Isoleren en analyseren van cellen van de pancreas mesenchym door flowcytometrie

Het algemene doel van deze procedure is om pancreatische mesenchymale cellen te isoleren voor hun gen- en oppervlaktemarkerexpressieanalyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van pancreasontwikkeling, zoals welke signalen worden uitgedrukt door mesenchymale cellen en hoe deze de epitheliale ontwikkeling beïnvloeden. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het relatief eenvoudig en snel is, en dat het een goede opbrengst aan gesorteerd cellen mogelijk maakt.

Begin met het afzetten van de inwendige organen in een kweekschaal met HBSS en plaats de schaal onder een stereomicroscoop. Los de lever en nieren los om de pancreas bloot te leggen en gebruik fijne pincetten om de pancreas van de maag, twaalfvingerige darm en milt te verwijderen. Breng bij elke verzamelde pancreas het weefsel over in een kegelvormige buis met vers bereid verteringsbuffer en plaats de buis op ijs.

Wanneer alle pancreassen zijn geoogst, breng de weefsels over naar een verwarmingsblok van 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met agitatie bij 700 RPM, waarbij de buizen handmatig drie tot vier keer worden omgedraaid na 15 minuten. Als er nog grote stukken pancreas aanwezig zijn na de eerste helft van de vertering, draai de buis om de vijf minuten gedurende de laatste 15 minuten en incubeer het weefsel gedurende nog eens vijf tot tien minuten indien nodig. Aan het einde van de vertering, plaats de buizen op ijs en voeg 10 milliliter koud HBSS toe aan elk monster.

Verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeer de pellets in twee milliliter vers PBS. Filter vervolgens de cellen door 35 micron zeefjes in vijf milliliter ronde bodempolystyreen verzamelbuizen en was de verteringsbuizen met twee milliliter vers PBS en streef de wasvloeistoffen in hun corresponderende verzamelbuizen. Centrifugeer vervolgens de cellen opnieuw en aspireer voorzichtig de supernatanten zonder de pellets te verstoren.

Suspendeer de cellen in sorteerbuffer volgens de leeftijd van de dieren en filter ze door nieuwe 35 micron celzeefjes in nieuwe vijf milliliter verzamelbuizen. Doe 50 tot 100 microliter volumes van cellen in nieuwe FACS buizen voor de kleuringscontroles, inclusief een buis voor elke fluorofoor, de levensvatbaarheidskleurstof, de fluorescerende eiwitten en een ongekleurde controle. Was elke buis met maximaal vier milliliter sorteerbuffer en centrifugeer vervolgens.

Suspendeer vervolgens de pellets in verse sorteerbuffer volgens de leeftijd van de dieren. Kleur vervolgens de cellen met de levensvatbaarheidskleurstof. Voor celsortering voorafgaand aan RNA-extractie, bekleed direct voor het begin van de sortering een steriele 1,5 milliliter verzamelbuis met één milliliter sorteerbuffer bevattende RNAse-remmer.

Na vijf minuten, vortex de verzamelbuis en verwijder de vloeistof. Vortex de eerste kleuringscontrole en laad de buis in de flowcytometer om te beginnen met het bepalen van de sorteerparameters. Wanneer alle sorteerparameters zijn ingesteld, laad de monsters en sorteer de cellen in 1,5 milliliter verzamelbuizen.

Verzamel vervolgens de gesorteerd cellen door centrifugatie. Aspireer het supernatant tot aan de pellet en extraheer het RNA volgens de standaard RNA-extractieprotocollen. Hier worden de geïsoleerde volledige gastro-intestinale traktus inclusief de maag, milt, darm en pancreas van een embryo op dag 15,5 en een pup op postnataal dag vier getoond.

Flowcytometrische analyse van enkele cellen uit embryonale, neonatale en volwassen pancreatische weefsels geïsoleerd zoals zojuist is gedemonstreerd, toont aan dat transgene pancreatische weefsels van alle geanalyseerde leeftijden distincte YFP-gelabelde celpopulaties bevatten. Na sorteer kunnen deze mesenchymale cellen worden gekweekt om een cellijn voor ten minste vijf passages te vestigen. Let op de fibrotische morfologie van de gekweekte cellen typisch voor mesenchymale cellen.

De gesorteerd cellen tonen expressie van de panmesenchymale marker vementin, zoals geanalyseerd door qPCR na RNA-extractie en cDNA-synthese. Verder geeft de geïsoleerde pancreatische celoppervlaktemarkerexpressie aan dat alle fluorescerend gelabelde cellen in de transgene YFP pancreas CD9 tot expressie brengen, een celoppervlakte glycoproteïne waarvan wordt gemeld dat het door fibroblasten wordt geëxpresseerd. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals RNA-sequencing worden uitgevoerd om aanvullende vragen over mesenchymale celgenexpressie te beantwoorden.