Name: Modelleren van eierstokkanker Meercellige Sferoïde Gedrag in een dynamische 3D peritoneale microdevice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Leer een dynamisch microfluidisch co-cultuurplatform maken voor eierstokkankeronderzoek. Dit 3D-model bootst de peritoneale omgeving na om celinteracties en metastase te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door Hong Kong Research Grant Raad (subsidies 17.122.014, C1013-15G, 719813E, en 17.304.514). AST Wong is een ontvanger van de Croucher Senior Research Fellowship.

1. microfluïdische apparaat ontwerp en de fabricage <ol><li> Microfluïdische meester ontwerp <ol><li> Ontwerp en teken de microfluïdische kanaal patroon met elke computer-aided design (CAD) software. OPMERKING: Normaal zal de CAD tekening kan een fotomasker bedrijf naar het fotomasker te produceren. De microfluïdische die bestaat uit drie identieke parallelle kanalen, elk met de volgende afmetingen: 4 mm x 25 mm x 250 urn (breedte x lengte x hoogte) en stel 2 mm. Beide kanaal uiteinden werden ontworpen met 127 ° hoek ten opzichte van vloeibare in- en uitgang (Figuur 1B) te vergemakkelijken. Het kanaal gebruikt in dit protocol werd bij een eerdere publicatie 13. </li><li> Was de siliciumwafel met ultrasone trillingen (500 W / 42 kHz) in aceton, isopropanol en gedeïoniseerd water gedurende 15 minuten elk. Drogen van de wafel met stikstofgas onder druk. Verwarm de siliciumwafel op een hete plaat bij 250 ° C gedurende 15 minuten volledig drogenhet. </li><li> Spin-coat een laag van SU-8 2075 fotoresist (125 micrometer dik) op het silicium wafer met een draaiende snelheid van 1800 rpm. Bak de fotolak bedekte wafel direct op een hete plaat bij 65 ° C en vervolgens bij 95 ° C, om overmaat oplosmiddel respectievelijk verwijderen, 5 en 25 min (volgens de SU-8 producthandboek). </li><li> Herhaal stap 3 en spin-coat een andere laag van SU-8 2075 fotoresist tot een uiteindelijke dikte van 250 pm te verkrijgen. Bak de fotolak bedekte wafel direct op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 7 minuten en daarna bij 95 ° C gedurende 30 minuten. Langzaam koelen wafel tot kamertemperatuur. Niet koelen met perslucht. </li><li> Lijn en zet het fotomasker direct op de wafer. Blootgesteld aan UV-licht gedurende 20 s om het patroon te verknopen. </li><li> Bak de wafer met fotolak bij 65 ° C en 95 ° C op een verwarmingsplaat gedurende 5 en 12 minuten, respectievelijk, het oplosmiddel voor polymerisatie verwijderd (volgens de SU-8 producthandboek). Daarna Koel de wafelkamertemperatuur. </li><li> Opheffen van de niet-verknoopte fotoresist door onderdompeling van de wafer in SU-8 ontwikkelaar 25 min. Spoel de wafer met isopropanol en droog met perslucht. LET OP: Als een melkachtige oplossing als spoelen met isopropanol, met vermelding van onvolledige ontwikkeling werd waargenomen, dompel de wafer terug in SU-8 developer voor een langere tijd ontwikkelen. </li><li> Plaats de wafer op een hete plaat bij 180 ° C gedurende 10 minuten om het patroon van potentiële scheuren genezen. Schakel de hete plaat en langzaam afkoelen van de wafer op kamertemperatuur door het verlaten van het op de hete plaat. </li><li> Voeg enkele druppels trichloor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silaan in een dop. Doe de dop in de vacuümexsiccator. Plaats de wafer naast de dop op de wafel silaniseren gedurende 10 min. </li></ol></li><li> PDMS chip fabricage <ol><li> Wikkel de wafer met aluminiumfolie om een ​​houder te maken. </li><li> Meng de polydimethylsiloxaan (PDMS) basis en verharder in een 10: 1 massaverhoudingmet een centrifugaal mixer onder de meng- en ontgassingsfunctie. Giet het PDMS mengsel langzaam op de wafer tot een hoogte van ongeveer 5 mm. Ontgas de PDMS onder vacuüm gedurende 40 min. Genezen van de PDMS in een oven bij 65 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Verwijder voorzichtig de PDMS plaat uit de master en snijd de PDMS langs de kanalen totdat het is de grootte van een glasplaatje. Pons de PDMS met een 1-mm biopsie punch om de in- en uitlaten van het apparaat te maken. </li><li> Reinig de PDMS oppervlak met perslucht en plakband om stof en vuil te verwijderen PDMS. </li><li> Plaats de PDMS plaat, met het kanaal kant naar boven, in een plasma schoner. Plaats een schoon glasplaatje in het plasma schoner naast de PDMS plaat. </li><li> Behandel de PDMS en glazen schuif onder lucht plasma bij hoge RF niveau gedurende 1 minuut. Bind de PDMS aan het glaasje om een ​​onomkeerbare covalente binding te creëren. </li><li> Plaats de PDMS chip op een hete plaat bij 150 ° C gedurende 1 uur om de hechtsterkte te verbeteren en de hydrop terugkerenhobicity van het PDMS voor gebruik. </li></ol></li></ol> 2. Seeding de microfluïdische chip met primaire peritoneale mesotheelcellen (HPMCs) <ol><li> Fibronectine coating van microfluïdische kanalen <ol><li> Steriliseer het microfluïde kanaal met 30 ui 75% ethanol. Wordt de ethanol en tweemaal spoelen met 30 ul van gesteriliseerde met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met een pipetpunt. Grondig aspireren PBS in de kanalen. Opmerking: Om contaminatie te minimaliseren, de microfluïdische celkweek worden zorgvuldig onder volledig aseptische omstandigheden uitgevoerd door het gebruik van een laminaire stroming kap. </li><li> Bereid een 10 ug / ml fibronectine oplossing in serumvrij M199: MCDB105 (1: 1) -medium. Pipetteer de oplossing op en neer, met speciale zorg te borrelen vorming te voorkomen. Doe niet vortex. </li><li> Langzaam vullen elk kanaal met 30 pi van fibronectine oplossing. Dicht de kanalen met tape en overnachting incubeer de chip bij 4 ° C. </li></ol></li><li&gt; Seeding HPMCs in de microfluïdische kanalen <ol><li> HPMCs cultuur in 10% foetaal runderserum (FBS) kweekmedium (M199: MCDB105 aangevuld met 10% FBS en 100 U / ml penicilline / streptomycine) onder 5% CO2 bij 37 ° C tot 80% confluentie. </li><li> Spoel de HPMCs met 3 ml PBS en trypsinize met 2 ml 0,05% trypsine / 0,01% EDTA (TE) oplossing voor 30 s. Neutraliseren met 4 ml 10% FBS kweekmedium en spin down de cellen bij 1000 g gedurende 5 min. </li><li> Resuspendeer de HPMCs in 2 ml 10% FBS kweekmedium. Tel het aantal cellen met een hemocytometer en stel de celconcentratie tot 3,5 x 10 6 / ml. </li><li> Verwarm het met fibronectine gecoate microfluïdische chip in een 37 ° C incubator gedurende 5 minuten vóór gebruik. Volledig zuig het fibronectine oplossing. </li><li> Langzaam pipet 30 pi van HPMC suspensie in elk kanaal. Verzegel de kanalen met tape en plaats de apparaten in de CO2 incubator gedurende de nacht. </li></ol></li></ol><ol><li> Eierstokkanker sferoïde formatie <ol><li> Handhaaf de menselijke ovariumcarcinoom-cellijn SKOV-3 in 5% FBS kweekmedium (M199: MCDB105 met 5% FBS en 100 U / ml penicilline / streptomycine) onder 5% CO2 bij 37 ° C voordat de experimenten. </li><li> Ontbinding van 0,5% agarose in gesteriliseerd water door koken. Verdeel 50 ul van agarose oplossing in elke well van 96-well platen. Laat de platen in de kap 20 min om de agarose te stollen; gestolde agarose bekleden van de putjes kan celadhesie voorkomen en geeft aan dat de platen klaar voor gebruik. </li><li> Spoel de SKOV-3 cellen met 3 ml PBS. Trypsinize met 2 ml TE oplossing gedurende 3 min. Neutraliseren met 4 ml 5% FBS kweekmedium en spin down de cellen bij 1000 g gedurende 5 min. </li><li> Tel de SKOV-3 aantal cellen met een hemocytometer en resuspendeer de cellen in 5% FBS cultuurmedium in een dichtheid van 5000 cellen / ml. Transfer 200 pi celsuspensie in elk agarose gecoate goed en cultuur onder 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 48 uur. </li></ol></li><li> spheroïde kanker loading <ol><li> Transfer kanker sferoïden een 50 ml centrifugebuis vooraf bevochtigd met 1 ml serumvrij medium en spin neer op 750 xg gedurende 5 minuten. OPMERKING: Pre-nat pipet tips en centrifuge buizen kunnen ongewenste spheroïde bevestiging op de centrifuge buizen te voorkomen. </li><li> Bereid 2,5 pg / ml 5-chloromethylfluorescein diacetaat (CMFDA) oplossing in serumvrij M199: MCDB105 medium. Resuspendeer kanker sferoïden in 1 ml CMFDA oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Centrifugeer bij 750 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Spoel de kanker sferoïden met 2 ml serumvrij medium en centrifugeer bij 750 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap tweemaal de resterende fluorescerende kleurstof uit het medium te verwijderen. OPMERKING: De fluorescentiesignaal kan sferoïden worden gehandhaafd gedurende meer dan 96 uur. </li><li> Resuspendeer de kankersferoïden in serumvrij M199: MCDB105 medium en tel het aantal sferoïde met een hemocytometer. Stel de concentratie sferoïden 2000 / mL serumvrij medium. </li><li> Vóór het laden sferoïde injecteer langzaam 100 ui serumvrij M199: MCDB105 medium van de niet-gehecht mesotheelcellen wegspoelen in de kanalen. LET OP: Een snelle injectie, aspiratie, of de vorming bel zal leiden tot het detachement van de mesotheelcellen monolaag. </li><li> Belasting 30 pi van fluorescent-gelabelde sferoïde suspensie in elk kanaal. Plaats de microfluïdische chip in de CO 2 incubator. </li></ol></li><li> Perfusie platform montage en co-cultuur <ol><li> Bevestig een injectiespuit geladen met verse, serumvrij M199: MCDB105 medium om een ​​1 meter lange buis. </li><li> Plaats de spuit op de spuitpomp en zet de zuiger en het lichaam van de spuit. Installeer de spuitpomp horizontaal op dezelfde hoogte als de microfluïdische chip in de incubator. NOTE: Het aantal en de grootte van spuiten afhankelijk van het aantal gebruikte kanalen en de duur van het experiment. </li><li> Snel trekken de hele buis met medium door te drukken en de fast forward knop ingedrukt te houden totdat het medium overloopt de slang. </li><li> Voer de injectie op de gewenste stroomsnelheid. Schat de wandschuifspanning met behulp van de volgende vergelijking: <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/55337/eq1.jpg" /> waarbij τ vertegenwoordigt de wandschuifspanning binnen de kamer, ǫ = debiet, μ = viscositeit (0,01 g cm -1); h = hoogte stromingskamer en w = breedte stromingskamer. </li><li> Sluit de slang aan de inlaat van het kanaal. Plaats de overmaat inlaatslang in de incubator zodat het medium wordt opgewarmd voordat geïnjecteerd in de kanalen. Om de verbinding tussen de buis en het kanaal te vergemakkelijken, kunnen passende connectoren worden gekozen. LET OP: Pas op elke bubble niet te laten kennismaken met de syringe, slangen en aansluitingen. </li><li> Sluit de uitgang van het kanaal een 50-ml conische buis om de uitstroom medium met een korte uitgang reageerbuis te verzamelen. NB: De volledige dynamische co-kweeksysteem wordt getoond in figuur 1D. </li></ol></li></ol> 4. Waarneming van HPMCs en kanker sferoïden na perfusie <ol><li> Let op de HPMCs en kanker sferoïden met een heldere-veld of fluorescentie microscoop en foto&#39;s te nemen na 1 uur van de perfusie. </li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21296855">Global cancer statistics.</a> CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).</li>
<li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).</li>
<li>Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Kit+mediates+chemoresistance+and+tumor-initiating+capacity+of+ovarian+cancer+cells+through+activation+of+Wnt%2Fbeta-catenin-ATP-binding+cassette+G2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling.</a> Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+ovarian+cancer-initiating+cells+from+primary+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors.</a> Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).</li>
<li>Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Met+overexpression+contributes+to+the+acquired+apoptotic+resistance+of+nonadherent+ovarian+cancer+cells+through+a+cross+talk+mediated+by+phosphatidylinositol+3-kinase+and+extracellular+signal-regulated+kinase+1%2F2%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2.</a> Neoplasia. 12, 128-144 (2010).</li>
<li>Ksiazek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+peritoneal+mesothelial+cells+promote+ovarian+cancer+cell+adhesion%3A+the+role+of+oxidative+stress-induced+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin.</a> Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).</li>
<li>Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinked+Fibrin+Derivatives+and+Fibronectin+in+Ascitic+Fluid+from+Patients+with+Ovarian-Cancer+Compared+to+Ascitic+Fluid+in+Liver-Cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis.</a> Thromb Res. 35, 53-64 (1984).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).</li>
<li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+tumor+vasculature%3A+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307, 58-62 (2005).</li>
<li>Chang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+cycle+arrest+induced+by+shear+stress%3A+Roles+of+integrins+and+Smad%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).</li>
<li>Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+driving+force+for+change%3A+interstitial+flow+as+a+morphoregulator%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator.</a> Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).</li>
<li>Rizvi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+cellular+heterogeneity+and+biomarker+modulation+in+3D+ovarian+cancer+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).</li>
<li>Ip, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+chemoresistance+in+epithelial+ovarian+carcinoma+cells+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress.</a> Sci. Rep. 6, 26788(2016).</li>
<li>Avraham-Chakim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid-flow+induced+wall+shear+stress+and+epithelial+ovarian+cancer+peritoneal+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading.</a> PloS one. 8, e60965(2013).</li>
<li>Burkhalter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/26/1_Supplement/656.11">Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer.</a> Faseb Journal. 26, (2012).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+assessment+of+three-dimensional+cell+aggregation+in+rotating+wall+vessel+bioreactors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).</li>
<li>Ismadi, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+characterization+of+a+spinner+flask+for+induced+pluripotent+stem+cell+culture+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application.</a> PloS one. 9, e106493(2014).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one.+9%22%5BJournal%5D)">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PloS one. 9. 9, e89966(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze test heeft een flexibele en fysiologisch relevante model met verschillende biochemische en op cellen gebaseerde assays, zoals kan worden opgenomen, maar niet beperkt tot, adhesie testen mesotheelcellen klaring assays en drug discovery. Het kan worden toegepast op de evaluatie van het effect van intraperitoneale micromilieu op progressie van kanker. Echter nodig verschillende proefomstandigheden worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de doelen van het project (bijvoorbeeld het aantal HPMCs en kanker sferoï...

<html> Eierstokkanker is de meest dodelijke gynaecologische kanker en wordt gekenmerkt door wijdverbreide peritoneale verspreiding en de vorming van kwaadaardige ascites 1. Deze uitgebreide peritoneale metastasen is een belangrijke klinische uitdaging en wordt geassocieerd met slechte klinische resultaten. Unlike stevigste carcinomen die metastaseren via het bloed, eierstokkanker verspreidt vooral in de peritoneale holte. Tumorcellen bestaan als multicellulaire aggregaten / sferoïden tijdens het proces van metastase 2. Dat suspensiekweek eierstokkanker stam / tumor-initiërende cellen kunnen verrijken suggereert verder dat deze sferoïden worden geassocieerd met zowel tumor agressiviteit en verbeterde chemoresistance 3, 4. Er zijn verschillen in reactie drug tussen 2D en 3D culturen, die vermoedelijk hebben verschillende moleculaire mechanismen 5. _content &quot;&gt; De essentiële interactie met de mesothelium construeert de eerste micro-omgeving voor ovariële progressie van de tumor. Deze mesotheelcelsuppletie liggen op een extracellulaire matrix (ECM), waarbij fibronectine is een alomtegenwoordige bestanddeel. Een koppeling tussen de verhoogde expressie van mesotheelcellen cel afkomstige fibronectine en tumorprogressie is aangetoond. fibronectine overvloedig aanwezig is in maligne ascites 6, 7. eierstokkanker cellen kunnen ook de afscheiding van fibronectine van mesotheelcellen induceren teneinde beginnende eierstokkanker metastase 8 promoten. Opkomende bewijs dat mechanische stimuli, waaronder afschuifspanning, celmorfologie, genexpressie kunnen moduleren en dus de fenotypen van tumorcellen 9, 10, 11. Zoals maligne ascites ontwikkelen en accumuleren in tumor progressie, ovarium tumorcellen worden blootgesteld aan fluïdumstroming en de resulterende schuifspanning. Een aantal groepen, ons inbegrepen, hebben de invloed van schuifspanning op eierstokkanker progressie getoond, waaronder cytoskelet modificaties, epitheliale naar mesenchymale transities en kanker stemness 12, 13, 14, 15. Dus een fysiologisch relevante micro belangrijk voor het onderzoek naar tumor peritoneale metastasen. De huidige in vitro hydrodynamische kweeksystemen hebben beperkingen op nabootsen en besturen van een constante, lage, fysiologisch relevante schuifspanning 16, 17, 18, 19. Conventionele in vitro studie gericht op ofwel de cellulaire of mechanische omgeving zijn nog beperkt innabootsen van de complexiteit van de intraperitoneale micro met de juiste fysiologische relevantie. Hier, om een ​​nieuw model van het peritoneum ingenieur beperkingen van conventionele strategieën overwinnen en de studie van de intraperitoneale compartiment kanker metastase bevorderen, een 3D-microfluïdische platform gecontroleerde fluïdumstroom is gemaakt. In dit model, eierstokkanker sferoïden werden samen gekweekt met primaire humane peritoneale mesotheelcellen in microfluïdische chips onder continue vloeibare stroom (Figuur 1A). De mesotheliale cellen werden uitgeplaat op fibronectine. Niet-hechtende eierstokkanker sferoïden werden uitgezaaid in microkanalen met continue stroom medium geperfundeerd door een spuitpomp. Zowel de 3D-omgeving en de dynamische mechanische krachten zijn zeer belangrijke factoren van de metastatische cascade. Dit platform kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de intraperitoneale micro qua complexe CELlaire en co-cultuur interacties, alsook met betrekking tot dynamisch mechanische signalen.

<table><tbody><tr><td>Silicon wafer</td><td>University wafer</td><td>#1196</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>SU-8 2075 photoresist&nbsp;</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer&nbsp;</td><td>Microchem</td><td>108-65-6</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td>Polydimethylsiloxaan (PDMS) + uithardingsmiddel kit</td></tr><tr><td>Biopsy punch&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>33-31AA</td><td>1 mm diameter</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen buis</td><td>SCI</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0.86 mm (binnendiameter)</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>Longer precision pump&nbsp;</td><td>&nbsp;LSP01-2A</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td>Voeg 2,2 g/L natriumbicarbonaat toe</td></tr><tr><td>MCDB 105 Medium</td><td>Sigma</td><td>M6395</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30068.02</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA oplossing&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0,05% Trypsine - 0,01% EDTA, fenol rood</td></tr><tr><td>Fibronectine menselijk</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>5-chloromethylfluoresceine diacetaat</td><td>Life technologies</td><td>C7025</td><td>Groen CMFDA</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hitachi</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Model: 80i of ECLIPSE Ti; software: SPOT</td></tr><tr><td>SKOV-3&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Gift van Dr. N Auersperg (University of British Columbia)</td></tr></tbody></table>

modelleren van eierstokkanker meercellige sferoïde gedrag in een dynamische 3d peritoneale microdevice

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Eierstokkanker wordt gekenmerkt door uitgebreide peritoneale metastase, met tumor bollen vaak gevonden in de kwaadaardige ascites. Dit wordt geassocieerd met een slechte klinische resultaten en mist momenteel effectieve behandeling. Zowel de driedimensionale (3D) omgeving en de dynamische mechanische krachten zijn zeer belangrijke factoren in dat metastatische cascade. Echter, traditionele celculturen niet aan deze natuurlijke tumor micro recapituleren. Dus, in vivo-achtige modellen die de intraperitoneale omgeving kan emuleren zijn evident belang. In deze studie werd een nieuwe microfluidic platform van het peritoneum werd opgezet om de situatie van eierstokkanker sferoïden na te bootsen in de peritoneale holte tijdens metastase. Eierstokkanker sferoïden die onder een niet-hechtende toestand werden gekweekt in microfluïdische kanalen bekleed met peritoneale mesotheelcellen onderworpen aan fysiologisch relevante shear stress. Kortom, deze dynamische 3D eierstokkanker-mesothelium microfluidic platform kan nieuwe inzichten verschaffen over fundamentele biologie van kanker en dienen als een platform voor potentiële screening en de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Met behulp van dit protocol werd een microfluïdische platform opgezet om eierstokkanker sferoïden met mesotheelcelsuppletie onder hydrodynamische omstandigheden te modelleren. Primaire humane peritoneale mesotheelcellen werden gekweekt in de micro-inrichting voor 16 uur en bekeken onder een helder-veld microscoop. Zoals getoond in Figuur 2A, is het kanaal onderste succes bedekt met een monolaag van HPMCs. Het is belangrijk dat belvorming tijdens fibronectine of HPMC patr...

Ovariële tumorprogressie te bestuderen in een fysiologisch relevante model multicellulaire sferoïden werden gekweekt in een micro-inrichting onder gesimuleerde fluïdumstroming. Deze dynamische 3D-model emuleert de intraperitoneale omgeving met de cellulaire en mechanische componenten, waar eierstokkanker metastase optreedt.

Modelleren van eierstokkanker Meercellige Sferoïde Gedrag in een dynamische 3D peritoneale microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een dynamisch microfluïdisch co-cultuurplatform om de intraperitoneale omgeving na te bootsen, inclusief de cellulaire en mechanische componenten waarin metastase van eierstokkanker plaatsvindt. Door dit microfluïdische platform te gebruiken, kan worden geholpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de kankerbiologie, zoals die over de micro-omgeving van peritoneale verspreiding. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een 3D co-cultuur onder nauwkeurig gecontroleerde vrije stroom de in vivo communicatie tussen eierstokkankercellen en mesotheelcellen in een peritoneale holte beter nabootst.Nadat het patroon van het microfluïdische kanaal is ontworpen en getekend, en is geproduceerd volgens het tekstprotocol, wordt een laag SU82075 fotoresist met een spinsnelheid van 1800 RPM via spin-coating op de siliciumwafer aangebracht. Bak de met fotoresist gecoate wafer direct op een warmteplaat bij 65 °C gedurende vijf minuten. Bak deze vervolgens bij 95 °C gedurende 25 minuten om overtollig oplosmiddel te verwijderen.Breng een tweede laag SU82075-fotolak aan op de wafer via spincoating voor een uiteindelijke dikte van 250 micrometers. Plaats de met fotolak gecoate wafer direct op een warmteplaat bij 65 degrees Celsius gedurende zeven minuten en vervolgens bij 95 degrees Celsius gedurende 30 minuten, alvorens de wafer langzaam af te koelen tot kamertemperatuur. Lijn vervolgens het fotomasker uit en plaats dit direct bovenop de wafer.Stel het vervolgens 20 seconden bloot aan UV-licht om het patroon te crosslinken. Bak de gecoate wafer op een warmteplaat 5 minuten bij 65 °C en 12 minuten bij 95 °C om het oplosmiddel voor prepolymerisatie te verwijderen. Verwijder de niet-gecrosslinkte fotoresist door de wafer 25 minuten onder te dompelen in een SU8-developer.Spoel de wafer vervolgens met isopropanol en droog deze met perslucht. Meng de Polydimethylsiloxaan of PDMS-basis en het uithardingsmiddel in een massaverhouding van 10 op 1 en gebruik de centrifugale menger met de meng- en ontgassingsfunctie om de oplossing te mengen. Giet het PDMS-mengsel langzaam op de wafer tot een hoogte van ongeveer vijf millimeter.Ontgas de PDMS in een vacuümdesiccator gedurende 40 minuten. Hard vervolgens de PDMS uit in de oven bij 65 °C gedurende twee uur. Pel de PDMS-plaat voorzichtig van de master af en trim de PDMS langs de kanalen totdat deze de afmetingen van een objectglas heeft.Gebruik vervolgens een biopsietang van één millimeter om gaten in de PDMS te ponsen voor de in- en uitlaten van het apparaat. Gebruik perslucht om het PDMS-oppervlak te reinigen en verwijder daarna met plakband het stof en de PDMS-resten. Plaats de PDMS-plaat nu met de kant van het kanaal naar boven in een plasmareiniger.Plaats vervolgens een schoon glazen objectglas in de plasmareiniger naast de PDMS-plaat. Behandel het PDMS en het objectglas onder luchtplasma bij een hoge radiofrequentie of RF-niveau gedurende één minuut. Bind na het verwijderen van de monsters uit de plasmareiniger het PDMS aan het objectglas om een irreversibele covalente binding te vormen.Plaats de PDMS-chip gedurende één uur op een warmteplaat bij 150 °C om de hechtingssterkte te verhogen en de hydrofobiciteit van de PDMS vóór gebruik te herstellen. Om de microfluïdische kanalen te coaten met fibronectine, begint u met het gebruik van 30 µL 75% ethanol om de kanalen te steriliseren. Verwijder de ethanol en gebruik PBS om de kanalen twee keer te spoelen.Aspire vervolgens het PBS grondig uit de kanalen. Bereid een fibronectine-oplossing van 10 µg/mL in serumvrij M199MCDB105-medium voor; vul de kanalen langzaam met 30 µL van deze oplossing en verzegel ze met tape. Incubeer de chip vervolgens gedurende de nacht bij 4 °C.Om primaire peritoneale mesotheelcellen of HPMCs in de microfluïdische kanalen te zaaien, gebruikt u na het spoelen van de gekweekte cellen volgens het tekstprotocol twee milliliter 10% FBS kweekmedium om de HPMCs opnieuw te suspenderen. Tel de cellen met een hemocytometer en pas de celconcentratie aan naar 3,5 × 10⁶ cellen per milliliter. Warm de met fibronectine gecoate microfluïdische chip gedurende vijf minuten op in een incubator van 37 °C voor gebruik.Aspire vervolgens de fibronectine-oplossing volledig en pipetteer langzaam 30 µL HPMC-suspensie in elk kanaal. Gebruik tape om de kanalen af te dichten en plaats het apparaat gedurende de nacht in de CO2-incubator. Om de vorming van eierstokkanker-sferoïden te induceren, lost men 0,5% agarose op in gesteriliseerd water.Dispenseer 50 µL van de agarose-oplossing in de wells van 96-wells platen. Nadat de eerder gekweekte humane epitheliale kankercellen zijn geteld, worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in kweekmedium met 5% FBS bij een dichtheid van 5.000 cellen per mL. Overbreng 200 µL van de cel-suspensie naar elke agarose-gecoate well.Kweek de cellen vervolgens bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur. Breng de kankersferoïden over naar een centrifugebuis van 50 ml die is voorbevochtigd met 1 ml serumvrij medium en centrifugeer de sferoïden bij 750 ×g gedurende vijf minuten. Bereid vervolgens een CMFDA-oplossing van 2,5 µg/ml in serumvrij M199MCDB105-medium.Resuspendeer de kankersferoïden in één milliliter van de oplossing en incubeer de sferoïden gedurende 30 minuten bij 37 °C. Tel vervolgens het aantal sferoïden en gebruik serumvrij medium om de concentratie aan te passen naar 2.000 sferoïden per milliliter. Injecteer vóór het laden van de sferoïden langzaam 100 µL serumvrij M199MCDB105-medium om de niet-geadheerde mesotelcellen in de kanalen weg te spoelen.Laad 30 µL van de fluorescentie-gelabelde sferoïdensuspensie in elk kanaal. Plaats vervolgens de microfluïdische chip in de CO2-incubator. Stel een perfusieplatform samen door een spuit gevuld met vers serumvrij M199MCDB105-medium te bevestigen aan een één meter lange slang.Plaats de spuit op de spuitpomp en bevestig de zuiger en het lichaam van de spuit. Installeer vervolgens de spuitpomp in een horizontale positie op dezelfde hoogte als de microfluïdische chip in de incubator. Vul de gehele slang snel met medium door de knop voor snelvoorschuiven ingedrukt te houden totdat het medium uit de slang stroomt.Voer vervolgens de injectie uit met de gewenste stroomsnelheid. Sluit de slang aan op de inlaat van het kanaal volgens het tekstprotocol. Gebruik daarna een korte uitlaatslang om de uitlaat van het kanaal aan te sluiten op een conische buis van 50 milliliter om het uitstromende medium op te vangen.Gebruik tot slot een lichtveld- of fluorescentiemicroscoop om de HPMC's en cancersferoïden te observeren. Met behulp van het in deze video beschreven microfluïdische platform werden eierstokkankersferoïden gemodelleerd met mesotheliale cellen onder hydrodynamische omstandigheden. Zoals in deze figuur te zien is, vormden mesotheliale cellen die gedurende 16 uur in het microapparaat waren gekweekt succesvol een monolaag van HPMC's.In dit experiment werden multicellular spheroids met diameters van ongeveer 100 micrometers, die qua grootte vergelijkbaar zijn met die in patiëntbiopten, gelabeld met de groene fluorescerende kleurstof CMFDA. De spheroids werden vervolgens overgebracht naar HPMC-gecoate microfluïdische kanalen, waar ze in suspensie bleven, waarna de celmorfologieën werden vastgelegd. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in enkele uren over drie dagen worden voltooid.Bij stap 10 van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het introduceren van luchtbellen in de microfluïdische kanalen moet worden vermeden. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals medicatietrachting, adhesie-assays en mesotheel-klaringassays, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het effect van de intraperitoneale micro-omgeving op de progressie van kanker. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de kankerbiologie om peritoneale metastasering bij mensen te bestuderen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een peritoneaal microapparaat met vloeistofstroom kunt genereren om het gedrag van eierstokkanker in de peritoneale holte te bestuderen. Vergeet niet dat het werken met organische oplosmiddelen zoals aceton, als ontwikkelaar en xyleen, extreem gevaarlijk kan zijn. Er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en een laboratoriumjas, wanneer u deze procedure voor het eerst uitvoert.Alle procedures met betrekking tot dit kantoor dienen onder strikte geheimhouding te worden uitgevoerd.

modeling-ovarian-cancer-multicellular-spheroid-behavior-dynamic-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De mesotheelcellen klaring test hier beschreven maakt gebruik van fluorescent gelabelde cellen en time-lapse video-microscopie kwantitatief te visualiseren en meten van de interacties van eierstokkanker meercellige sferoïden en mesotheelcellen cel monolagen. Deze test modelleert de eerste stappen van eierstokkanker metastase.

In vitro Mesothelial Ontruiming Assay dat de modellen van de vroege stappen van eierstokkanker Metastase

Heterotypische Driedimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellering van Stroma-epitheliale interacties tijdens eierstokkanker initiatie en progressie

In this video, we demonstrate the development of  an in vitro  three-dimensional model of the lining of the peritoneal cavity. This organotypic culture can help to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Modeling Ovarian Cancer Metastasis in Peritoneal Cavity Lining: A Method To Establish an In Vitro 3D Model of the Peritoneal Lining

In this video, we establish an ex vivo omental organ culture overlaid with GFP-expressing ovarian cancer cells to study ovarian cancer colonization within the omental explant. This protocol analyzes immune cell structures within the omentum known as milky spots that promote metastases.

Modeling Ovarian Cancer Cell Colonization of Omentum: An Ex Vivo Method to Establish Milky Spot Colonization of Fluorescently Labeled Ovarian Cancer Cells in Murine Omentum Explants

Ovariale kankercel invasie in de mesotheellaag van het peritoneum is een dynamisch proces in de tijd. Gebruik te maken van een real-time analyzer, kan de invasieve capaciteit van eierstokkanker cellen in een bolvormige-mesothelial cel co-cultuur model gekwantificeerd worden gedurende langere perioden, het verstrekken van inzicht in factoren die de het metastatische proces.

Evaluatie van eierstokkanker Sferoïde Hechting en Invasie van mesotheelcellen in Real Time

Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal in vitro model te construeren van de bekleding van de peritoneale holte, samengesteld uit primaire humane mesotheliële cellen en fibroblasten, bedekt met extracellulaire matrix, als een hulpmiddel om de adhesie, invasie en proliferatie van ovariële kankercellen te onderzoeken.

Modelleren van de eerste stappen van eierstokkanker Verspreiding in een Organotypische Cultuur van de menselijke buikholte

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Uitgebreide in vitro modellen die de relevante menselijke ziekte getrouw samenvatten, ontbreken. De huidige studie presenteert driedimensionale (3D) tumor sferoïde creatie en cultuur, een betrouwbaar in vitro hulpmiddel om de tumor-stromale interactie in humaan hepatocellulair carcinoom te bestuderen.

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

Dit protocol beschrijft de opstelling van een driedimensionaal (3D) ex vivo model van de interactie tussen kankercellen en omtentum. Het model biedt een platform voor het ophelderen van pro-tumormechanismen binnen de vetniche en voor het testen van nieuwe therapieën.

Een ex vivo-model van peritoneale metastase van eierstokkanker met behulp van humaan omentum

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Leer een dynamisch microfluidisch co-cultuurplatform maken voor eierstokkankeronderzoek. Dit 3D-model bootst de peritoneale omgeving na om celinteracties en metastase te bestuderen.

Modelleren van eierstokkanker Meercellige Sferoïde Gedrag in een dynamische 3D peritoneale microdevice

Meer video's verkennen