Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

Het algemene doel van dit protocol is om onderzoekers in staat te stellen natuurlijke eiwitcomplexen, geëxtraheerd uit weefsellysaten, vast te leggen, te scheiden en te analyseren met behulp van polyacrylamidegelelektroforese. Deze methode kan onderzoekers die eiwitten bestuderen ondersteunen, omdat het in staat is om anders labiele eiwitassociaties onder bijna-natuurlijke condities te stabiliseren, waardoor identificatie en daaropvolgende analyse mogelijk worden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er gebruik wordt gemaakt van gangbare biologische methoden, waardoor deze breed toepasbaar is en kan worden aangepast aan de doelen van de individuele onderzoeker.

Om deze procedure te starten, bereidt u de blue native polyacrylamidegelelektroforese voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Sluit de elektroden aan op de spanningsbron en voer de elektroforese van de eiwitten in de gel uit bij 150 volt totdat de kleurstofband ongeveer twee centimeter in de scheidingslaag is gevorderd. Stop op dit punt en koppel de spanningsbron los.

Scheid na het demonteren van het elektroforeseapparaat de glazen platen van de gelcassette. Verwijder en gooi de stapellaag weg. Snijd de gel voorzichtig net onder de onderrand van het kleurfront door, waarbij u erop let dat deze snede zo glad en recht mogelijk is.

Vervolgens wordt het ongebruikte deel van de gel weggegooid. Trim eventuele ongebruikte delen langs de randen van de gelstrip weg. Plaats de strip voorzichtig in 10 milliliters fosfaatgebufferde zoutoplossing in een kleine houder en meng deze gedurende 30 minuten voorzichtig door middel van rotatie om te equilibreren.

Giet na equilibratie de PBS af en vervang deze door een nieuwe 10 milliliters. Pipetteer 500 microliters 25 millimolar DSP opgelost in dimethylsulfoxide in de PBS en meng dit gedurende 30 minuten voort zoals eerder beschreven. Giet na 30 minuten de DSP-oplossing af.

Voeg 10 milliliters 0,375 molar HSCL toe, pH 8,8, met 2% sodium dodecyl sulfate om het ongereageerde DSP te neutraliseren. Zet de incubatie voort gedurende 15 minuten. Terwijl de gelstrip wordt geneutraliseerd, bereidt u de SDS-PAGE gelloplossingen volgens standaardmethoden.

Voeg de polymerisatiereagentia niet toe. Breng na het quenchen de blue native gelstrip terug naar kamertemperatuur en giet de strip in een nieuwe gelcassette. Om dit te doen, til je de gel voorzichtig op en plaats je deze op een schone tussenplaat van een gelcassette.

Positioneer de strip zodanig dat deze is omgeklapt ten opzichte van de vorige oriëntatie en de onderkant van het kleurfront zich het dichtst bij de bovenkant van de nieuwe cassette bevindt. Plaats de strip zodanig dat de bovenrand gelijk ligt aan de plek waar de bovenrand van de afdekplaat zal komen. Zorg ervoor dat het kleurfront parallel loopt aan de horizontale randen van de glasplaat.

Duw één zijde van de uitgesneden strip tegen een van de wanden van de afstandhouder, waarbij aan de andere zijde ruimte wordt gelaten om de gel te gieten en een eiwitstandaard of ladder te laden. Als de onderste rand van de gelstrip rafelige of ongelijkmatige delen bevat, snij deze dan voorzichtig weg. Zodra de gelstrip correct is geplaatst, legt u de dekplaat over de afstandhouderplaat.

Oefen een lichte druk uit om eventuele ingesloten luchtbellen te verdrijven. Ga verder met het assembleren van de apparaat voor het gieten van de gel volgens de instructies van de fabrikant. De gelstrip kan soms verschuiven wanneer de bovenplaat wordt geplaatst.

Het is handig om de strip een klein beetje over de rand van de bovenplaat te laten hangen, zodat deze met een spatel kan worden aangepast om eventuele verschuivingen te corrigeren. Voeg de polymerisatiereagentia toe aan de buffer voor de scheidingsgel en giet deze met een serologische pipet in de voorbereide gelcassette. Vul de gelcassette tot ongeveer twee centimeter onder de uitgesneden blue native PAGE-gelstrip om ruimte over te laten voor de stapellaag.

Voeg vervolgens 100 µL butanol toe bovenop de gegoten gel en laat de scheidingslaag 30 minuten polymeriseren voordat de butanol wordt weggegoten. Voeg daarna de polymerisatiereagentia toe aan de oplossing voor de stapellaag. Giet met een serologische pipette de stapellaag om alle resterende lege ruimte in de gelcassette te vullen.

Kantel de gelcassette terwijl de stapellaag wordt gegoten, zodat de ruimte onder de gelstrip wordt gevuld en er geen luchtbellen worden ingesloten. Terwijl de buffer voor de stapelgel de lege ruimte onder de gelstrip vult, brengt u de gelcassette geleidelijk terug naar een waterpas positie. Vul de lege ruimte naast de uitgesneden gelstrip verder met de buffer voor de stapelgel totdat deze bijna overloopt.

Laat de stapellaag vervolgens 30 minuten polymeriseren. Nadat de stapellaag is gepolymeriseerd, verwijdert u de gelcassette uit het gietapparaat, spoelt u deze af met gedestilleerd water en stelt u het elektroforeseapparaat samen volgens de instructies van de fabrikant. Vul de binnenkamer volledig met 1x SDS-PAGE loopbuffer.

Vul vervolgens de buitenkamer tot het door de fabrikant aangegeven niveau. Vul de ruimte naast de uitgesneden gelstrip met een molecuulgewichtsladder of de passende eiwitstandaard. Sluit de elektroden aan op de stroombron en voer de elektroforese van de monsters uit bij 120 volt.

Wanneer de Coomassie-kleurstof van de gel afloopt, stopt u de run en koppelt u de voeding los. Analyseer de gel met standaardmethoden voor electroblotting en antilichaamgebaseerde proteïnedetectie. De validatie van multimeer-PAGE wordt hier getoond via immunoblot.

Het gevangen kinesinecomplex wordt gesplitst door diphyo-3-itol, wat aantoont dat de aggregaten met een hoog molecuulgewicht zijn gevormd door cross-linking van kleinere substituenten. Hier is afgebeeld dat hersenlysaten behandeld met toenemende concentraties SDS of Triton de detectie van monomeer alfa-synucleïne verhoogden, terwijl de detectie van de oplosbare oligomeer tetrameer afnam. Hier worden representatieve resultaten getoond van multimeer-PAGE die gebruikt is om oplosbare complexen in rattenhersenlysaat vast te leggen.

Eiwitten werden gedetecteerd via immunoblot. Het verwachte monomere gewicht van elk eiwit wordt onder de banen weergegeven. Op dezelfde wijze wordt hier de capture van membraangebonden complexen getoond.

Multimeer-PAGE slaagt er soms niet in om een complex vast te leggen, zoals te zien is op de blot van het SDHA-respiratoire complex twee. Een bespreking van mogelijke verklaringen hiervoor is te vinden in het tekstprotocol. Wanneer de techniek eenmaal beheerst is, kan deze in ongeveer acht uur worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u in-gel cross-linking van native eiwitcomplexen uitvoert, gevolgd door het opnieuw gieten van de gel en scheiding via secundaire SDS-PAGE. Vergeet niet dat werken met acrylamide extreem gevaarlijk kan zijn en dat persoonlijke beschermingsmiddelen gedragen moeten worden tijdens het gieten van de gel. Na deze procedure kunnen de gescheiden gestabiliseerde complexen uit de gel worden geëlueerd of uitgesneden en op diverse manieren worden geanalyseerd, waaronder immunodetectie of massaspectrometrie, afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker.