Name: Generatie Fluorescent Protein Fusies Candida Species (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Leer fluorescente proteïnefusies genereren in Candida-soorten via PCR-gemedieerde genmodificatie. Deze methode zorgt voor stabiele integratie en visualisatie van gistcellen en eiwitten voor in vitro en in vivo analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken N. Dean voor het verstrekken van de oorspronkelijke mCherry FP-sequentie, M. Gerami-Nejad voor de constructie van plasmiden, B. Larson voor technische ondersteuning, en T. Heisel voor nuttig advies bij de ontwikkeling van dit project. JB werd gesteund door de European Research Council Geavanceerde Award 340.087 (RAPLODAPT). Microscopie en imaging systemen werden verstrekt door de Universiteit van Minnesota Kindergeneeskunde Stichting en de Universiteit van Minnesota Imaging Center.

1. Isoleer Template plasmiden uit E. coli <ol><li> Kweek E. coli die het plasmide template nacht in 10 ml lysogenie bouillon (LB) + 200 mg / L ampicilline (AMP) bij 37 ° C onder schudden. </li><li> Oogst cellen door centrifugeren bij 6000 xg gedurende 2 minuten. </li><li> Decanteren vloeistof, isoleren en zuiveren van DNA uit E. coli cellen door een standaard werkwijze zoals eerder beschreven in Ausubel et al. 8. </li><li> Resuspendeer DNA in Tris-EDTA (TE; 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) bij een werkende concentratie van 50-100 ng / ml. </li></ol> 2. Design Primers <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="0.5in" style="width:50px"> grondverf </td><td> primer Sequence </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 5 &#39; <strong&gt; GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTTCTAAAGGTGAAGAATTATT 3 &#39; </td></tr><tr><td> R1 </td><td> 5 &#39;GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 5 &#39;GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 &#39; </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 5 &#39;GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Primersequenties gebruikt in deze studie. Gewaagde cursieve tekst geeft homologie met de ENO1 genoomplaats, normaal lettertype gebieden homoloog aan plasmide DNA. <ol> &lt;li&gt; Design primers homoloog aan plasmide sequenties grenzend aan de cassette en wordt versterkt tot het 3&#39;-uiteinde van het doelwitgen van belang (bijvoorbeeld ENO1) om recombinatie in genomische locus van het gen te vergemakkelijken (Figuur 2 en Tabel 1) . <ol><li> Zorgen dat de voorwaartse primer sequenties overeenkomen met de laatste 70 basenparen (bp) van het gen van belang, 5&#39;-3 &#39;, minus het stopcodon, de coderende lijst handhaven, plus de eerste ongeveer 30 bp van het plasmide sequentie te geamplificeerd. Als een opmerking, de GGTGGTGGTT in elke primer is een poly-glycine verbinder zonder FP homologie. Opmerkelijk, in afwezigheid van een linker, kan er directe fusie van functionele domeinen, wat theoretisch kan leiden tot eiwit misfolding, lage opbrengst in eiwitproductie of verminderde bioactiviteit zijn. </li><li> Zorg ervoor dat de reverse primer sequenties zijn 70 bp net stroomafwaarts van gen, 3&#39;-5 &#39;, niet met inbegrip van alle gensequentie, plus de laatste voorkomendbatterijvak ongeveer 30 bp van nutritionele of geneesmiddelresistentie marker gebruikt in het plasmide. </li><li> Gebruik F1 en R1 om GFP NAT1 en YFP- NAT1 cassettes met pMG2120 en pMG2263, respectievelijk F2 en R2 genereren om mCherry- NAT1 met pMG2343 genereren. </li></ol></li></ol> 3. Genereer FP Cassettes door PCR (dag 1) <ol><li> Bereid reagentia voor PCR. Voeg een master mix (500 ui eindvolume) door toevoeging van de volgende hoeveelheden en concentraties aan een 1,5 ml buis: 50 ui PCR buffer (500 mM kaliumchloride, 100 mM Tris pH 8,0 in water), 20 gl deoxynucleotiden (dNTPs; stock mengsel nucleotiden bij 10 mM elk), 40 ui 25 mM magnesiumchloride, 20 pl gezuiverd plasmide (van ~ 50-100 ng / ul voorraad-oplossing), 10 ul elke voorwaartse en achterwaartse primer (van 10 mM stock oplossingen), 30 ul Taq polymerase (generiek, 5000 eenheden / ml) en 320 gl water. <ol><li> Aliquot 50 ul van de master mix in elk van de 10 PCR-Passendle 0,5 ml buizen. </li></ol></li><li> Plaats PCR buizen in thermocycler en voer de volgende stappen: 1 cyclus van 5 min bij 94 ° C denatureert dsDNA; 40 cycli achtereenvolgens van 45 sec bij 94 ° C, 30 sec bij 55 ° C om primers te hybridiseren plasmide matrijs-DNA, en 4 min bij 68 ° C om verlenging van DNA-producten; en 1 cyclus laatste verlenging van 15 minuten bij 72 ° C. OPMERKING: De PCR master mix en cyclusparameters moet mogelijk worden aangepast op basis van de specifieke Taq polymerase. </li><li> Pool alle producten uit de 10 PCR-reacties in een 1,5 ml buis. <ol><li> Betreft 5 pl gepoolde PCR product aan agarosegelelektroforese amplicongrootte verifiëren en een schatting van productconcentratie verkrijgen, op basis van vergelijking met een DNA ladder. Algemeen Gebruik ~ 250 ug cassette DNA in elke volgende transformatiemengsel. </li><li> DNA precipiteren door toevoeging van 50 pl 3 M natriumacetaat, gevolgd door 750 pl 95% ethanol aan de producten en incubeer ten minste 30 minbij -20 ° C </li><li> Oogst de PCR producten door centrifugeren van de buis bij 16.000 xg gedurende 10 min. Verwijder voorzichtig en gooi de supernatant en &#39;s nachts droog de pellet. Resuspendeer de gedroogde DNA-cassette pellet in 40 ul TE pH 8,0 en bewaard bij kamertemperatuur tot gebruik. </li></ol></li></ol> 4. Transformeer Candida Cellen met FP DNA Cassettes <ol><li> Op dag 1, herstellen giststam te transformeren van een 15% glycerol ingevroren (-80 ° C) voorraad door uitstrijken enkele geschraapt kristallen op gist pepton dextrose met adenine (YPAD) agar en incubeer bij 30 ° C. Na herstel van koloniegroei Inoculeer een enkele kolonie in 2 ml vloeibaar YPAD medium in een glazen kweekbuis met een ademende cap en incubeer overnacht bij 30 ° C onder roeren. </li><li> Op dag 2, verdun 300 gl overnacht gistcultuur in 50 ml vers YPAD (tot een uiteindelijke OD600 van ~ 0,2) in een 125 ml Erlenmeyer kolf met een ademende cap. Schud bij 30 ° Cvoor ~ 3 uur (tot een uiteindelijke OD 600 ~ 0,6-0,8). <ol><li> Giet de overnachtcultuur in een 50 ml conische buis en pellet van de cellen door het draaien gedurende 5 min bij 500 xg 1 in een tafelblad centrifuge. </li><li> Giet af en de bovenstaande vloeistof op de juiste weg te gooien. Resuspendeer de celpellet in 5 ml water. Re-pellet van de cellen door opnieuw centrifugeren gedurende 5 min bij 1500 xg in een tafelblad centrifuge. </li><li> Giet af en de bovenstaande vloeistof op de juiste weg te gooien. Resuspendeer de cellen in 500 pl TELiAc (TE lithiumacetaat: 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 M lithium acetaat) tijdens het overbrengen naar een 1,5 ml buis. Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten bij 3000 xg in een microcentrifuge. </li><li> Resuspendeer cellen in 250 ul TELiAc. Het totale volume inclusief de pellet moet ~ 300 pi zijn. </li></ol></li><li> Een schone (verschillende microfugebuis dan in 4.2.4), voeg 5 ul drager-DNA (10 mg / ml) en 150 pi bereid Candida cellen (van 4.2.4). Dit is de negatieve controle voor ttransformatie en. <ol><li> Een tweede schone microfugebuis, voeg 5 ul van gedenatureerd drager-DNA (dat is gekookt bij 90 ° C gedurende 10 minuten en afgekoeld tot 4 ° C), alle 40 pl van de bereide PCR product (van 3.3.1) en 150 pi bereid Candida cellen (van 4.2.4). </li><li> Incubeer de twee mengsels voor transformatie 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Aan elk transformatiemengsel buis, voeg 700 ul PLAAT mix (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 M lithium acetaat in 50% polyethyleenglycol 3350). Inverteer de buizen te mengen en incubeer ze een nacht bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Op dag 3, incubeer de transformatie mengsels bij 42 ° C gedurende 1 uur (heat shock). <ol><li> Centrifugeer de transformatie mengsels gedurende 30 seconden bij 16.000 xg in een microcentrifuge. Verwijder de bovenstaande vloeistof op de juiste weg te gooien. Resuspendeer elk van de celpellets in 150 pl water door voorzichtig pipetteren en neer om niet aan de cellen beschadigen. </li><li> Voor transformaties utilizing auxotrofe marker genen (bijv URA3), de plaat elk gehele mengsel door pipetteren de oplossingen op het geschikte selectieve media agar (bv zonder uridine) en verdeel het mengsel gelijkmatig met steriele glazen kralen. </li><li> Voor transformaties gebruikmaking van de nourseothricin resistentiemarkergen (NAT1), zoals hier beschreven, plaat transformatie mengt eerst op non-selectieve YPAD agar en incubeer bij 30 ° C gedurende 6-12 uur. Deze stap helpt in cel herstel, na de heat shock, voordat nourseothricin spanning wordt toegepast. </li><li> Na gedeeltelijke groeiherstel, replica plaat de Candida cellen op YPAD met 400 ug / ml nourseothricin. Voor transformaties gebruik voedings-markers (bijv URA3) Dit tussenproduct plating stap niet noodzakelijk en cellen direct uitgeplaat op selectieve media gist (bv YPAD zonder uridine) zoals beschreven in 4.4.2. LET OP: Als de transformatie succesvol is, colOnies verschijnt binnen 1-3 dagen (potentieel tot vijf dagen van uitgroei van selectie op nourseothricin bevattende agar). Geen kolonies moeten verschijnen op platen te verspreiden met de transformatie mengsels bevattende drager DNA alleen (negatieve controle). </li></ol></li><li> Voor auxotrofe en nourseothricin merkerselectie, strook vermoedelijke transformanten als enkele kolonies op verse selectieve media agarplaten en geïncubeerd bij 30 ° C gistcellen die kunnen worden gescreend op succesvolle bouw van FP fusies propageren. </li><li> Screen transformanten voor de juiste integratie van de tagging cassette (zie Representatieve resultaten voor een gedetailleerd voorbeeld). Als het gen van belang tot expressie wordt gebracht in voldoende hoeveelheden kunnen hele kolonie fluorescentie zodanig plaatsvinden dat er potentiële kandidaat integranten onder toepassing van een plaat beeldvormingssysteem met fluorescentiedetectie vermogen te detecteren. <ol><li> Raadpleeg vermoedelijke integranten met PCR met gebruik van primers die homoloog zijn aan sequenties outside van de regio integratie fusie met het doelwitgen te bevestigen. </li><li> Overweeg daarnaast Western blot analyse om de expressie en de grootte van het fusie-eiwit te bepalen, en door fluorescentie microscopie van enkelvoudige cellen voor visuele bevestiging van eiwit lokalisatie, indien bekend. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bendel, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+and+epithelial+adhesion+in+the+pathogenesis+of+neonatal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis.</a> Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).</li>
<li>Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassettes+for+PCR-mediated+construction+of+green%2C+yellow%2C+and+cyan+fluorescent+protein+fusions+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans.</a> Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).</li>
<li>Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+cassettes+for+epitope+and+fluorescent+fusion+proteins+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans.</a> Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).</li>
<li>Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+function+in+clinical+C.+albicans+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates.</a> Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).</li>
<li>Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassettes+for+the+PCR-mediated+construction+of+regulatable+alleles+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans.</a> Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).</li>
<li>Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+gene+modification+strategy+for+construction+of+fluorescent+protein+fusions+in+Candida+parapsilosis%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis.</a> Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).</li>
<li>Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassettes+for+PCR-+mediated+gene+tagging+in+Candida+albicans+utilizing+nourseothricin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance.</a> Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Wiley. New York. (1995).</li>
<li>Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+hypothesis+testing+with+Candida+albicans+through+gene+disruption+with+short+homology+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions.</a> J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).</li>
<li>Pulver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rsr1+focuses+Cdc42+activity+at+hyphal+tips+and+promotes+maintenance+of+hyphal+development+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).</li>
<li>Falgier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+species+differ+in+their+interactions+with+immature+human+gastrointestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells.</a> Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).</li>
<li>Nosek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+the+pathogenic+yeast+Candida+parapsilosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis.</a> Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).</li>
<li>Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+the+pathogenic+yeast+Candida+parapsilosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis.</a> Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).</li>
<li>Benjamin, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+candidiasis+among+extremely+low+birth+weight+infants%3A+risk+factors%2C+mortality+rates%2C+and+neurodevelopmental+outcomes+at+18+to+22+months%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months.</a> Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).</li>
<li>Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26444731">Invasive Candidiasis.</a> N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Constructie van epitoop-gemerkte sequenties in Candida soort, volgens de PCR-gemedieerde genmodifcatie strategie hierboven beschreven kan worden samengevat als een drie-stappen. Eerst wordt een cassette door PCR dat codeert voor zowel de gewenste integratie en gebieden homoloog aan de plaats van insertie in het gist genoom. Ten tweede worden de gistcellen te transformeren chemisch competente met lithium acetaat en co-geïncubeerd met de cassette uit. Ten derde worden de cellen uitgeplaat op selectieve media om t...

Candida species zijn commensaal schimmels die de darm- en genito-urinaire stukken alle mensen koloniseren. Onder omstandigheden van immunodeficiëntie, zoals die optreden bij vroeggeboorte of immunosuppressieve effecten van behandelingen voor kanker, kan Candida species opportunistische pathogenen worden. Van de Candida species, Candida albicans is de meest voorkomende schimmel kolonisator en doet de meerderheid van invasieve schimmelinfecties. Andere Candida soorten zoals C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis en C. kruseii ook leiden tot ernstige infecties bij immuungecompromitteerde patiënten, met enkele vertonen intrinsieke weerstand tegen veelgebruikte anti-schimmel antibiotica zoals fluconazol en amfotericine B. Vandaar infecties met sommige van deze soorten worden vaker waargenomen, vooral bij patiënten die profylactisch behandeld met anti-schimmelmiddelen. Zelfs met de juiste en tijdige eennti-schimmel behandeling, invasieve Candida infecties blijven geassocieerd met significante morbiditeit en mortaliteit 1. Gezien het belang van Candida soorten menselijke gezondheid, is er een behoefte aan direct beschikbare moleculaire hulpmiddelen die de studie en onderzoek naar hun pathogenese mechanismen mogelijk. Een belangrijk instrument waarmee onderzoekers te visualiseren en te kwantificeren microbiële cellen en de eiwitten die ze uiten is FP fusietechnologie. Polymerase kettingreactie (PCR) gemedieerde genetische modificatie, zoals beschreven in dit document, kan de constructie van fusies tussen FP sequenties en Candida eiwit coderende sequentie van belang in de genomische locus. Stabiele integratie van het construct vergemakkelijkt de analyse van eiwitexpressie en eiwit lokalisatie dynamiek. Plasmiden die FP sequenties geoptimaliseerd voor expressie in Candida albicans en die kunnen worden gebruikt in de PCR-gemedieerde gene modificatie strategie eerder geconstrueerd 2, 3, 4, 5. Plasmiden FP transformatie &quot;cassettes&quot;: een FP-sequentie gekoppeld aan een nutritionele merker gen dat de transformatie van C. albicans en C. parapsilosis 2, 3, 4, 5, 6, 7 vergemakkelijkt. Momenteel verkrijgbare plasmiden bevatten verschillende selecteerbare merkergenen voeding (URA3, HIS1, ARG4) voor transformatie van auxotrofe stammen en dominante resistentie merker (NAT1), die transformatie van klinische stammen ontbreekt auxotrophies vergemakkelijkt. Bovendien plasmiden opties voor maximaal vier verschillende FP sequenties (groen [GFP], yellow [YFP], cyaan [GVB] en kersen [mCherry]) en ofwel een ADH1 terminatiesequentie voor de bouw van carboxy-terminus eiwitfusies of een promotersequentie voor de bouw van amino-terminus eiwitfusies. Primers zijn ontworpen met homologie met het plasmide-DNA rond de FP cassette. Bovendien, de primers bevatten ook 5&#39;-extensie sequenties waarop homologie met het gist-gen van belang te hebben, wat de integratie van de cassette vergemakkelijkt in de genomische locus via homologe recombinatie (Figuur 1). Genspecifieke FP cassettes worden gegenereerd door PCR en vervolgens getransformeerd in Candida cellen die voor opname van DNA door behandeling met lithium acetaat. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55333/55333fig1.jpg" /> Figuur 1: Diagram van hoe FP reeks fusies worden gegenereerd in Candida soorten. (A) Plasmide DNA includes een FP-sequentie en een sequentie die codeert nourseothricin weerstand (NAT1). Relatieve locaties van de Vooruit (FWD) en achteruit (REV) primers worden getoond, met zwarte delen van de primers met vermelding van het gebied van homologie op het plasmide sequentie en de paarse delen aanduiding van de gen-specifieke homologie regio of primer extensie. (B) FP cassettes worden omgezet in Candida en te integreren binnen de ENO1 genomische locus via homologe recombinatie (stippellijnen). (C) Resulterend FP fusie sequentie aan het 3&#39;-uiteinde van ENO1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55333/55333fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Hierin geven we een voorbeeld van eiwitfusie (Eno1-FP) constructies in Candida species. We maken gebruik van tagging plasmiden die de NAT1 transformatie marker-gen, samen met sequenties die coderen voor GFP, YFP, ofmCherry (Figuur 2). Deze plasmiden worden gebruikt in combinatie met primers in PCR te genspecifieke cassettes die fusie van KP vergemakkelijken het 3&#39;-einde van ENO1 ontwikkeld, waardoor expressie van Eno1 gefuseerd aan KP bij de carboxy-terminus. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55333/55333fig2.jpg" /> Figuur 2: Kaarten van FP-cassette die plasmiden. Voorwaartse (F) en reverse (R) primers gebruikt om de cassettes van de plasmiden worden aangeduid met de relatieve locatie van hun homologie met de plasmiden. Primer sequenties zoals vermeld in tabel 1. F1 en R1 werden gebruikt om de pYFP- NAT1 cassette genereren. Het plasmide dat de YFP- NAT1 cassette (pMG2263) is identiek aan pMG2120 behalve YFP in plaats van de GFP sequentie. Cassette maten: GFP-NAT1, 3,7 kbp; mCherry- NAT1, 3,2 kbp; YFP- NAT1, 3.7 kbp. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Gerami-Nejad, et al. 4 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55333/55333fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>100 W kwikstoflamp</td><td>CHIU Technical Corporation</td><td>M-100T</td><td></td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Carrier DNA</td><td>Ambion</td><td>AM9680</td><td>Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Photometrics</td><td>CoolSNAP HQ</td><td></td></tr><tr><td>Conische buis</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Rotator voor kweekbuisjes</td><td>New Brunswick</td><td>2013923</td><td>TC-8, of elke Rotator voor Kweekbuisjes</td></tr><tr><td>Deoxynucleotiden (dNTP) PCR kwaliteit</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorfbuisjes</td><td>Eppendorf</td><td>022363719, 022363212</td><td>0.5 ml, 1.5 ml</td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolf</td><td>Fisher Scientific</td><td>7250089</td><td>125 ml</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Vrieskast (-80 &deg;C)</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>ULT-1386-9-V</td><td>Revco Ultima II</td></tr><tr><td>GFP, YFP en Texas Red Filter Sets</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td>49002, 86004v2, 49008</td><td></td></tr><tr><td>Glazen kweekbuisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1496126</td><td>75 mm</td></tr><tr><td>HRP geiten anti-muis antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2005</td><td></td></tr><tr><td>HRP geiten anti-konijn antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2301</td><td></td></tr><tr><td>Incubator (30 &deg;C)</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetaat</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeen Broth (LB) Medium</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon</td><td>E600</td><td>Nikon Eclipse E600</td></tr><tr><td>Microscoopbeeldanalysesoftware</td><td>Universal Imaging Corporation</td><td>6.3r7</td><td>MetaMorph Software Series 6.3r7</td></tr><tr><td>Muis anti-GFP antilichaam</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td></td></tr><tr><td>Nourseothricine</td><td>Fisher Scientific</td><td>50997939</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>9700</td><td>GeneAmp PCR System</td></tr><tr><td>PCR buisjes</td><td>BioExpress, GeneMate</td><td>T-3035-1</td><td>0.2 ml</td></tr><tr><td>Polyethyleen Glycol 3350</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-mCherry antilichaam</td><td>BioVision</td><td>5993-100</td><td></td></tr><tr><td>Koelkast (4 &deg;C)</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge voor op tafel</td><td>Labnet</td><td>Z 400</td><td>Hermle Z 400</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex Genie 2</td></tr><tr><td>Gist Extract Peptone Dextrose (YPD) Medium</td><td>Wat dan ook</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie fluorescent protein fusies<em&gt; candida</em&gt; species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Candida species, gangbare kolonisators van de darmen en urogenitalis, de oorzaak van de meeste invasieve schimmelinfecties bij mensen. Aldus worden moleculaire en genetische instrumenten om de studie van de pathogenese mechanismen te vergemakkelijken. PCR-gemedieerde gen modificatie een eenvoudige en snelle manier van epitoop-gemerkte eiwitten te genereren om detectie te vergemakkelijken. In het bijzonder, fluorescerend eiwit (FP) fusies zijn krachtige instrumenten die visualisatie en kwantificering van zowel gistcellen en eiwitten mogelijk met behulp van fluorescentie microscopie en immunoblotting, respectievelijk. Plasmiden die FP coderende sequenties, samen met nutritionele merker genen dat de transformatie van Candida species te vergemakkelijken, zijn gegenereerd ten behoeve van FP constructie en expressie in Candida. Hierin presenteren we een strategie voor het construeren van een fusie-FP in een Candida species. Plasmiden die de nourseothricin resistantnce transformatie markergen (NAT1) samen met sequenties voor zowel groen, geel of kersen FP (GFP, YFP, mCherry) worden gebruikt tezamen met primers die genspecifieke sequenties in een polymerasekettingreactie (PCR) worden uitgevoerd, om FP cassette genereren . Deze genspecifieke cassette in staat om te integreren in het 3&#39;-uiteinde van het corresponderende gen-locus via homologe recombinatie. Succesvolle in-frame fusie van het KP sequentie in het gen locus van belang genetisch gecontroleerd, gevolgd door analyse van fusie-eiwit expressie door microscopie en / of immuno-detectiemethoden. Bovendien, in het geval van sterk tot expressie gebrachte eiwitten, succesvolle fusies kunnen worden gescreend op de eerste plaats door fluorescentie beeldvorming technieken.

Als voorbeeld gebruikten we de hierboven beschreven protocol voor GFP en mCherry fusies construeren Eno1 in C. parapsilosis laboratoriumstam. Elke vermoedelijke transformant werd initieel opnieuw uitgestreken voor groei. In dit voorbeeld, omdat de resulterende fusieproteïne hoog tot expressie (enolase) en KP zijn licht, konden we transformanten door fluorescentie microscopie screenen voor het uitvoeren van diagnostische PCR (figuur 3) 6. ...

PCR-gemedieerde genetische modificatie kan worden gebruikt voor fluorescent proteïne fusies in Candida soorten die visualisatie en kwantificering van gistcellen en eiwitten vergemakkelijkt genereren. Hierin presenteren we een strategie voor het construeren van een fluorescerend eiwit fusie (Eno1-FP) Candida parapsilosis.

Generatie Fluorescent Protein Fusies<em&gt; Candida</em&gt; Species

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van fluorescerende eiwitfusies in Candida-soorten door gebruik te maken van PCR-gemedieerde genmodificatie om een eiwitcoderende sequentie op de natuurlijke genomische locus te labelen, waardoor een stabiele integratie en expressie van sequenties over tijd wordt gegarandeerd. Deze methode kan worden gebruikt om fluorescerend gelabelde Candida-stammen en eiwitten te genereren, wat hun identificatie en kwantificering vergemakkelijkt voor zowel in vitro als in vivo analyses. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel is in vergelijking met conventionele kloonmethoden en de mogelijkheid biedt om transformanten te screenen via fluorescentiemicroscopie op kolonie- of individueel celniveau.Hoewel deze methode aanvankelijk werd ontwikkeld om eiwitten in Candida albicans te markeren, kan deze ook worden toegepast op andere gistsoorten, zoals Candida parapsilosis, zoals beschreven in dit protocol. Over het algemeen hebben mensen die nieuw zijn met deze methode moeite om transformanten te verkrijgen die de correcte cassette-integraties in de beoogde genlocus bevatten. Dit probleem kan worden geminimaliseerd door de condit

generation-of-fluorescent-protein-fusions-in-candida-species

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Door het gebruik van een spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging-systeem, zijn pixel-niveau kaarten van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiëntie verkregen voor cellen die membraanreceptoren verondersteld dat homo-oligomere complexen vormen. Van de efficiëntie kaarten FRET, we zijn in staat om stoichiometrisch informatie over het oligomeer complex schatting in studie.

In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

Biolistische transformatie een methode om stabiele integratie van DNA genereren in het genoom van de opportunistische pathogeen Cryptococcus neoformans via homologe recombinatie. We zullen biolistische transformatie van een construct, waarin het gen codeert acetaat kinase gefuseerd met de fluorescerende tag mCherry in C. neoformans is aangetoond.

Biolistische Transformatie van een TL Tagged Gene in de Opportunistische schimmelpathogeen<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

We bieden een reproduceerbare basismethode voor de langetermijnmicroscopie van de seksuele levenscyclus van splijtingsgist. Met kleine aanpassingen zoals beschreven, stelt het gepresenteerde protocol onderzoekers in staat zich te concentreren op verschillende stappen van het reproductieproces.

Microscopie van Fission Yeast Sexual Lifecycle

Het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans is een uniek eencellige model voor de visuele in vivo analyse van biogenese van DOVO gepolariseerd. Dit protocol beschrijft een combinatie van standaard genetische/RNAi en imaging benaderingen, aanpasbaar voor de identificatie en karakterisering van moleculen eencellige tubulogenesis en apicale membraan en lumen biogenese regisseren.

Het kanaal Excretory C. elegans als een Model voor de intracellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van organellen in één cel: labelen door GFP-fusies, RNAi interactie scherm en beeldvorming

Dit artikel beschrijft protocollen voor de beoordeling van het effect van fluorescente proteïnen op de aggregatie en toxiciteit van de expansie van de misfolded polyglutamine voor de snelle evaluatie van een nieuw genfunctieonderzoek TL proteïne in het kader van fluorescerende verslaggevers.

Effect van fluorescente proteïnen op Fusion Partners Polyglutamine Toxicity Tests met gist

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Dit artikel presenteert een kleinschalig plasmamembraanisolatieprotocol voor de karakterisering van Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) eiwit Cdr1, overexpressie in Saccharomyces cerevisiae. Een protease-breekbare C-terminal mGFPHis dubbele tag met een 16-residu linker tussen Cdr1 en de tag is ontworpen om de zuivering en detergent-screening van Cdr1 te vergemakkelijken.

Kleinschalige plasmamembraanvoorbereiding voor de analyse van Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Dit protocol beschrijft een experimentele methode en data-analyse workflow voor splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT &amp; RUN) in de menselijke schimmelpathogeen Candida albicans.

Genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties bij Candida albicans: een uitgebreide CUT &amp; RUN-methode en data-analyseworkflow

Leer fluorescente proteïnefusies genereren in Candida-soorten via PCR-gemedieerde genmodificatie. Deze methode zorgt voor stabiele integratie en visualisatie van gistcellen en eiwitten voor in vitro en in vivo analyses.

Generatie Fluorescent Protein Fusies

Meer video's verkennen