Meten en Modeling Contractiele Drogen in Human hoornlaag

Het algemene doel van deze methode is het kwantificeren van de dynamische mechanische stijfheid en de opbouw van droogstress in ex vivo monsters van het menselijke stratum corneum, na verschillende chemische behandelingen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de biomechanica en de cosmetische wetenschap, zoals de manier waarop de samenstelling van het stratum corneum of de behandeling van het huidweefsel met persoonlijke verzorgingsproducten de mechanische eigenschappen en het dynamische drooggedrag kunnen beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een sneller alternatief biedt voor andere mechanische beoordelingsmethoden, aanzienlijk minder huidweefsel vereist en een fysiologisch relevantere droging biedt door verdamping aan de onderzijde van het monster te voorkomen.

Om met elastomeer gecoate dekglasjes te bereiden, mengt u eerst het Sylgard 184 uithardingsmiddel met de basisstoffen in een verhouding van 55 delen basis tegenover één deel uithardingsmiddel, tot het mengsel homogeen is. In totaal zijn zes gram nodig. Ontgas vervolgens de oplossing.

Gebruik vervolgens de oplossing om de dekglasjes te coaten op een spincoater. Druppel met een wide-bore pipet één milliliter van het mengsel centraal op een dekglasje. Spincoat het dekglasje vervolgens bij 2 000 rpm gedurende 60 seconden.

Maak op deze manier vijf of zes gecoate dekglasjes. Om de dekglasjes te harden, bewaart u ze 12 uur in een oven van 60 graden Celsius. Meet de volgende dag de diktes van de elastomeerfilms.

Gebruik een scheermesje om één rand van de elastomeerfilm van het dekglas te tillen. Gebruik vervolgens een onuitwisbare marker om de bovenkant van de elastomeerfilm en het behandelde dekglas eronder te markeren. Meet nu, met behulp van een omgekeerde microscoop, de Z-hoogte tussen de brandvlakken van de markeringen om de dikte van de film te bepalen.

Volg de standaardprocedures voor het voorbereiden van het SC-weefsel. Maak monsters door ponsen met een diameter van zes millimeter uit de SC te nemen. Plaats op de monsters een markering in het centrum van het buitenste vlak met een onuitwisbare stift. Breng vervolgens fluorescerende marker-beads aan op het SC-oppervlak door de monsters te laten drijven in 15 milliliters water, bevattend ongeveer 90 microliters bead-concentraat.

Gebruik een zachte agitatie gedurende 30 minuten en pas de kralenconcentratie indien nodig aan. Dompel na de behandeling elk monster in water om het op het elastomeer te monteren. Plaats een gecoat dekglas onder een kleine hoek van 15 tot 30 graden onder de SC, met het elastomeer naar de onderzijde van de SC gericht. Til vervolgens het dekglas uit het water met de vastgehechte SC erboven, zodat het SC-monster glad gelamineerd wordt zonder rimpels of ingesloten lucht.

Droog vervolgens de gemonteerde monsters gedurende ongeveer een uur onder omgevingscondities. Zodra ze droog zijn, worden de monsters overgebracht naar een hermetisch afgesloten kamer met een schaal water. Laat de monsters 24 uur lang equilibreren aan de luchtvochtigheid.

Monteer de volgende dag een monster in een perfusiekamer voor een langdurige imagingsessie. Plaats de perfusiekamer op het substraat en dicht de randen van de perfusiekamer tegen het elastomeer af met vacuümvet. Neem vervolgens fluorescentie- en transmissielichtbeelden op met een gezichtsveld dat groot genoeg is om het volledige SC-monster vast te leggen.

Neem gedurende de volgende 16 uur elke 10 minuten een afbeelding. Vul in een chemische zuurkast een klein plastic dopje met één milliliter silaan. Plaats het dopje in een afgesloten container met één met elastomeer beklede dekglasplaat, zonder dat deze in direct contact staan.

Laat ze vijf uur incuberen bij kamertemperatuur. Bereid tijdens het wachten 20 milliliters kraaloplossing voor volgens het tekstprotocol en giet deze vervolgens in een schaal van 10 centimeter. Plaats na vijf uur de gesilaneerde substraten langzaam met de elastomeerzijde naar beneden in de kraaloplossing.

Laad twee substraten in elke schaal en laat de substraten 45 minuten reageren met de beads. Verwijder vervolgens de substraten met een pincet en spoel ze af met gedestilleerd water om de ongebonden beads te verwijderen. Droog ze daarna onder een zachte stroom perslucht en bewaar ze in een afgesloten, ondoorzichtige doos.

Breng met de eerder beschreven techniek de SC-monsters over op een behandeld substraat in een waterbad. Breng direct na het monteren van de SC een druppel van 5 µL onverdunde fluorescente marker-bead-oplossing aan. Laat de SC vervolgens 60 minuten drogen.

Meet nu de dikte van de SC met de microscoop met een 40x objectieflens in een perfusiekamer. Meet de dikte van de SC in de tijd, waarbij een remote focus-accessoire wordt gebruikt om het verschil in Z-hoogte tussen de twee kralenlagen vast te leggen. Eén laag bevindt zich op de interface tussen de SC en het substraat, en de andere bevindt zich bovenop de SC. Met de beschreven technieken is een SC-monster voorbereid en gecoat met fluorescerende kralen.

Na 16 uur drogen, bij een relatieve vochtigheid van 25%, werden de verplaatsingen gemeten. Vanwege de cirkelvormige symmetrie van de monsters werden deze verplaatsingen azimuthaal gemiddeld. Gedurende het drogen blijven de azimuthale verplaatsingen gering.

Radiale verplaatsingsprofielen namen echter monotoon toe van het centrum naar de rand en groeiden in magnitude tot er een evenwicht werd bereikt. Profielen die met intervallen van 30 minuten zijn geregistreerd, tonen de tijdsontwikkeling van de in-plane verplaatsingen. De gemiddelde SC-dikte nam af tijdens het drogen, voornamelijk gedurende de eerste twee uur.

De droogingsdynamiek werd vervolgens geanalyseerd door de verplaatsingsprofielen via een methode van minimale kwadratensommen te fitten aan een lineair, elastisch contractiliteitsmodel. Uit dit model werden de contractuele droogingsspanning en de elastische modulus afgeleid. Beide parameters namen gedurende de eerste twee uur van de droging snel toe.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om erop te letten dat de monsters volledig op het substraat worden gehecht. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals lipidvleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijze waarop specifieke cosmetische behandelingen de lipidsamenstelling van het weefsel veranderen.