Modelleren van eierstokkanker Meercellige Sferoïde Gedrag in een dynamische 3D peritoneale microdevice
18 februari 2017
Ovariële tumorprogressie te bestuderen in een fysiologisch relevante model multicellulaire sferoïden werden gekweekt in een micro-inrichting onder gesimuleerde fluïdumstroming. Deze dynamische 3D-model emuleert de intraperitoneale omgeving met de cellulaire en mechanische componenten, waar eierstokkanker metastase optreedt.
Het algemene doel van deze procedure is om een dynamische microfluïdische co-cultuurplatform te creëren om de intraperitoneale omgeving na te bootsen met de cellulaire en mechanische componenten waar ovariële kankermetastase optreedt. Door dit micro voor deze platform te gebruiken, helpt het om de belangrijkste vragen in het veld van de kankerbiologie te beantwoorden, zoals de micro-omgeving van peritoneaal verspreiding. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een 3D co-cultuur onder precies gecontroleerde vrije stroming de in vivo communicatie tussen ovariële kankercellen en methothediacellen die optreedt in een peritoneale holte beter nabootst.
Na het ontwerpen en tekenen van het microfluïdische kanaalpatroon en het produceren volgens het tekstprotocol, draai een laag SU82075 Fotoresist op de siliconenwafer met een draaisnelheid van 1800 RPM. Bak de met Fotoresist beklede wafer direct op een hotplate op 65 graden Celsius gedurende vijf minuten. En vervolgens op 95 graden Celsius gedurende 25 minuten om overtollig oplosmiddel te verwijderen.
Draai een tweede laag SU82075 Fotoresist op de wafer voor een einddikte van 250 micrometer. Plaats de met Fotoresist beklede wafer direct op een hotplate op 65 graden Celsius gedurende zeven minuten en vervolgens op 95 graden Celsius gedurende 30 minuten voordat je de wafer langzaam afkoelt tot kamertemperatuur. Vervolgens align en plaats de fotomasker direct bovenop de wafer.
Stel het vervolgens bloot aan UV-licht gedurende 20 seconden om het patroon kruislings te maken. Bak de beklede wafer op een hotplate op 65 graden Celsius gedurende vijf minuten en 95 graden Celsius gedurende 12 minuten om het oplosmiddel voor prelimerisation te verwijderen. Verwijder de niet-kruislings beklede Fotoresist door de wafer gedurende 25 minuten in een SU8-ontwikkelaar te dompelen.
Spoel de wafer vervolgens met isopropanal en gebruik geperste lucht om hem te drogen. Combineer de Polydimethylsiloxaan of PDMS-basis en het verhardingsmiddel in een 10-tot-een massa-verhouding en gebruik de centrifugale mixer onder de meng- en ontgassingsfunctie om de oplossing te mengen. Giet de PDMS-mengsel langzaam op de wafer tot een hoogte van ongeveer vijf millimeter.
Ontgas de PDMS gedurende 40 minuten in een vacuümdroger. Bak vervolgens de PDMS in de oven op 65 graden Celsius gedurende twee uur. Schil voorzichtig de PDMS-plaat van de master en trim de PDMS langs de kanalen tot het de grootte van een glazen dia heeft.
Punc de PDMS vervolgens met een biopsiepomp van één millimeter om de ingangen en uitgangen van het apparaat te maken. Gebruik geperste lucht om het PDMS-oppervlak te reinigen en verwijder vervolgens het stof en PDMS-debris met plakband. Plaats nu de PDMS-plaat met de kanaalzijde naar boven in een plasmareiniger.
Plaats vervolgens een schone glazen dia in de plasmareiniger naast de PDMS-plaat. Behandel de PDMS en glazen dia onder luchtplasma op een hoog radiofrequentie of RF-niveau gedurende één minuut. Nadat je de monsters uit de plasmareiniger hebt verwijderd, bind de PDMS aan de glazen dia om een onomkeerbare covalente binding te maken.
Plaats de PDMS-chip op een hotplate op 150 graden Celsius gedurende één uur om de bindingskracht te versterken en de hydrofobiciteit van de PDMS terug te brengen voor gebruik. Om microfluïdische kanalen met fibronectine te coaten, begin met het gebruik van 30 microliter 75% ethanol om de kanalen te steriliseren. Verwijder de ethanol en gebruik PBS om de kanalen twee keer te spoelen.
Aspirate vervolgens het PBS grondig uit de kanalen. Bereid 10 microgram per milliliter fibronectineoplossing in serumvrij M199MCDB105-medium voor met 30 microliter van de oplossing, vul de kanalen langzaam op en sluit ze af met tape. Incubeer vervolgens de chip gedurende één nacht bij vier graden Celsius.
Om primaire peritoneaal mesotheliumcellen of HPMC's in de microfluïdische kanalen te zaaien, gebruik na het spoelen van gekweekte cellen volgens het tekstprotocol twee milliliter 10%FBS-cultuurmedium om de HPMC's op te schorsen. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en pas de celconcentratie aan tot 3,5 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter. Verwarm de met fibronectine beklede microfluïdische chip in een 37 graden Celsius incubator gedurende vijf minuten voor gebruik.
Aspirate vervolgens de fibronectineoplossing volledig en pipet 30 microliter HPMC-suspensie langzaam in elk kanaal. Sluit de kanalen af met tape en plaats het apparaat gedurende één nacht in de CO2-incubator. Om de vorming van ovariële kankersferoïden te induceren, los 0,5% agarose op in gesteriliseerd water.
Doseer 50 microliter van de agaroseoplossing in de putjes van 96-putjes platen. Tel na het tellen van eerder gekweekte humane epitheliale kankercellen de cellen opnieuw op in 5%FBS-cultuurmedium met een dichtheid van 5.000 cellen per milliliter. Breng 200 microliter celsuspensie over in elk agarose-gecoate put.
En kweek de cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius en vijf procent CO2. Breng de kankersferoïden over naar een 50-milliliter centrifugeerbuis vooraf bevochtigd met één milliliter serumvrij medium en centrifugeer de sfeeroïden gedurende vijf minuten bij 750 keer G. Volg de bereiding van 2,5 microgram per milliliter CMFDA-oplossing in serumvrij M199MCDB105-medium.
Tel de kankersferoïden opnieuw op in één milliliter van de oplossing en incubeer de sfeeroïden gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Tel vervolgens het aantal sfeeroïden en pas de concentratie aan tot 2.000 sfeeroïden per milliliter met serumvrij medium. Voorafgaand aan het laden van de sfeeroïden, injecteer langzaam 100 microliter serumvrij M199MCDB105-medium om de niet-gehechte mesotheliumcellen in de kanalen weg te spoelen.
Laad 30 microliter van de fluorescent-gelabelde sfeeroïdensuspensie in elk kanaal. Plaats vervolgens de microfluïdische chip in de CO2-incubator. Monteer een profusieplatform door een spuit gevuld met vers serumvrij M
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een dynamisch, op microfluidica gebaseerd co-cultuurplatform dat is ontworpen om de intraperitoneale omgeving te emuleren die relevant is voor metastasering van eierstokkanker. Het model faciliteert het onderzoek naar de micro-omgeving die betrokken is bij de peritoneale verspreiding van ovariumtumoren.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Ovariumkankeronderzoek
- Microfluidica
- 3D-celkweek
Achtergrond
- Eierstokkanker metastaseert vaak binnen de peritoneale holte.
- Het begrijpen van de tumormicro-omgeving is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve therapieën.
- Dynamische modellen kunnen in vivo condities beter nabootsen dan statische culturen.
- Microfluïdische systemen maken een nauwkeurige controle van cellulaire interacties mogelijk.
Doel van de studie
- Om een model te creëren dat de peritoneale omgeving nabootst voor het bestuderen van eierstokkanker.
- Om de interacties tussen eierstokkankercellen en de omringende micro-omgeving te onderzoeken.
- Om kernvragen in de kankerbiologie met betrekking tot peritoneale verspreiding te beantwoorden.
Gebruikte methoden
- Ontwerp en vervaardiging van een microfluïdisch kanaalpatroon.
- Co-cultuur van eierstokkankercellen met methothedia-cellen.
- Spin-coating van SU82075 fotoresist op een siliciumwafer.
- Gecontroleerd bakken van de met fotoresist gecoate wafer om overtollig oplosmiddel te verwijderen.
Belangrijkste Resultaten
- Het microfluïdische platform bootst de in vivo-omgeving succesvol na.
- Verbeterd inzicht in celcommunicatie in de peritoneale holte.
- De haalbaarheid van het gebruik van dynamische 3D-culturen voor kankeronderzoek is aangetoond.
- Inzichten verschaft in de mechanismen van metastase bij eierstokkanker.
Conclusies
- Het ontwikkelde microfluïdische model is een waardevol instrument voor het bestuderen van de progressie van eierstokkanker.
- Het maakt het mogelijk om cellulaire interacties in een gecontroleerde omgeving te onderzoeken.
- Deze benadering kan leiden tot betere therapeutische strategieën tegen eierstokkanker.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Metastase van eierstokkanker in de peritoneale holte blijft een grote uitdaging bij de ontwikkeling van oncologische geneesmiddelen vanwege het gebrek aan fysiologisch relevante modellen die zowel de 3D-tumorarchitectuur als dynamische vloeistofkrachten vatten. Dit microfluïdische platform vult een kritisch gat door de bestudering van tumor-stromale interacties onder gecontroleerde schuifspanning mogelijk te maken, wat een verbeterde voorspellende waarde biedt voor mechanismen van peritoneale verspreiding. Door een reproduceerbaar, dynamisch 3D-cocultuursysteem te bieden, ondersteunt het model vroege targetvalidatie en mechanistische risicoreductie bij de ontdekking van therapeutica voor eierstokkanker.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar het gedrag van eierstokkanker-sferoïden in een peritoneum-achtige micro-omgeving om therapeutische targets die betrokken zijn bij metastase te valideren.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele target-validatie door cel-celcommunicatie tussen kankersferoïden en mesotheliale monolagen onder stroming te modelleren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare resultaten voor sferoïde-migratie en -adhesie onder schuifspanning voor compound-screening onder metastase-relevante condities.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd, dynamisch 3D-platform voor assay-ontwikkeling met compatibiliteit voor real-time imaging en schaalbare belading van sferoïden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van patiëntrelevante sferoïdegroottes (~100 μm) en peritoneale mesotheelcellen om de translationele getrouwheid van preklinische modellen te verbeteren.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking naar preklinische evaluatie door ondersteuning van downstream-assays, zoals medicijnbehandeling en klaringmetingen.
Pipeline- & Workflowintegratie
Het platform past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelwit-hypotheses tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor programma's gericht op eierstokkanker-metastasen waarbij de getrouwheid van de micro-omgeving invloed heeft op de voorspellende betrouwbaarheid.
- Discovery Biology: Faciliteert mechanische risicoreductie door te modelleren hoe de dynamiek van het peritoneale vocht het gedrag van sferoïden en mesotheliale interacties beïnvloedt.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten, zoals migratie en adhesie van sferoïden onder stroming, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk maakt.
- Analytics: Ondersteunt fluorescentiegebaseerde tracking en morfometrische analyse van het gedrag van sferoïden in real time onder gecontroleerde omstandigheden.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van klinisch relevante dimensies van sferoïden en peritonele celtypen om de relevantie voor humane metastase te verbeteren.
- Enterprise Reuse: Ontworpen als een modulair microfluïdisch systeem dat aanpasbaar is aan meerdere kankertypes en stromale co-culturen buiten eierstokkanker.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het voorspellende vertrouwen door biomechanische en biochemische signalen vast te leggen die ontbreken in statische 2D- of 3D-culturen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor kanaalcoating, het laden van sferoïden en debietregeling.
- Strategische waarde: Vermindert het risico op falen in een laat stadium door een vroegere beoordeling van micro-omgevingsafhankelijke medicijnresponsen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten die gericht zijn op metastase via fysiologisch relevante preklinische modellering.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in microfluïdisch ontwerp, fotolithografie en PDMS-bonding is vereist voor de fabricage van het apparaat.
- Fluorescentiemicroscopie en mogelijkheden voor beeldanalyse zijn nodig om gelabelde sferoïden en cellulaire interacties te volgen.
- Standaardisatie tussen teams vereist strikte naleving van protocollen voor kanaalcoating, celzaai en stroomsnelheid.
- Aanpassing aan andere tumortypen kan optimalisatie van de sferoïdegrootte, de bron van stromale cellen en de parameters voor schuifspanning vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de complexiteit van de assemblage van het apparaat en de noodzaak van aseptische behandeling tijdens meerdaagse kweek onder stroming.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
0:49
Microfluidic Device Master Design
2:32
Polydimethylsiloxane Chip Fabrication
4:26
Seeding the Microfluidic Chip with Primary Peritoneal Mesothelial Cells
6:08
Ovarian Cancer Spheroid Formation and Co-culture
8:09
Perfusion Platform Assembly and Co-culture
9:16
Results: Ovarian Cancer Spheroid Behavior in a 3D Peritoneal Microfluidic Device
10:09
Conclusion
