Behandeling van ligamentconstructen met uitoefening geconditioneerd serum: een translatie weefsel techniek model

Het algemene doel van dit model is om de impact van oefening en voeding op de synthese en functie van bindweefsel te bepalen. Deze techniek gebruikt menselijk serum dat voor en na het sporten wordt genomen om 3D-weefsels te behandelen, zodat we kunnen begrijpen hoe oefening de functie van ligamenten en pezen beïnvloedt. 3D-weefselverzekering combineert de voordelen van goed gekarakteriseerde in vitro-assays met de functie, morfologie en biochemische kenmerken van in vivo-weefsels.

Na het van tevoren voorbereiden van silicium-gecoate 35-millimeter platen volgens het tekstprotocol, bereid ankervormen voor door één minutien-pin in het midden van elke cilindrische put in de mallen te plaatsen. Combineer beta-tricalciumfosfaat en orthofosforische citroenzuuroplossing bij één tot drie gram per milliliter in een plastic weegschaal op ijs. Gebruik een plastic celschraper om het cement krachtig te mengen.

Tritureer het cement om te blijven mixen en pipet de mix in de mallen, centrifugeer vervolgens de gevulde mal gedurende vijf minuten bij 2.250 keer g. Laat na de centrifugatie de brushiete cementankers overnacht op kamertemperatuur uitharden. Verwijder de volgende ochtend de ankers uit de mal en pin twee ankers, 12 millimeter uit elkaar in elke silicium-gecoate plaat.

Steriliseer de gespinde platen door ze te besproeien met 70% ethanol, vul zowel de platen als de deksels, plaats de platen vervolgens in een biologische veiligheidskast of BSC. Na minimaal 30 minuten, aspibeer de platen en laat ze in de BSC proberen. Plaats de deksels terug en bewaar ze in de BSC tot ze nodig zijn.

Volg de lokale biogevarenregelgeving voor het juiste gebruik en de juiste verwijdering van biogevaarlijk materiaal. Behoud de steriliteit en voer de constructieformatiestappen uit in een biologische veiligheidskast. Na het voorbereiden van primaire fibroblasten, reagentia en silicium-gecoate platen met gespinde brushiete ankers, volgens het tekstprotocol, kweek de cellen in 15 centimeter platen tot 70%confluentie.

Bereid vervolgens een mastermix voor die bestaat uit de volgende ingrediënten: 681 microliter per construct van celsuspensie, 29 microliter per construct van trombine, twee microliter per construct van aprotinine, en twee microliter per construct van aminohexaanzuur. Nadat de oplossing goed is gemengd, voeg 714 microliter toe aan elke gespinde plaat in een figuur-achtpatroon rond de brushiete cementankers, zorg ervoor dat de mastermix direct contact maakt met de zijden van de ankers. Tik zachtjes op elke plaat om de mix gelijkmatig te verdelen.

De meest kritische stap is het vormen van de cel-gezette fibrinegel. Zorg ervoor dat de mastermix voor cel-zetten direct contact maakt met de ankers en tik op de plaat om het mengsel gelijkmatig te verdelen. Voeg één plaat per keer 286 microliter fibrinogeen toe in druppelsgewijze vorm gelijkmatig over de plaat.

Schuif onmiddellijk de plaat heen en weer en van links naar rechts om het fibrinogeen te verdelen om de cel-ingebette fibrinegels te vormen, ga dan naar de volgende plaat. Plaats de constructen in een steriele incubator die wordt gehandhaafd op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, en incubeer ze gedurende minimaal 15 minuten om polymerisatie van het fibrinogeen mogelijk te maken. Bereid twee milliliter per construct voedingsmedium door groeimedium aan te vullen met 200 micromol ascorbic zuur, 50 micromol Prolene en vijf nanogram per milliliter TGF bèta 1.

Gebruik twee milliliter voedingsmedium om elk construct te bedekken en kweek de constructen in een steriele incubator die wordt gehandhaafd op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende een totaal van 14 dagen, of tot het gewenste eindpunt, waarbij het medium om de twee dagen wordt ververst met twee milliliter voedingsmedium. Om menselijk serum te verzamelen, neem een rustend bloedmonster volgens het tekstprotocol en laat deelnemers een manier van oefening uitvoeren die past bij uw onderzoeksdoel. Hier is een 30 minuten durende training van hoog intensieve weerstandsoefening getoond.

Verzamel een bloedmonster 15 minuten na de oefensessie en laat na het laten stollen van het bloed het monster 10 minuten bij 1.500 keer g centrifugeren. Onder steriele omstandigheden breng het serum over naar steriele buisjes voor mediavoorbereiding. Voer na de voorbereiding van de ligamentconstructen trekproeven uit met behulp van een trekproefmachine in een PBS-bad met omgekeerd gegoten grijpers die zijn gekoppeld aan de krachttransducer.

Die de brushiete cementankers tijdens het testen op hun plaats houdt. Bepaal met behulp van digitale schuifmaten de lengte en breedte van de ligamentconstructen en bereken het dwarsdoorsnedegebied van het weefsel. Ontgrendel het ligamentconstruct van de plaat en plaats de ankers in de omgekeerd gegoten grijpers, zorg ervoor dat het construct ondergedompeld is in PBS en pas vervolgens de afstand tussen de grijpers aan, waarbij de lengte van het construct op zijn oorspronkelijke lengte wordt ingesteld.

Begin met de test en belast het construct tot het breekpunt met een belastingssnelheid van 0,4 millimeter per seconde, of 3% per seconde. Na de test verwerkt u het weefsel en voert u collageenkwantificering uit van de geëngINEERDE ligamenten volgens het tekstprotocol. Na één tot twee dagen in cultuur hebben de ACL-fibroblasten zich gehecht aan de fibrinegel, verlengde celprocessen en zijn begonnen met het uitoefenen van trekkrachten.

Er ontstaat spanning tussen de twee ankerpunten en de cellen lijnen zich parallel aan deze as uit en beginnen collageen af te zetten. Hier is een representatieve spannings-verlengingsgrafiek weergegeven voor een ligament dat tot het breekpunt is getest. In deze experimenten werd menselijk serum geïsoleerd uit pre- en post-oefening bloedmonsters en werd gebruikt in plaats van FBS om media aan te maken die is verrijkt met de door oefening geïnduceerde biochemische omgeving.

Zoals weergegeven in deze grafiek, vertoonden de ligamentconstructen na een cultuurperiode van 14 dagen een significante toename in zowel maximale treklast als collageengehalte als reactie op het post-oefening serum. Eenmaal onder de knie, kunnen ligamentconstructen in de loop van t