Name: Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Leer live-cell imaging van interkinetische nucleaire migratie in zebravis retina-explantaten met behulp van multiphoton-microscopie. Deze methode maakt real-time observatie van celgedrag tijdens regeneratie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij waarderen de steun van William Archer en de Notre Dame Integrated Imaging Facility. Speciale dank zijn gericht op de Freimann Life Sciences technici voor hun voortdurende hulp en hun zorg en verzorging van de zebravis. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Eye Institute van de NIH om DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) en het Centrum voor zebravis Research, Universiteit van Notre Dame, de Notre Dame, IN.

Opmerking: zebravis zijn gerezen en onderhouden in de Notre Dame zebravis faciliteit in de Freimann Life Sciences Center. De in dit manuscript beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Universiteit van Notre Dame Animal Care en gebruik Comite en zijn in overeenstemming met de verklaring voor het gebruik van dieren in een visioen onderzoek door de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde. 1. Oplossingen <ol><li> Bereid 70% ethanol aan de weefselkweek kap en alle apparatuur / reagentia die worden overgebracht in de weefselkweek kap steriliseren. </li><li> Voeg 2 ml 2-fenoxyethanol tot 1 L van het systeem water (1: 500 2-fenoxyethanol). </li><li> Bereid 0,1 mM NaHCO 3, pH 8,0. Gebruik een 10 ml spuit en een 0,2 urn poriegrootte spuitfilter aan de oplossing in een steriele weefselkweek kap steriliseren. LET OP: NaHCO3 wordt gebruikt om efficiënt te verspreiden van de cellen en weefsels lijm over het dekglaasje oppervlak van fluorodishes (ziestap 3.2). </li><li> Bereid 1,0 M CaCl2 en 1,0 M MgCl2. Steriliseren met een 10 ml spuit en 0,2 urn poriegrootte spuitfilter gesteriliseerd in een weefselkweek kap. </li><li> Ter voorbereiding Hank&#39;s-gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), voeg steriele CaCl2 en MgCl2 tot steriele 1x HBSS zonder Ca2 + / Mg2 +, zonder fenolrood bij een uiteindelijke concentratie van 1 mM elk. Werken in een steriele omgeving. </li><li> Om kweekmedium te bereiden, meng 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) zonder fenol rood, 25% HBSS met CaCl2 en MgCl2 (zie paragraaf 1.4), 25% paardenserum (HS), 10 eenheden / ml penicilline, en 10 ug / ml streptomycine. Werken in een steriele omgeving. LET OP: Vermijd medium dat fenolrood als het autofluoresces, waardoor signaal-ruis verhouding van invloed zijn. 23 </li><li> Bereid 10 ml van 1% laag smeltpunt agarose in 1x MEM zonder fenol rood. Smelt agarose / 1x MEM met behulp van een Microwave. Bereid kleine hoeveelheden agarose (bijvoorbeeld 10 ml) repetitieve opwarmen zal ionenconcentratie door vocht verdampen veranderen. </li><li> Vóór het kweken steriliseren 1,5 ml microcentrifugebuizen autoclaaf. </li></ol> 2. Licht-schade Paradigm <ol><li> Dark-adaptatie <ol><li> Plaats 2-3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebravis (of andere transgene zebravis of interest) bij 6-14 maanden oud in een omgeving zonder licht voor 14 d. Zie referentie 2, 6, 24, 25 voor verdere details. </li></ol></li><li> Plaats de tank met 2-3-dark aangepast transgene zebravis in het systeem water tussen twee TL-lampen die licht van 2800 lux 2, 6, 24, 25 uit te stoten. </li&gt; <li> Expose zebravis constante intens licht voor 35 uur. Tijdens de blootstelling aan licht, verzekeren dat de temperatuur van het water wordt gehouden tussen 31-33 ° C. </li></ol> 3. Voorbereiding voor het kweken van (Op de Dag van de Retina Isolation) <ol><li> Met behulp van 70% ethanol, steriliseren de weefselkweek kap en de onderdelen / gereedschappen die worden overgebracht in de weefselkweek kap (bijvoorbeeld kolven met MEM en HBSS, pipetten, steriele pipet tips, enz.). </li><li> Bereiding van fluorodishes <ol><li> Coat één fluorodish voor elke retina met cellen en weefsels lijm (zie tabel of Materials). </li><li> Verdun de cellen en weefsels lijm 0,1 mM NaHCO 3 een eindconcentratie van 70 ug / ml, voeg 50 ul aan elk fluorodish en verspreid de oplossing over het midden van de fluorodish met 200 pi pipetpunt (ongeveer 1-1,2 cm diameter ). </li><li> Incubeer de beklede fluorodishes gedurende 1-3 uur bij kamertemperatuur; (Alternatief, uitbroeden O / N bij 4 ° C). </li><li> Verwijder de oplossing en spoel 3x met 500 ul van 1 x MEM voor elke wasbeurt. Om de gecoate fluorodishes uitdrogen te voorkomen, houden ze in MEM totdat netvlies explantaten zijn gemonteerd. </li></ol></li><li> Bereid kweekmedium zoals beschreven in stap 1.6. Het kweekmedium kan worden opgeslagen gedurende 1 week bij 4 ° C. </li></ol> 4. Isolatie en kweken van retinale explantaten OPMERKING: Het protocol is hieronder beschreven voor de isolatie van de dorsale netvlies, de retina regio die hoofdzakelijk wordt door de laesie beschreven licht-schade paradigma. Derhalve-schade geïnduceerde proliferatie en de bijbehorende Bij interkinetic nucleaire migratie optreden in de dorsale netvlies. Echter, de isolatie procedure ingesteld netvlies regio bereid volgens de specifieke eisen van de onderzoeker / vraagstelling. <ol><li> Euthanaseren een licht beschadigde transgene zebravis eenta tijd in 1: 500 2-fenoxyethanol. </li><li> MEM verwijderen uit een fluorodish met 1000 pi pipet zodat slechts een dunne film van vloeibaar blijft. </li><li> Breng de zebravis op een droge papieren handdoek, verwijder het oog met een gebogen paar Dumont pincet (pincet # 5, hoek van 45 °) en breng het op de fluorodish. </li><li> Met behulp van een stereomicroscoop, oriënteren het oog met de pupil op het dekglas van de fluorodish zodat de achterkant van het oog met de oogzenuw zichtbaar (figuur 1D). </li><li> Met een paar McPherson-Vannas schaar verwijder de oogzenuw, snoeien dicht bij de achterkant van het oog. Bovendien, verwijdert bindweefsel langs de buitenkant van het oog. </li><li> Houd het oog tussen de nasale en temporale zijde met een paar # 5 tang tijdens het maken van een snede in de optische steel door doorboren met één schaarblad door de lamina cribrosa en snijden langs zowel de nasale en temporale zijde van het oog (zie figuur 1E , gesegmenteerde line). </li><li> Met behulp van twee paren van # 5 tang, één voor het vasthouden van de dorsale zijde van de retina en het andere paar op de ventrale scheiden van de dorsale netvlies, trekt het weefsel. LET OP: Het is raadzaam om de dorsale netvlies oriënteren, zodat de lens en de ganglion cellaag het gezicht van de dekglaasje terwijl de sclera naar boven wordt geconfronteerd. </li><li> Verwijder de sclera uit de dorsale netvlies met een paar van # 5 tang, terwijl de lens die is verbonden met de retina met een tweede paar van # 5 tang (Figuur 1H, I). </li><li> Om de lens te verwijderen, gebruikt McPherson-Vannas schaar en achter de lens te snijden zonder beschadiging van het netvlies (figuur 1 I, J). Soms is de lens scheidt in stap 4,7. In dit geval verwijdert de sclera voorzichtig met een tang die door het netvlies een snijrand met een tweede paar van # 5 tang. </li><li> Verwijder het glasvocht tijdens het verwijderen van de lens zonder beschadiging van de retina. Plat het netvlies met de ganglion cellaag geconfronteerd met het deksel slipvan de fluorodish (figuur 1L, M). </li><li> Omring het netvlies met 10 pl van 1% laag smeltpunt agarose en laat de agarose stollen. </li><li> Let dat de vloeistof agarose het netvlies niet opneemt als ook een geringe verhoging kan het vermogen om diep concentreren in het weefsel beïnvloedt. Als tillen wordt waargenomen, gebruik dan een pipet agarose te verwijderen. Laat resterende agarose set voordat u meer toe te voegen. </li><li> Herhaal stap 4.12 meerdere malen voor het toevoegen van 1% laag smeltpunt agarose om de hele fluorodish dekken. Nadat de agarose is gestold, voeg 1,5 ml kweekmedium. </li><li> Handhaaf de retinale explantaatkweek in een 5% CO2 / lucht milieu ingesteld op 32 ° C gedurende ongeveer 12 uur om de retina te herstellen van de stress die de isolatiewerkwijze. Stel de temperatuur tot 32 ° C te netvliezen bij dezelfde temperatuur als het licht behandeld zebravis handhaven (zie stap 2.3). </li></ol> 5. Multiphoton Microscopie Tabel Materials), een 40X Apo interlokale water immersie objectief (NA 1,15), een galvanometer scanner en een klimaatkamer dat een insert van vier 35 mm petrischalen bevat. De beelden werden verkregen met een niet-descanned detector (R-NDD). <ol><li> Voorafgaand aan beeldvorming evenwicht de klimaatkamer een 5% CO2 / lucht atmosfeer te komen. Zorg ervoor dat lege petrischaaltjes in de houder worden geplaatst om lekkage van gas in de kamer te vermijden. </li><li> Schakel het microscopiesysteem. </li><li> Zodra de klimaatkamer wordt in evenwicht gebracht, voeg brekingsindex vloeistof op het 40X Apo lange afstand water immersie objectief (NA 1.15). OPMERKING: De brekingsindex vloeistof met optische eigenschappen vergelijkbaar met water wordt de verdamping van water tijdens langdurige imaging voorkomen. </li><li> plaats grieporodishes met retinale explantaten in de kamer. Met behulp van helderveld licht, de positie van het monster in het lichtpad en breng de middenregio van de dorsale netvlies in het vlak van focus. </li><li> Met GFP epifluorescerende licht te concentreren op GFAP: nGFP -positieve Müller glia kernen (Figuur 2A, C). LET OP: Als explantaten niet plat zijn of agarose opgehoopt onder de explantatie zijn gemonteerd, zal het moeilijk zijn om zich te concentreren op de GFAP: nGFP-positieve kernen of ze zullen vaag fluoresceren. <ol><li> Controleer of verhuizen naar een andere regio binnen dezelfde retinale explantatie zal de focus probleem te overwinnen. Anders naar een andere netvlies explantaat. </li></ol></li><li> In de afbeelding acquisitie software, opent u de &#39;A1 MP GUI&#39;, de &#39;TiPad&#39;, de &#39;A1 Compact GUI&#39; en de &#39;ND overname&#39; ramen. Voor multiphoton imaging, ervoor te zorgen dat de optie &#39;IR NDD&#39; is gekozen in de &#39;A1 Compact GUI&#39;. </li><li> In de &#39;setting &#39;veld, selecteert u IR-DM voor de 1 e dichroïsche spiegel en kies de band pass filter 525/50 om GFP fluorescentie te verwerven. </li><li> Schakel de IR-laser in het venster label &#39;A1MP GUI&#39;. Het zal een paar minuten duren voordat de laser klaar te zijn. Stel de golflengte van 910 nm tot GFP fluorescentie prikkelen en lijn de laser door op de &#39;Auto alignment&#39; knop in het venster &#39;A1 MP GUI&#39;. </li><li> Zorg ervoor dat de ruimte en apparatuur verlichting zijn uitgeschakeld of bedekt vóór het openen van de sluiter in de &#39;A1 MP GUI&#39; om overbelichting van de fotomultiplicator buis te voorkomen. Om geluidsoverlast te beperken, het huis van de microscoop in een donkere omgeving. </li><li> Acquire beelden van een gezichtsveld van 300 x 300 pixels, met een zoom van twee en een pixel verblijftijd van 4,8 ps / pixel. Ruwweg het opzetten van de laser macht door het veranderen van de &#39;overname gebied&#39; in de &#39;A1MP GUI en de winst in het venster&#39; A1 Compact GUI &#39;. </li><li> Instellen van de z-stack <ol><li> Focus op de ganglion cellaag aan de top brandvlak van de z-stack in de set &#39;Z&#39;-deelvenster in het&#39; window ND overname &#39;. Aantal GFAP: nGFP -positieve cellen bevinden zich gewoonlijk in het ganglion cellaag, waardoor de basale beperking van de retina (Figuur 2A, D) te identificeren. </li><li> Beweeg het brandvlak door het niveau van de ONL (Figuur 2A, B), die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van zwak gelabeld GFAP: nGFP -positieve cellen die zijn rond en vergroot ten opzichte van hun tegenhangers in de INL (Figuur 2A, C) . </li><li> Stel dit vlak als de onderkant van de z-stack. Zorg ervoor dat de gehele ONL zal worden afgebeeld (Figuur 2A, B). </li><li> Als ze last hebben focal plane verschuivingen die vereisen opnieuw aanpassen tijdens de beeldvorming periode, dubbelklikt u op de middelste positie in de &#39;z&#39; subwindow toe te wijzen als &#39;thuis&#39; positie. Wissel naar &#39;symmetrische wijze gedefinieerd&#39;en klik op &#39;relatief&#39;. </li><li> De grootte z-stap tussen 0,7 tot 1 pm. </li></ol></li><li> Z-intensiteit correctie: <ol><li> Solliciteer z-intensiteit correcties om te compenseren voor het verlies van pixel intensiteit als gevolg van lichtverstrooiing bij beeldvorming in diepe lagen van het weefsel. </li><li> Voor het instellen van de correctie, opent u het venster &#39;z-intensiteit correctie&#39;. Om de &#39;z-stack range&#39;, kies &#39;Uit ND&#39; in te stellen. </li><li> Op de bodem brandpuntsvlak het venster &#39;z-intensiteit correction&#39; (in dit geval overeen met de ganglion cellaag) en stel de laserintensiteit ( &#39;aankoop oppervlakte in de&#39; A1MP GUI &quot;) en versterking (A1 Compact GUI ). </li><li> Klik op de pijl naast het &#39;z-waarden&#39; in het venster &#39;z-intensiteit correctie&#39; om de instellingen die vervolgens onder &#39;apparaat instellingen&#39; in het venster &#39;z-intensiteit correctie&#39; voor de gekozen focal plane worden getoond bevestigen. </li><li> Herhaal deze procedure voor het midden eennd top vliegtuigen, het verhogen van het laservermogen en gewin. Extra focale vliegtuigen kunnen indien nodig worden toegevoegd. Zie Tabel 1 voor de specifieke laser en versterkingsinstellingen voor experimenten in Figuren 2-4. </li><li> Stel de &#39;overname gebied&#39; in het venster &#39;A1 MP GUI&#39;. Vermijd selecteren van een aankoop oppervlakte groter dan 15 en een toename hoger dan 126 aan het begin van de beeldvorming te omzeilen fotobleken en verhoogde geluidsniveaus. LET OP: Als lasers en fotomultiplicatorbuizen verschillen tussen microscopie systemen testen laser en gain-instellingen om optimale beeldvorming voorwaarden voor de set-up, terwijl het vermijden fotobleken microscoop te verkrijgen. </li><li> Kies &#39;relatieve intensiteit correctie&#39; in het venster &#39;z-intensiteit correctie&#39;. </li></ol></li><li> In de subwindow &#39;tijdreeks&#39; in het venster &#39;ND acquisitie&#39;, stelt de duur tot 8 uur en het interval om &#39;zonder vertraging&#39;. Dan, zorg ervoor dat op de &#39;Run z-correctie&#39; in thij &#39;z-stack&#39; sub-venster in de &#39;ND overname&#39; window-knop om de 3-D tijdreeksen te verwerven. </li><li> Handhaaf netvlies explantaten bij een temperatuur van 27-29 ° C gedurende de looptijd van het beeld acquisitie. </li><li> Gedurende de gehele afbeelding overname, indien nodig, bijstellen het vermogen en winst in om de beeldkwaliteit voor post-imaging analyse te handhaven. Voor aanpassingen uit te voeren stappen 5.11.2 - 5.11.4. </li><li> Als de focal plane verschuivingen, pauzeren of stoppen met de run en voer stap 5.11 opnieuw. LET OP: Als relatieve z-correctie &#39;in stap 5.12.7 werd gekozen en stap 5.11.4 werd uitgevoerd zou het niet nodig zijn om macht en gewin niveaus passen, tenzij uitgebreide fotobleken opgetreden. </li></ol> 6. Analyse van Velocity <ol><li> Pak de tijd, het instellen van een &#39;regio van belang&#39; op de afbeelding. Gebruik de &#39;tijdmeting&#39; gereedschap en de uitvoer van de tijd waarden naar een spreadsheet. </li><li> Crop een regio die een di bevatviding GFAP: nGFP -positieve kern. </li><li> Kies de bijgesneden regio, zodat deze ten minste één kern die INM niet ondergaan om een ​​referentiepunt ingesteld vervolgens de afstanden die de scheidslijn kern gemigreerd ten opzichte van de basale INL meten bevat. OPMERKING: Om een ​​kern die in de basale INL blijft ook kiest, het helpt om een ​​3-D reconstructie van de tijdreeksen te bereiden. </li><li> Alternatief, indien een GFAP: nGFP-positieve cellen waargenomen in de ONL gehele acquisitieperiode Gebruik een verticale lijn van vaste lengte, beginnende in de ONL kern naar het basale INL om een referentiepunt te identificeren. </li><li> Met de functie &#39;Show plakjes view&#39;, het genereren van orthogonale projecties. Vervolgens wijzigt u de modus van &#39;slice&#39; naar &#39;maximale intensiteit projectie&#39;. </li><li> Schakel de &#39;xy&#39; uitzicht op de orthogonale maximale projectie. Afhankelijk van de richting waarin de migrerende / delen nucleus is het best zichtbaar, eenLSO uit te schakelen ofwel de &#39;xz&#39;- of &quot;yz&#39;-view. </li><li> Klik op de resterende afbeelding met de rechter muisknop en haal de &#39;XZ&#39; of &#39;yz&#39; beeld-serie met de&#39; functie Maak nieuw document vanuit deze visie &#39;. Indien nodig, het beeld te roteren. </li><li> Met de functie &#39;handmatige meting &quot;, trek een horizontale lijn over de afbeelding op het onderste niveau van de kern die overblijft in de basale INL en niet INM ondergaan (= referentiepunt; figuur 4A - E, rode horizontale lijn). </li><li> Meet de afstand tussen de referentie lijn en de basale punt van de migrerende kern van de tijdreeks met behulp van de &#39;line meting&#39; instrument in de analyse software (zie Figuur 4A - E). </li><li> Zodra de nucleaire envelop afbreekt, het meten van de basale positie van de soma wanneer deze identificeerbaar zijn naar aanleiding van de diffusie van GFP in de gehele cel. </li><li> Met behulp van een spreadsheet-software, plot van de afstand een nucleus gemigreerd tegen de tijd verstreek (Figuur 4F). <ol><li> Om de apicale migratie snelheid (v a), grafiek van de afgelegde kilometers voor de periode vóór de nucleaire envelop afbraak optreedt (figuur 4G) te bepalen. </li><li> Selecteer de gegevens serie binnen de grafiek met de rechtermuisknop op de muis en plaats een lineaire regressie curve inclusief de bijbehorende functie &#39;y = mx + c&#39;. De helling &#39;m&#39; in de functie staat voor de snelheid, tegen een (figuur 4G). </li><li> Herhaal stap 6.11.1 en 6.11.2 van de eerste fase van snelle basale migratie naar de basale migratie snelheid Vb (figuur 4H) te bepalen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fausett, B. V., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha1+tubulin-expressing+Muller+glia+in+regeneration+of+the+injured+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina.</a> J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).</li>
<li>Kassen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+%28Danio+rerio%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li>
<li>Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-stage+neuronal+progenitors+in+the+retina+are+radial+Muller+glia+that+function+as+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells.</a> J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).</li>
<li>Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+is+produced+by+dying+retinal+neurons+and+is+required+for+Muller+glia+proliferation+during+zebrafish+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration.</a> J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).</li>
<li>Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Cytoskeleton-+and+Rock-Mediated+INM+Are+Required+for+Photoreceptor+Regeneration+in+the+Adult+Zebrafish+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina.</a> J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).</li>
<li>Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-renewing+division+of+zebrafish+Muller+glial+cells+generates+neuronal+progenitors+that+require+N-cadherin+to+regenerate+retinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons.</a> Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).</li>
<li>Sauer, M. E., Walker, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioautographic+study+of+interkinetic+nuclear+migration+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Soc.Exp.Biol.Med%22%5BJournal%5D)">Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube.</a> Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).</li>
<li>Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+modulate+interkinetic+nuclear+movement+in+retinal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells.</a> J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).</li>
<li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).</li>
<li>Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurogenesis+by+interkinetic+nuclear+migration+through+an+apical-basal+notch+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient.</a> Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).</li>
<li>Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+is+the+main+driver+of+interkinetic+nuclear+migration+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina.</a> Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).</li>
<li>Becker, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+chick+retinal+development+in+relation+to+gap+junctional+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication.</a> J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).</li>
<li>Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+maintains+the+quiescent+progenitor+cell+state+of+postnatal+retinal+Muller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia.</a> Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).</li>
<li>Nickerson, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+analysis+of+postnatal+mouse+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development.</a> BMC Dev.Biol. 13, 24(2013).</li>
<li>Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+photoreceptor+types+in+zebrafish+are+generated+by+symmetric+terminal+divisions+of+dedicated+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).</li>
<li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li>
<li>Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+adult+rat+retinal+explant+model+for+screening+of+potential+retinal+ganglion+cell+neuroprotective+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).</li>
<li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+excitability%2C+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).</li>
<li>Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+retinal+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of retinal whole mounts.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Lapse+Retinal+Ganglion+Cell+Dendritic+Field+Degeneration+Imaged+in+Organotypic+Retinal+Explant+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).</li>
<li>Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+blue+light+on+photoreceptors+in+a+live+retinal+explant+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Vis%22%5BJournal%5D)">Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system.</a> Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).</li>
<li>Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+processes+by+long-term+live+imaging--historic+problems+and+current+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell.Sci%22%5BJournal%5D)">Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions.</a> J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).</li>
<li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J.Vis.Exp. 80, e51017(2013).</li>
<li>Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressing+notch+signaling+and+expressing+TNFalpha+are+sufficient+to+mimic+retinal+regeneration+by+inducing+Muller+glial+proliferation+to+generate+committed+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells.</a> J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).</li>
<li>Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+defines+three+populations+of+Muller+glia+and+is+required+for+initiating+maximal+muller+glia+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Comp.Neurol%22%5BJournal%5D)">Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina.</a> J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).</li>
<li>Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Muller+glial+dependent+neuronal+regeneration+in+the+damaged+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).</li>
<li>Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+IL-6+family+cytokines+synergize+to+stimulate+Muller+glia+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Rep%22%5BJournal%5D)">Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration.</a> Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).</li>
<li>Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+is+necessary+and+sufficient+for+Muller+glia+dedifferentiation+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Cell%22%5BJournal%5D)">HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration.</a> Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).</li>
<li>Lenkowski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+adult+zebrafish+requires+regulation+of+TGFbeta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling.</a> Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).</li>
<li>Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+position+and+morphology+of+committed+precursor+cells+in+the+zebrafish+retina+adapt+to+architectural+changes+upon+tissue+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Rep%22%5BJournal%5D)">Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation.</a> Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+Muller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).</li>
<li>Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+dynamic+imaging+of+retinal+microglia+using+time-lapse+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+living+photoreceptors+contributes+to+inherited+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.Med%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration.</a> EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).</li>
<li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Front.Cell.Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front.Cell.Neurosci. 9, 321(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Studies die de mechanismen die de regeneratie van beschadigde volwassen zebravissen netvlies overwegend gebruikte immunocytochemische werkwijzen 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Voorwaarden worden vastgesteld om cultuur netvlies explantaten en live-cell imaging voeren op verschijnselen, zoals INM...

In tegenstelling tot mensen, de zebravis (Danio rerio) vertonen een robuuste regeneratie reactie op de celdood van retinale neuronen 1, 2, 3, 4. Tumor necrosis factor α, een signaalmolecuul dat vrijkomt uit stervende retinale neuronen induceert Müller glia die in de basale Inner kernlaag (INL) van het netvlies, te prolifereren 5 en produceren neuronale progenitorcellen die blijven prolifereren vóór differentiëren in de neuronale cel soorten die stierven 2, 3, 4. Tijdens de proliferatieve fase van de regeneratie respons, de kernen van Müller glia en daarvan afgeleide neuronale progenitorcellen ondergaan een zich herhalend patroon in trekkende fase van de celcyclus (Interkinetic Nuclear Migration, INM) 6 </sup<html> &gt;, 7. Kernen gepositioneerd in de basale INL repliceren hun DNA vóór de migratie naar de Outer Nuclear Layer (ONL) waar ze verdelen vóór het ontstaan ​​kernen basaal terug te keren naar het INL. Deze werkwijze werd voor het eerst beschreven in neuro-ontwikkeling met behulp van histologische methoden, terwijl levende cellen beeldvormingsbenaderingen later de uitlegging steun Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Zowel histochemische en live-cell imaging benaderingen zijn gebruikt om mechanismen verantwoordelijk INM en zijn functie in de ontwikkeling neuroepithelia waaronder het netvlies 9, 11, 12, 13 bepalen. Echter, de mechanismen die INM in de volwassen regenererende netvlies zijn niet onderzocht in veel detailxref &quot;&gt; 6, 7. live-cell imaging zal een waardevolle benadering van onze kennis van de signaalwegen die INM controle in de volwassen regenererende netvlies vooruit zijn. Tot voor kort levende cellen beeldvorming van INM in het netvlies is beperkt tot of levende zebravis embryo&#39;s of embryonale kuiken of postnatale muizen netvlies explantaten 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Terwijl netvlies explantaten van volwassen dieren van verschillende soorten, waaronder muizen, ratten en zebravis zijn gebruikt voor verschillende celbiologische benaderingen 17, 18, 19, 20, live-cell imaging experimenten met retinale explantaten have beperkt tot periodes kort en hebben niet continu gedurende enkele uren 21, 22 is uitgevoerd. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om de cultuur-licht beschadigd volwassen zebravissen netvlies live-cell imaging experimenten toezicht INM te voeren met behulp van multi-foton microscopie 6. Live-cell imaging benaderingen zijn gunstig ten opzichte van immunohistochemische methoden bij het onderzoek naar de mechanismen die INM, als de dynamiek van INM, bijvoorbeeld snelheden kunnen worden getroffen in plaats van de locatie van de mitose, dat zou mogelijk niet worden gedetecteerd met behulp van immunocytochemie. In de toekomst, deze werkwijze heeft ook het potentieel om te worden aangepast aan andere dynamische processen tijdens het netvlies regeneratie, zoals fagocytose sterven fotoreceptoren Muller glia of het gedrag van microglia bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Dumont forceps #5</td><td>World precision instruments</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Dumont forceps #5, 45&deg; angle</td><td>World precision instruments</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas schaar</td><td>World precision instruments</td><td>501233</td><td></td></tr><tr><td>Fluordishes</td><td>World precision instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>SMZ-1B</td><td>gelijkaardige soort dissectie stereomicroscoop zal werken</td></tr><tr><td>Biologische veiligheidskast klasse type A2</td><td>Labconco</td><td></td><td>gelijkwaardig type zal werken</td></tr><tr><td>weefselkweekincubator</td><td>Thermoscientific</td><td>HEPA-klasse 100</td><td>gelijkwaardig type zal werken</td></tr><tr><td>Sylvania fluorescentielampen OSFP5835HOECO</td><td>Bulbtronics</td><td>31850</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &micro;m poriegrootte Acrodisc spuitfilter</td><td>VWR</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-lok spuit</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>60 mL Luer-lok spuit</td><td>VWR</td><td>BD309653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>FischerScientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoScientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD Millipore</td><td>5980</td><td></td></tr><tr><td>HBSS zonder Ca2+/Mg2+, zonder fenolrood, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM zonder fenolrood, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>5100-038</td><td></td></tr><tr><td>Paarden serum, hitte-geïnactiveerd</td><td>ThermoScientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>penicilline/streptomycine</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapuur lage smeltpunt agarose</td><td>ThermoScientific</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>ethanol, absoluut</td><td>ThermoScientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>2-fenoxyethanol</td><td>Sigma</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell-Tak cel- en weefselkleefstof&nbsp;</td><td>VWR</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>brekingsindex vloeistof&nbsp;</td><td>Cargille Lab</td><td>1803Y</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 multifoton microscoop uitgerust met een MaiTai infraroodlaser</td><td>Nikon</td><td></td><td>gelijkwaardig systeem zal werken</td></tr><tr><td>40X Apo langeafstands waterimmersie objectief (N.A. 1.15)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>milieukamer uitgerust met insert voor 35 mm petrischalen</td><td>Okolab</td><td></td><td>gelijkwaardig systeem zal werken</td></tr><tr><td>NIS analysesoftware</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cultuur van volwassen transgene zebravis retina explantaten voor live-cell imaging van multiphoton microscopy

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Een endogeen regeneratie programma is geïnitieerd door Müller glia in de volwassen zebravissen (Danio rerio) retina volgende neuronale schade en de dood. De Müller glia opnieuw in te voeren de celcyclus en produceren van neuronale voorlopercellen die volgende rondes van celdelingen ondergaan en differentiëren in de verloren neuronale celtypen. Zowel Müller glia en neuronale voorlopercellen celkernen repliceren hun DNA en ondergaat mitose in verschillende locaties van het netvlies, dat wil zeggen ze migreren tussen de basale Inner kernlaag (INL) en de buitenste nucleaire laag (ONL), respectievelijk in een werkwijze genaamd Interkinetic Nuclear Migratie (INM). INM is voornamelijk bestudeerd in de ontwikkelende retina. Om de dynamiek van INM in de volwassen zebravissen netvlies regenereren in detail te onderzoeken, is voor live-cell imaging van fluorescent-gelabelde Müller glia / neuronale voorlopercellen nodig. Hier bieden we de voorwaarden te isoleren en cultuur dorsale netvliezenvan Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebravis die werden blootgesteld aan een constante intens licht voor 35 uur. We tonen ook dat deze retinale culturen levensvatbaar live-cell imaging experimenten, continu verwerven z-stack beelden over de dikte van het netvlies explantaat tot 8 h en multifoton microscopie het migrerende gedrag van GFAP controleren: nGFP -positieve cellen . Daarnaast beschrijven we de gegevens om na de beeldvorming uit te voeren om de snelheid van apicale en basale INM bepalen. Om samen te vatten, hebben we voorwaarden aan de dynamiek van INM in een naaktmodel van neuronale regeneratie te bestuderen. Dit zal ons begrip van deze cruciale cellulaire proces te bevorderen en ons toelaten om de mechanismen die INM controle te bepalen.

De isolatie van het netvlies volgens de procedure in het schema weergegeven in figuur 1 maakt het kweken van een afgeplatte dorsale netvlies tegen licht beschadigde adult Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebravis gedurende ten minste 24 uur in een 5% CO 2 / lucht-omgeving. Deze flat-gemonteerde netvlies explantaten kan worden gebruikt om het focale vliegtuigen bij diepe weefsel niveaus. Een voorbeeld is Müller glia / neuronale voorlopercellen celkern...

Zebravis netvlies regeneratie is meestal onderzocht met behulp van vaste netvliezen. Echter, dynamische processen zoals interkinetic nucleaire migratie optreden tijdens de regeneratieve respons en vereisen voor live-cell imaging om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. We beschrijven hier de cultuur en beeldvorming voorwaarden te controleren Interkinetic Nuclear Migratie (INM) in real-time met behulp van multiphoton microscopie.

Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Het algemene doel van deze isolatieprocedure is om live-cell imaging mogelijk te maken van de prolifererende cellen die interkinetische kernmigratie ondergaan in retinaal explantaatculturen van beschadigde zebravis. Deze methode kan sleutelvragen over retinaal herstel beantwoorden, zoals welke mechanismen de interkinetische kernmigratie aansturen of dat Muller-glia in een retinaal progenitorcel-interkinetische kernmigratie op soortgelijke wijze worden gereguleerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het dynamische gedrag van de prolifererende cellen die tijdens regeneratie interkinetische kernmigratie ondergaan kan worden gemonitord, wat onderzoek naar celcyclusfasespecifieke mechanismen mogelijk maakt.Hoewel deze methode inzicht kan geven in interkinetische nucleaire migratie, kan deze ook worden toegepast op andere gebieden van onderzoek naar het netvlies, zoals het bestuderen van het gedrag van microglia of de fagocytose van stervende neuronen door Müller-glia. Begin deze procedure door de zebravis op een droog papieren handdoekje te plaatsen. Verwijder vervolgens één van de ogen met een gebogen pincet en breng dit over naar een FluoroDish.Oriënteer het oog onder een stereomicroscoop zodanig dat de pupil naar het dekglas van de FluoroDish is gericht, zodat de oogzenuw aan de achterzijde van het oog zichtbaar is. Verwijder vervolgens de oogzenuw zo dicht mogelijk bij de achterkant van het oog. Verwijder daarnaast het bindweefsel rondom het oog.Houd het oog tussen de nasale en temporale zijden vast met een pincet, terwijl er een incisie bij de oogzenuw wordt gemaakt door met één schaarblad door de lamina cribrosa te prikken en langs zowel de nasale als de temporale zijden van het oog te knippen. Trek vervolgens de dorsale en ventrale zijden van het netvlies uit elkaar. Verwijder de sclera van het dorsale netvlies met een pincet, terwijl de lens die met het netvlies is verbonden met een tweede pincet wordt vastgehouden.Verwijder vervolgens de lens en het glasachtig lichaam zonder het netvlies te beschadigen. Platte daarna het netvlies af, waarbij de ganglioncellaag naar het dekglas van de FluoroDish is gericht. Omring het netvlies vervolgens met 10 µL 1% low melting point agarose.Zorg ervoor dat het netvlies niet wordt opgetild door de vloeibare agarose, omdat zelfs een minimale verhoging het vermogen om scherp te stellen door het weefsel kan beïnvloeden. Als er opheffing wordt waargenomen, gebruik dan een pipet om de agarose te verwijderen. Het is essentieel dat de agarose het weefsel niet van het dekglas tilt, aangezien dit het vermogen om kwaliteitsbeelden te verkrijgen vermindert.Herhaal deze procedure meerdere keren voordat er 1% low melting point agarose wordt toegevoegd om de gehele FluoroDish te bedekken. Zodra de agarose is gestold, voegt u 1,5 milliliters kweekmedium toe aan het weefsel. Open in de software voor beeldacquisitie de vensters A1 MP GUI TI pad, A1 compact GUI en ND acquisition.Zorg er bij multifoton-imaging voor dat de optie IRNDD is geselecteerd in het A1 compact GUI-venster. Selecteer vervolgens in het instellingsveld IRDM voor de eerste dichroïsche spiegel en controleer of het banddoorlaatfilter is ingesteld op 525 tot 50 om GFP-fluorescentie te verkrijgen. Zet daarna de IR-laser aan in het A1 MP GUI-venster.Het duurt een paar minuten voordat de laser gereed is. Stel daarna de golflengte in op 910 nanometer om GFP-fluorescentie te exciteren en richt de laser door op de knop voor automatische uitlijning te klikken. Nadat de retinacultuur op de tafel van de multifotonmicroscoop is geplaatst, dient u ervoor te zorgen dat de kamerverlichting en de lampen van de apparatuur zijn uitgeschakeld voordat u de sluiter opent, om overbelichting van de fotomultiplicatierbuis te voorkomen.Om het ruisniveau te verminderen, dient de microscoop in een verduisterde omgeving te worden geplaatst. Neem beelden van een gezichtsveld van 300 bij 300 pixels bij een zoomfactor van twee, ingesteld in het venster voor het scangebied, met een pixelverblijftijd van 4,8 microseconden per pixel, gekozen in het A1 compact GUI-venster. Stel de laserintensiteit globaal in door het acquisitiegebied in het A1 MP GUI-venster en de gain in het A1 compact GUI-venster aan te passen.Focus nu op de ganglioncellaag en stel het bovenste brandvlak van de z-stack in het z-subvenster binnen het ND-acquisitievenster in. Verplaats het brandvlak door het niveau van de buitenste kernlaag, die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van zwak gelabelde GFAP- en GFP-positieve cellen die rond zijn en vergroot ten opzichte van hun tegenhangers in de binnenste kernlaag. Stel dit vlak in als de onderkant van de z-stack.Stel vervolgens de z-stapgrootte in tussen 0,7 en één micrometer. Om de z-intensiteitscorrectie in te stellen, opent u het venster voor z-intensiteitscorrectie en kiest u ND voor het instellen van het bereik van de z-stack. Klik daarna op het onderste brandvlak in het venster voor z-intensiteitscorrectie en stel de laserintensiteit en gain in.Klik vervolgens op de pijl naast de z-waarden in het venster voor z-intensiteitscorrectie om de instellingen te bevestigen die vervolgens onder de apparaatinstellingen in het venster voor z-intensiteitscorrectie voor het gekozen brandvlak worden weergegeven. Herhaal dit proces voor de middelste en bovenste vlakken, waarbij de lasersterkte en de gain worden verhoogd. Stel het acquisitiegebied in het A1 MP GUI-venster in en vermijd het selecteren van een acquisitiegebied groter dan 15 en een gain hoger dan 126 aan het begin van de beeldvorming om fotobleking en verhoogde ruisniveaus te voorkomen.Kies vervolgens voor relatieve intensiteitscorrectie in het venster voor z-intensiteitscorrectie. Stel in het subvenster voor tijdreeksen van het ND-acquisitievenster de duur in op 8 uur en het interval op geen vertraging. Klik vervolgens op run z correction in het subvenster voor z-stacks van het ND-acquisitievenster om 3D-tijdreeksen te verkrijgen.Kader in deze procedure een gebied in dat een delende GFAP- en GFP-positieve kern bevat. Kies een uitgesneden gebied dat ten minste één kern bevat die geen INM ondergaat, om een referentiepunt vast te stellen om vervolgens de afstanden te meten die de delende kern is gemigreerd ten opzichte van de basale INL. Het helpt om een 3D-reconstructie voor te bereiden.Genereer orthogonale projecties met behulp van de functie 'slices view' (plakjesweergave). Wijzig vervolgens de modus van 'slice' naar 'maximum intensity projection' (maximale intensiteitsprojectie). Schakel daarna de XY-weergave van de orthogonale maximale projectie uit.Afhankelijk van de oriëntatie waarin de migrerende en delende nucleus het best zichtbaar is, schakelt u ook het XZ- of het YZ-weergavevenster uit. Klik met de rechtermuisknop op het overgebleven beeld en extraheer de XZ- of YZ-beeldserie met de functie 'create new document from this view'. Roteer het beeld indien nodig.Teken met de handmatige meetfunctie een horizontale lijn over de afbeelding op het onderste niveau van de nucleus die in de basale INL blijft en geen INM ondergaat. Meet de afstand tussen de referentielijn en het basale punt van de migrerende nucleus voor de tijdserie met de lijnmeettool in de analysesoftware. Hier wordt de maximale YZ-projectie getoond van een z-stack beeldserie van de retinale explantaten op verschillende tijdstippen van de time-lapse opname, verkregen via multiphotonmicroscopie.Met behulp van de lijntool onder de handmatige meetfunctie werd een horizontale lijn geplaatst op het niveau van de referentiecel, aangegeven met een ster. Een verticale meetlijn werd geplaatst vanaf de horizontale lijn, uitlopend tot de basale positie van de migrerende GF AP- en GFP-positieve kern. De afstand die de cel, F0, gemeten in de vorige figuur, apicaal migreerde en de afstand die de daaruit voortvloeiende dochtercellen, D1 en D2, basaal migreerden in de multi-foton time-lapse opname.De rode lijn geeft de metingen aan waarvoor de apicale migratiesnelheid is berekend, terwijl de zwarte en grijze lijnen de metingen aangeven die zijn gebruikt om respectievelijk de basale migratiesnelheden voor D1 en D2 te berekenen. De afstand werd uitgezet tegen de tijd voor apicale migratie vóór het uiteenvallen van de kernenvelop en de fase van snelle basale migratie voor dochtercel D1. Zodra de techniek onder de knie is, kan de isolatie van retina's van drie vissen in 60 tot 90 minuten worden voltooid, mits dit correct wordt uitgevoerd. Deze tijd is exclusief de voorbereidingsstappen.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zo snel mogelijk te werken om de levensvatbaarheid van het retina-explantaat te waarborgen. Het is daarnaast cruciaal om de retina's zo vlak mogelijk te monteren om beeldvorming in diepere weefsellagen mogelijk te maken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u zebravisretina's isoleert en monteert, live-cell imaging uitvoert om de interkinetische nucleaire migratie te monitoren en om migratiesnelheden te bepalen.

culture-adult-transgenic-zebrafish-retinal-explants-for-live-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Demonstreren we een protocol om chimere zebravis embryo's te genereren voor live-imaging cellulaire gedrag tijdens de embryogenese.

Transplantatie van GFP-expressie blastomeren voor Live Beeldvorming van het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen in chimère zebravis embryo&#39;s

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te...

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

Stervende cellen zijn geëxtrudeerd uit epitheelweefsels door gezamenlijke contractie van naburige cellen zonder verstoring van de barrièrefunctie. De optische helderheid van ontwikkelen zebravis biedt een uitstekende systeem om extrusie visualiseren in levende epithelia. Hier beschrijven we methoden om te induceren en imago extrusie in het larvale zebravis epidermis op cellulair resolutie.

Live-Imaging van de Cel Extrusie van de opperhuid van de ontwikkelingslanden zebravis

The video demonstrates a method for culturing primary retinal ganglion cells from zebrafish embryos. Early-stage embryos undergo dissection to isolate the eyes, which are subsequently mechanically dissociated into a suspension of retinal ganglion cells. This cell suspension is cultured on coverslips coated with adhesive proteins to facilitate axon development.

Generation of Primary Retinal Ganglion Cell Cultures From Zebrafish Embryos

Source: Lahne, M., et.al. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates live-cell imaging of Muller glial nuclear migration in agarose-embedded zebrafish retinal explants following light-induced photoreceptor damage. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) released by damaged photoreceptors activates Muller glial cells, triggering nuclear migration through the inner and outer nuclear layers for...

Live Cell Imaging of Muller Glial Nuclear Migration During Zebrafish Retinal Regeneration

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Imaging retinale weefsel kan informeren eencellige die niet kunnen worden verzameld van traditionele biochemische methoden. Dit protocol beschrijft voorbereiding van retinale segmenten van zebravis confocal imaging. Fluorescerende genetisch gecodeerd sensoren of indicator kleurstoffen toestaan visualisatie van tal van biologische processen in verschillende retinale celtypes.

Voorbereiding verse retinale segmenten van volwassen Zebrafish voor Ex Vivo Imaging experimenten

Hier presenteren we een protocol om te laten zien hoe de photoconversion van de cel wordt bereikt door UV blootstelling aan specifieke gebieden uiten de fluorescente proteïne, Eos, in levende dieren.

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Presenteren we een efficiënt en gemakkelijk te gebruiken protocol voor het voorbereiden van primaire celculturen van zebravis embryo's voor transfectie en levende cel imaging, evenals een protocol bij het bereiden van primaire cellen van volwassen zebrafish hersenen.

Cultuur en de transfectie van zebravis primaire cellen

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Dit protocol beschrijft het gebruik van een genetisch gecodeerd waterstofperoxide (H2O2)-biosensor in gekweekte zebravisneuronen en larven voor het beoordelen van de fysiologische signaleringsrollen van H2O2 tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Het kan worden toegepast op verschillende celtypen en worden aangepast met experimentele behandelingen om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de algemene ontwikkeling te bestuderen.

ROS Live Cell Imaging tijdens neuronale ontwikkeling

Leer live-cell imaging van interkinetische nucleaire migratie in zebravis retina-explantaten met behulp van multiphoton-microscopie. Deze methode maakt real-time observatie van celgedrag tijdens regeneratie mogelijk.

Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy

Meer video's verkennen