 'create' en voer de componentnaam, de verwachte retentietijd, het extractietijdvenster en de precursor master charge ratio in.Selecteer de XIC-extractiemodus en typ de verwachte CCS-waarde in. Voer voor het fragment-ion de ladingsstaat en de master-ladingsverhouding in. Voer vervolgens alle peptidecomponenten in die worden gemonitord door de HS-MRM-assay.Klik in het tabblad 'doel' van dezelfde HS-MRM-acquisitiemethode op standaardhoeveelheden en voer 0,1, één, 10 en 100 nanomolar in voor alle faux-peptidecomponenten. Klik na het invoeren van de eerste waarde met de rechtermuisknop en selecteer de optie 'naar beneden vullen' om dezelfde concentratie voor alle componenten in te voeren. Herhaal dezelfde procedure voor alle vier de concentraties van de kalibratiecurve.Ga nu naar het tabblad processing en klik op extraction settings. Voer 10 PPM in voor de massatolerantie. Klik vervolgens op CCS drift time tolerance en voer 5% in voor de CCS-tolerantie.Selecteer in het tabblad verwerking de instellingen voor piekverwerking. Selecteer in het gedeelte voor afgladding 'mean' als afgladingsalgoritme, één als de halve breedte en één als het aantal iteraties. Zorg ervoor dat in het gedeelte voor integratie de opties voor automatische piekbreedte en automatische detectie beide zijn aangevinkt.Select vervolgens de instellingen voor de gerichte screening in het tabblad 'processing' en kies de optie 'closest to RT' in het RT-venster. Voer vervolgens 0,2 minuten in voor de tolerantie van de retentietijd. Selecteer de kwantificeringsinstellingen en kies in het kalibratiemenu 'linear' voor het type kalibratiecurve-fit, 'one over x squared' voor het gewichtstype, 'concentration' voor het type componentwaarde, 'millimoles per liter' voor de eenheden van de componentwaarde, en 'none' voor het berekenen van kalibratiepunten door middeling.Selecteer in het quantify-menu 'area' als de responsiewaarde. Voorbeelden van HS-MRM-chromatogrammen die zijn gegenereerd voor de faux-peptiden over alle concentraties worden hier gepresenteerd. De kalibratiecurves die voor elk peptide zijn verkregen na de integratie van de HS-MRM-pieken worden hier weergegeven.De relatieve standaardafwijking van het piekareaal, berekend op basis van vier replica-injecties, is hier samengevat. Omdat de MRM-assay met hoge selectiviteit zowel ionmobiliteit-precursor-scheiding als gerichte massaspectrometrische detectie met hoge resolutie combineert, heeft deze een groot potentieel om een snelle high-throughput monitoring-assay te worden voor meerdere gastheeleiwitten over verschillende batches biologische geneesmiddelen heen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een MRM-assay met hoge selectiviteit instelt op een Vion IMS QTof-instrument.

an-hs-mrm-assay-for-quantification-host-cell-proteins-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Stabiele Isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antilichamen (SISCAPA) paren affiniteit verrijking van peptiden met stabiele isotoop verdunning massaspectrometrie (MRM-MS) voor kwantitatieve meting van peptiden te bieden als surrogaat voor hun respectievelijke eiwitten. Hier beschrijven we het protocol met behulp van magnetische deeltjes in een deels geautomatiseerde formaat.

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald naar 384-well platen beschreven. Deze kosteneffectieve formaat moet nuttig zijn in het gebied van eiwit deimmunization en vaccin ontwerp en ontwikkeling te bewijzen.

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

Dit protocol beschrijft hoe absolute kwantificeringsanalyses van doeleiwitten binnen complexe biologische monsters kunnen worden uitgevoerd met behulp van geselecteerde reactiebewaking. Het werd gebruikt om eiwitten van de muis macrofaag chemotaxis signaleringsroute nauwkeurig te kwantificeren. Selectie van doelpeptiden, ontwikkeling van analyses en kwalitatieve en kwantitatieve analyses worden in detail beschreven.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Dit protocol beschrijft het gebruik van hoge-specificiteit-ionenwisselingschromatografie met multi hoek lichtverstrooiing voor een nauwkeurige molmassabepalingen van eiwitcomplexen, eiwitten en peptiden in een heterogene monster. Deze methode is waardevol voor kwaliteitsbeoordeling, alsook wat betreft de karakterisatie van inheemse oligomeren, gratis varianten en gemengd-EiwitSteekproeven.

Ionenwisselingschromatografie (IEX) gekoppeld aan meerdere hoek lichtverstrooiing (MALS) voor eiwit scheiding en karakterisering

Het protocol is bedoeld om het gebruik van een triple quadrupole mass spectrometer voor Multiple Reaction Monitoring (MRM) van eiwitten uit klinische monsters in te voeren. We hebben een systematische workflow voorzien, van monstervoorbereiding tot gegevensanalyse voor klinische monsters met alle nodige voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen.

Kwantitatieve Proteomics Workflow met behulp van multiple reaction monitoring gebaseerde detectie van eiwitten uit menselijk hersenweefsel

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Er wordt een protocol gepresenteerd voor het verrijken van gastheerceleiwitten (HCP's) uit geneesmiddelen (DP) en het detecteren van peptiden met behulp van proteoomverrijkingskorrels. De methode wordt gedemonstreerd met behulp van een in-house vervaardigde monoklonale antilichaam (mAb) geneesmiddelsubstantie (DS), die een goed gekarakteriseerd referentiemateriaal is voor het evalueren en vergelijken van verschillende methoden in termen van prestaties.

Gastheerceleiwitanalyse met behulp van verrijkingsparels in combinatie met beperkte spijsvertering

Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).

Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Leer een HS-MRM assay voor kwantificering van gastheercel eiwitten in biofarmaceutica met ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie. Deze methode detecteert laag geconcentreerde eiwitten nauwkeurig.

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

Meer video's verkennen