Een eenvoudige kamer voor langdurige confocal beeldvorming van wortel- en hypocotylontwikkeling

Het algemene doel van dit beeldvormingssysteem is om confocale fluorescentiemicroscopie te gebruiken om de ontwikkeling van plantorganen gedurende meerdere dagen met een subcellulaire resolutie te observeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in plantenmorfogenese, zoals hoe coördineren cellen van meercellige organismen hun groei- en proliferatiepatronen tijdens organogene? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig is om op te zetten en niet afhankelijk is van de gespecialiseerde apparatuur die vaak wordt gebruikt bij time-lapse beeldvorming, zoals profusiesystemen.

We kregen het idee voor deze methode voor het eerst toen we de publicatie van Littlejohn en Love in New Phytologist lazen, die de voordelen van perfluorodecaline voor beeldvorming in bladweefsels beschrijft. Om te beginnen, gebruik een glazen snijder om drie millimeter brede glazen strips te maken van een schuifje van één millimeter dik. Bevestig vervolgens de strips met cyanoacrylaatlijm of dubbelzijdig plakband op ongeveer 45 millimeter uit elkaar over de breedte van een nieuwe schuifje.

Maak een extra schuifje met dezelfde afmetingen om als mal te dienen. Maak nu een pakking van dezelfde hoogte van gasdoorlatende PDMS-gum. Bevochtig een tweede schuifje met een beetje absolute ethanol en vlak de PDMS af op de schuifje tot de hoogte van de glazen strips.

Bevochtig vervolgens een mes met absolute ethanol en trim de overtollige PDMS weg. Dit is cruciaal omdat gereedschappen die met ethanol zijn bevochtigd, niet aan de PDMS zullen blijven plakken. Vlak vervolgens de PDMS weer af tot de hoogte van de strip.

Snijd vervolgens een holte in de PDMS die de zaailing en agarplaat zal houden. Om een consistente holtegrootte te produceren, gebruiken we een op maat gemaakte zelfgemaakte snijder gebouwd uit een bril, maar een scheermesje zou ook kunnen worden gebruikt. Trim vervolgens rond de buitenrand om de pakking ongeveer twee millimeter dik te maken.

Plaats nu op een schuifje zonder de PDMS-pakking een dekglas op beide glazen strips. Pipetteer vervolgens ongeveer één milliliter warme vloeibare agar medium in de ruimte onder het dekglas om de ruimte te vullen. De agar kan experimentele verbindingen van belang bevatten.

Breng vervolgens enkele PFD in lucht evenwicht door een kleine hoeveelheid PFD in een buis te schudden. Zodra de agar is uitgehard, laadt u ongeveer 200 microliter van de PFD in de PDMS-pakking, maar vul het niet helemaal. Verwijder het dekglas van de agarplaat en snijd het in een vorm die past in de put van de PDMS-gel pakking.

Laat een opening van twee tot vier millimeter tussen de agar en de pakkingwand. Vul vervolgens de kamer volledig met in lucht evenwicht gebrachte PFD. Om gravitropische primaire wortels te beeldvormen, wordt een cellulosische membraan gebruikt als fysische barrière op het oppervlak van de agarplaat.

De agarplaat moet ook zachter zijn met 0,8% agar in plaats van 1,5% agar. Snijd een stuk van het membraan dat ongeveer dezelfde afmetingen heeft als de agarblok. Steriliseer het vervolgens met 80% ethanol en laat het aan de lucht drogen.

Eenmaal gedroogd, week het membraan in vloeibaar groeimedium en breng het vervolgens over op het agaroppervlak. Plaats om te beginnen voorzichtig maximaal drie zaailingen op de agar. Hun positionering is cruciaal.

De cotyledonen en hypocotyl moeten over de agarrand hangen, zwevend in PFD. Er moet ruimte worden geboden tussen de zaailingen om groei mogelijk te maken. Zaailingen kunnen worden opgerold als ze te groot zijn om in de kamer te passen.

Sluit vervolgens de kamer met een dekglas met een dikte die overeenkomt met het gekozen objectief. Druk voorzichtig langs de rand zodat contact wordt gemaakt met de glazen strips. Gebruik een andere glazen schuifje om voorzichtig het dekglas naar beneden te drukken, zodat het gelijkmatig op de twee glazen strips rust.

Bevestig vervolgens het dekglas met micropore chirurgisch tape die in de lengte doormidden is gesneden. Laat nu het specimen ongeveer een half uur rusten voordat u gaat beeldvormen. Om de arabidopsis thaliana zaailingen voor te bereiden voor de kamers, steriliseer eerst de zaden met 70% ethanol.

En plant ze vervolgens op aangevuld medium. Stratificeer de geplante zaden gedurende twee of vier dagen bij vier graden Celsius. Breng vervolgens de geplante zaden over naar 22 graden Celsius en laat ze verticaal georiënteerd groeien onder een dagelijkse lichtcyclus van 16 uur.

Om de laterale wortels te beeldvormen, laat u de planten zeven tot 10 dagen groeien en brengt u ze vervolgens over naar beeldvormingskamers. Laterale wortels die met fysiologische snelheden groeiden in beeldvormingskamers werden elke half uur gedocumenteerd. Laterale wortels werden ook op standaard petrischalen in hetzelfde medium gekweekt voor vergelijking.

De groeisnelheid van individuele wortels varieerde veel in beide opstellingen, maar het bereik was onder beide omstandigheden vergelijkbaar. Over het algemeen nam de groeisnelheid toe met de lengte. De groeisnelheid van planten in beeldvormingskamers of op platen was in de eerste 27 uur van groei niet te onderscheiden.

Beide groepen begonnen met dezelfde gemiddelde lengte van laterale wortels. Laterale wortels die een plasmamembraanmarker en een microtubulusmarker co-exprimeerden, werden met intervallen van een uur in de beeldvormingskamers beeldvormd. De wortels waren zeer stabiel in hun posities, waardoor meerdere uren confocale beeldvorming mogelijk was.

Visuele indicatoren van proliferatie werden gedurende het hele experiment waargenomen. In de meristmatische cellen konden pre-profase banden, mitotische spoelen en phragmoplasten worden geïdentificeerd. Over drie dagen was de groei van laterale wortels niet significant anders in beeldvormingskamers vergeleken met petrischalen gedurende de eerste 48 uur, maar na 72 uur daalde de gemiddelde groeisnelheid.

Echter, een aanzienlijk deel van de wortels in de kamers groeide nog steeds met vergelijkbare snelheden als wortels op platen gedurende 72 uur. Eenmaal onder de knie