Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples
May 5th, 2017
Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van dit protocol is om onderzoekers in staat te stellen native eiwitcomplexen te vangen, scheiden en analyseren die zijn geëxtraheerd uit weefsellysaten met behulp van polyacrylamidegelelektroforese. Deze methode kan onderzoekers die eiwitten bestuderen helpen omdat het in staat is om anders labiele eiwitassociaties te stabiliseren onder bijna-native omstandigheden, waardoor hun identificatie en daaropvolgende analyse mogelijk wordt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruik maakt van veelvoorkomende biologische methoden, dus het is wijd toepasbaar en kan worden aangepast aan de doelen van de individuele onderzoeker.
Om deze procedure te beginnen, bereid de blue native polyacrylamide gelelektroforese voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Verbind de elektroden met de stroomvoorziening en elektroforiseer de eiwitten in de gel bij 150 volt totdat de kleurband ongeveer twee centimeter in de oplossende laag is gevorderd. Op dit punt, stop en ontkoppel de stroomvoorziening.
Nadat het elektroforeseapparaat is gedemonteerd, scheid de glazen panelen van de gelcassette. Verwijder en gooi de staplagen weg. Snijd voorzichtig de gel net onder de onderrand van de kleurfront, zorg ervoor dat deze snede zo glad en recht mogelijk is.
Gooi vervolgens het ongebruikte stuk gel weg. Verwijder ongebruikte delen langs de randen van de gelstrip. Plaats de strip voorzichtig in 10 milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing in een klein bakje en meng voorzichtig door middel van notatie gedurende 30 minuten om te gelijkmaken.
Na het gelijkmaken, gooi de PBS weg en vervang het door nog eens 10 milliliter. Pipetteer 500 microliter van 25 millimolair DSP opgelost in dimethylsulfoxide in de PBS en blijf mixen zoals voorheen gedurende 30 minuten. Na 30 minuten, giet de DSP-oplossing weg.
Bij 10 milliliter van 0,375 molair HSCL, pH 8,8, met 2% natriumdodecylsulfaat om het ongereageerde DSP te doven. Blijf noteren gedurende 15 minuten. Terwijl de gelstrip wordt gedood, bereid de SDS-PAGE geloplossingen volgens standaardmethoden voor.
Voeg de polymerisatiereagentia niet toe. Na het doven, breng de blue native gelstrip terug naar kamertemperatuur en giet de strip in een nieuwe gelcassette. Om dit te doen, pak de gel voorzichtig op en plaats hem op een schone gelcassette ruimteplaat.
Oriënteer de strip zodat deze van zijn vorige oriëntatie wordt omgedraaid en de onderkant van de kleurfront het dichtst bij de bovenkant van de nieuwe cassette is. Plaats de strip zodanig dat de bovenrand gelijk ligt met waar de bovenrand van de dekplaat zal zijn. Zorg ervoor dat de kleurfront evenwijdig is aan de horizontale randen van de glazen plaat.
Duwt een kant van de uitgesneden strip tegen een van de ruimtewanden, waarbij aan de andere kant ruimte wordt gelaten voor de gel te gieten en een eiwitstandaard of ladder te laden. Als de onderrand van de gelstrip enige ruwe of ongelijke gebieden bevat, knip deze voorzichtig weg. Zodra de gelstrip correct is gepositioneerd, leg de dekplaat over de ruimteplaat.
Oefen lichte druk uit om eventuele vastzittende luchtbellen uit te duwen. Ga door met het assembleren van het gel-gietapparaat volgens de instructies van de fabrikant. De gelstrip verschuift soms wanneer de bovenplaat wordt geplaatst.
Het helpt om de strip een beetje over de rand van de bovenplaat te laten hangen, zodat deze kan worden aangepast met een spatel om eventuele verschuivingen te corrigeren. Voeg polymerisatiereagentia toe aan de oplossende gelbuffer en giet het in de voorbereide gelcassette met behulp van een serologische pipet. Vul de gelcassette tot ongeveer twee centimeter onder de uitgesneden blue native PAGE gelstrip om ruimte te laten voor de staplagen.
Voeg vervolgens 100 microliter butanol toe over de bovenkant van de gegoten gel en laat 30 minuten staan voor polymerisatie van de oplossende laag voordat u het butanol afgiet. Voeg vervolgens de polymerisatiereagentia toe aan de staplagenoplossing. Giet met behulp van een serologische pipet de staplagen om alle resterende lege ruimte in de gelcassette te vullen.
Kanteel de gelcassette terwijl de staplaag wordt gegoten, zodat deze de ruimte onder de gelstrip vult en er geen luchtbellen worden vastgehouden. Terwijl de staplaagbuffer de lege ruimte onder de gelstrip vult, breng de gelcassette geleidelijk terug naar een vlakke voet. Blijf de lege ruimte naast de uitgesneden gelstrip vullen met de staplaagbuffer tot het bijna overstroomt.
Laat vervolgens de staplaag 30 minuten polymeriseren. Nadat de staplaag is gepolymeriseerd, verwijder de gelcassette van het gietapparaat, spoel deze af met gedestilleerd water en assembleer het elektroforeseapparaat volgens de instructies van de fabrikant. Vul de binnenkamer volledig met 1x SDS-PAGE-loopbuffer.
Vul vervolgens de buitenste kamer tot het niveau dat door de fabrikant is aangegeven. Laad de ruimte naast de uitgesneden gelstrip met een moleculair gewichtsladder of de juiste eiwitstandaard. Bevestig de elektroden aan de stroomvoorziening en elektroforiseer de monsters bij 120 volt.
Wanneer de Coomassie-kleurstof uit de gel loopt, stop de run en ontkoppel de stroomvoorziening. Analyseer de gel met behulp van standaardmethoden voor elektroblotting en antilichaam-gebaseerde eiwitdetectie. Validatie van multimer-PAGE wordt hier getoond via immunoblot.
Het gevangen kinesincomplex wordt gesplitst door diphyo-3-itol, wat aantoont dat de hoge moleculaire gewichtsaggregaten worden gevormd door cross-linking van kleinere substituenten. Hier getoond, hersenlysaten behandeld met toenemende concentraties SDS of Triton verhoogden de detectie van monomere alpha-synucleïne terwijl de detectie van het oplosbare oligomeer tetromer afnam. Hier worden representatieve resultaten van multimer-PAGE getoond die worden gebruikt om oplosbare complexen in rattenhersenlysaat te vangen.
Eiwitten werden gedetecteerd via immunoblot. Het verwachte monomere gewicht van elk eiwit wordt onder de banen getoond. Evenzo wordt de opvang van membraangebonden complexen hier getoond.
Multimer-PAGE
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol presenteert een methode voor het stabiliseren en scheiden van inheemse eiwitcomplexen uit weefsellysaten met behulp van een nieuwe tweedimensionale polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) systeem. Het maakt de analyse van eiwitassociaties mogelijk onder bijna-natuurlijke omstandigheden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Proteomics
- Elektroforese
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitcomplexen is cruciaal voor veel biologische studies.
- Inheemse eiwitassociaties kunnen labil zijn en moeilijk te analyseren.
- Gemeenschappelijke biologische methoden vergemakkelijken de toepassing van deze techniek.
- Deze methode maakt aangepaste benaderingen van eiwitanalyse mogelijk.
Doel van de studie
- Om inheemse eiwitcomplexen uit weefsellysaten vast te leggen en te analyseren.
- Om eiwitassociaties te stabiliseren voor betere identificatie.
- Om een breed toepasbare methode voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding voor blauwe inheemse polyacrylamidegelelektroforese.
- Elektroforese van eiwitten bij 150 volt.
- Bewaken van de voortgang van de kleurstofband in de gel.
- Gebruik van een amine-reactieve eiwitcrosslinker.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle stabilisatie van inheemse eiwitcomplexen.
- Effectieve scheiding van eiwitten in weefsellysaten.
- Identificatie van eiwitassociaties onder bijna-natuurlijke omstandigheden.
Conclusies
- Deze methode verbetert de analyse van eiwitcomplexen.
- Het is aanpasbaar aan verschillende onderzoeksdoelen.
- Het gebruik van gemeenschappelijke methoden verhoogt de toegankelijkheid voor onderzoekers.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Multimer-PAGE enables biopharma R&D teams to stabilize and resolve native protein complexes from tissue lysates under near-native conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By preserving labile protein associations that are often lost in conventional purification, the method improves predictive confidence in pathway analysis and complex-based drug target identification. This approach enhances translational continuity from discovery through preclinical evaluation by providing reproducible, quantitative readouts of complex formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing native protein interactions without perturbing non-covalent bindings.
- Operational Value: Uses accessible blue-native and SDS-PAGE techniques familiar to most molecular biology teams, reducing specialized training needs.
- Predictive Value: Supports functional target validation by stabilizing complexes for downstream identification via immunoblot or mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates resolved complex profiles that can serve as quantitative biomarkers for assay standardization across screening campaigns.
- Operational Value: Relies on inexpensive, widely available reagents and equipment, enabling scalable implementation in core facilities.
- Assay Readiness: Produces SDS-PAGE-separated complexes compatible with downstream detection methods like immunodetection, supporting high-content screening integration.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by preserving complex integrity for validation in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of complex formation under varying conditions (e.g., detergent or SDS exposure), informing target robustness.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on complex stability and abundance, reducing late-stage attrition due to mechanistic uncertainty.
Pipeline & Workflow Integration
Multimer-PAGE fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing a mechanistic bridge to preclinical validation by enabling analysis of native protein complexes in tissue-derived samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing endogenous complexes from unmodified tissue lysates.
- Screening: Enables assay development through reproducible complex separation and detection, facilitating compound effect evaluation on target engagement.
- Analytics: Delivers quantitative separation of protein complexes via secondary SDS-PAGE, allowing comparison of conditions or treatments.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining complex stability for validation in disease models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability rather than a single-use assay, adaptable across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction networks.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized gel-based workflows and familiar electrophoresis techniques.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, minimizing investment in poorly validated mechanisms.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of complex formation and stability in native contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE and SDS-PAGE techniques, including gel casting and electrophoretic separation.
- Depends on access to electrophoresis apparatus, power supplies, and standard reagents such as DSP crosslinker and SDS.
- Necessitates cross-team standardization for consistent complex capture and detection across discovery and preclinical groups.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and complex sizes, as separation efficiency may vary with molecular weight.
- Limited by challenges in resolving extremely large complexes and potential variability in crosslinking efficiency, as noted in source material.
