Het gebruik van Trace Eyeblink klassieke conditionering te beoordelen Hippocampal dysfunctie in een Rat Model van Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Het algemene doel van dit experiment is om aan te tonen hoe het gebruik van trace-oogknipperen klassieke conditionering, een vorm van associatief leren, kan helpen bij het detecteren van hippocampale dysfunctie in een ratmodel voor foetale alcoholspectrumstoornissen. Neonatale rattenpups worden blootgesteld aan een hoge dosis alcohol, een concentratie van 11,9% volume volume alcohol, op een manier die lijkt op binge-drinken. Dit gebeurt tijdens de periode die bij mensen overeenkomt met het derde trimester met betrekking tot de hersengroei.

Dit patroon van alcoholblootstelling en de dosering zijn sleutelfactoren bij het veroorzaken van hersendefecten gedurende de levensspanne die menselijke gevallen van FASD nabootsen. Een belangrijk hersengebied dat wordt aangetast door vroege alcoholblootstelling is de hippocampus. Nadat de ratten zijn volgroeid tot volwassenen, worden ze onderzocht op hippocampale dysfunctie met behulp van trace eyeblink klassieke conditionering.

Dit is een complexe vorm van associatief leren die afhankelijk is van de integriteit van de hippocampus. Gedurende de postnatale dagen vier tot en met negen worden rattenpups elke ochtend gewogen en worden hun gewichten genoteerd. De voedingsvolumes worden vervolgens bepaald aan de hand van een vooraf geprinte tabel op basis van het lichaamsgewicht.

Een alcoholoplossing van 11,9% volume/volume wordt aan rattenpups toegediend via twee voedingen met een tussenpoos van twee uur. De totale dagelijkse dosis alcohol bedraagt 5,25 gram per kilogram per dag. Dit binge-exposureparadigma dient 0,278 ml alcohol per gram lichaamsgewicht per voeding toe in een melkoplossing.

Extraheer de melk die alcohol bevat met een steriele spuit van één milliliter. Druk vervolgens het overtollige oplosmiddel naar buiten om de exacte benodigde hoeveelheid te verkrijgen. Doop de punt van de PE-10 buis in verse maïsolie.

Dit vergemakkelijkt de insertie. Meet de lengte van de PE-10 buis vanaf de bek van de pup tot aan de maag. Pas indien nodig de PE-50 stopper aan om als visuele gids voor het stoppunt te dienen.

Voer de PE-10 buis voorzichtig in de mond van de pup in. Meestal zult u enige weerstand ondervinden wanneer de punt de keel bereikt. Manoeuvreer de buis totdat de punt afbuigt in de opening van de slokdarm.

Probeer te voorkomen dat de buis naar achteren glijdt, aangezien deze door de olie glad kan zijn. Ga verder via de slokdarm en zodra de punt de gastro-oesofageale sfincter passeert, zal deze de maag binnengaan. Stop op dit punt, stabiliseer de pomp en breng de oplossing toe.

Dit moet in een langzaam tempo worden gedaan. Verwijder voorzichtig de PE-10 slang en controleer het pup op terugstroom van vloeistof, bloed of fysiek letsel. Plaats het pup terug bij de nestgenoten als het in goede conditie is.

Raadpleeg het geschreven protocol en de materiaallijst voor de specifieke instrumenten die worden gebruikt bij de ooglidoperatie. Steriliseer het operatieveld met een goedgekeurd desinfectiemiddel en autoclafeer alle chirurgische instrumenten en benodigdheden vooraf. Nadat de rat is onderworpen aan een adequate anesthesie met isofluraan, scheert u de kop met een vachttrimmer, zodat er voldoende huid vrijkomt voor de incisielocatie en het linker ooglid.

De huid wordt gesteriliseerd door drie afwisselende schrobbeurten uit te voeren met 70% isopropylalcohol en povidonjodium. Volg de standaardprocedure voor het vastzetten van de rat in het stereotaxische apparaat met de oorstaven. Ga verder met de chirurgische ingreep zodra de rat het juiste anesthesieniveau vertoont.

Gebruik het scalpellames om een anterieur-posterieure incisie langs de middellijn te maken. Deze incisie moet een voldoende groot gebied blootleggen anterieur van de ogen en iets posterieur van de suturalis lambda-lijn. Gebruik het scalpellames om het periosteum bovenop het cranium voorzichtig weg te schrapen, zodat overmatig bloeden wordt voorkomen.

Verwijder overtollig bindweefsel en bloed met een wattenstaafje en spoel het gebied tussen de schraapbeurten door met steriele zoutoplossing. Boor een gat direct achter de coronale naad in één van de pariëtale beenderen. Verwijder eventueel bloed en botresten met een wattenstaafje.

Gebruik splinterpincetten om een 0 80 schroef vast te pakken. Gebruik een juweliersschroevendraaier om de schroef in het gat te bevestigen en draai de schroef net genoeg aan zonder het corticale hersenweefsel te beschadigen, meestal drie tot vier volledige slagen. Volg dezelfde procedure om de resterende schroeven te bevestigen.

Er zouden twee schroeven bilateraal achter de coronale naad vastgezet moeten zijn en één op het rechter pariëtaalbeen, anterieur aan de lambdanaad. Pak de bovenste huid bij de incisieplaats van het linker oog vast met de four inch dressing forceps en richt de three inch dressing forceps naar de hoek van dit oog. Neem één 26 gauge 3/8 inch naald en steek deze door de hoek van het ooglid.

Draai de naald zodat de schuine zijde naar boven wijst. Steek de tweede naald in het midden van het ooglid. Gebruik een fijne pincet om een 3T-draad vast te pakken en steek deze in een van de naalden.

Het is niet nodig om deze volledig in te voeren. Volg dezelfde procedure voor de tweede 3T-draad. Pak beide naalden met één hand vast, terwijl u met de andere hand de headstage vasthoudt.

Trek in één vloeiende beweging de naalden weg van het ooglid, terwijl u de kopsectie in dezelfde richting geleidt. Houd de EMG-kopsectie met één hand vast en gebruik met de andere hand de drie-inch wondpincet om de 10T-draad rond één of beide schroeven aan de rechterkant te wikkelen. Berg deze draad weg zodat deze niet uit de schroeven steekt.

De EMG-kopset moet gecentreerd worden voordat u doorgaat naar de volgende stap. Gebruik de vier inch wondpincet om een klein zakje te maken door de huid, oftewel de oppervlakkige fascia, te scheiden van de musculus temporalis. Nadat het zakje is gemaakt, gebruikt u de irisschaar om meer bindweefsel weg te knippen, terwijl u in de richting van de hoek van het linkeroog werkt.

Wees voorzichtig om niet te diep te gaan of bloedvaten door te snijden. Neem een bipolaire elektrode en buig de draad zodanig dat deze langs de kromming van de musculus temporalis kan worden geplaatst. De twee pinnen worden posterieur ten opzichte van het linker oog geplaatst en het onderste uiteinde van de bipolaire elektrode wordt direct bovenop het cranium geplaatst.

Meng het Ortho Jet-poeder met de vloeibare componenten om een vloeibare consistentie te verkrijgen. Breng de pasta met een microspatel rondom de incisieplaats aan. Let erop dat er geen pasta in de ogen van de rat komt en houd de pasta gelokaliseerd.

Laat de Ortho Jet een halfdroge toestand bereiken en gebruik vervolgens de splinterpincet om overtollig acryl op de EMG-kopstage en de schroefdraad van de bipolaire elektrode te verwijderen. Knip overtollige 3T-draad weg, waarbij enkele centimeters overblijven om mee te werken.

Verwijder voorzichtig de PTFE-afscherming van elke 3T-draad met de micro-dissectiepincet. Hierdoor kunnen ze contact maken met de musculus orbicularis oculi. Gebruik de micro-dissectiepincet om haken te maken aan elk uiteinde van de 3T-draden.

Knip het overtollige draad weg, waarbij u er goed op let dat u niet zoveel wegsnijdt dat het resterende draad terugtrekt in het ooglid. De bekabeling is in eigen beheer vervaardigd. De witte bipolaire stekker wordt eerst aangesloten, wat de toediening van de schokkende US-stimulus mogelijk maakt.

De oranje plug van de EMG-kopstation wordt vervolgens aangesloten. Hiermee wordt de elektromyografische activiteit geregistreerd terwijl de rat knippert. Beide pluggen leiden naar een ronde commutator bovenop de arm, die de signaalcontinuïteit behoudt terwijl de rat zich vrij kan bewegen.

De stimulusisolator wordt ingeschakeld en de laatste hardwarecontroles worden uitgevoerd. Dit omvat het aanpassen van de EMG-baseline naar een niveau dat zichtbaar is op het computerscherm. In de eerste sessie wordt de schokintensiteit eerst ingesteld op 4 milli amps en wordt deze elke twee trials verhoogd met eenheden van 4 mil amp.

Deze inwerkmethode stelt de rat in staat om te acclimatiseren aan de schokstimulus. Tegen de achtste trial wordt de schokintensiteit gedurende deze sessie en alle daaropvolgende sessies gehandhaafd op 1.6 milli amps. Een aparte computer bestuurt een vierkanaals digitale oscilloscoop, waarmee we real-time signaaldiagnostiek kunnen uitvoeren.

Let op de oogknippering die werd uitgezonden door de rat in box één. De oscilloscoop geeft ook aan dat het baseline EMG-signaal relatief schoon is met weinig ruis. Webcams stellen ons ook in staat om elke rat te monitoren.

Dit is een screenshot van blink software versie 4.0 waarop een trial-epoch van 1400 milliseconden wordt getoond. In de eerste 280 milliseconden worden er geen stimuli gepresenteerd om een meting van de baseline EMG-activiteit te verkrijgen. De gele lijn geeft de drempellijn aan waarbij elke EMG-respons die 4 volt boven de gemiddelde pre-CS baseline-waarde uitkomt, in aanmerking komt als een oogknipper-respons.

De stimulus van de toonconditie van 85 decibel wordt toegediend op het tijdstip van 280 milliseconden. De toon blijft 380 milliseconden aan, wat overeenkomt met het tijdstip van 660 milliseconden. Nadat deze stopt, volgt een interval van 500 milliseconden waarin geen stimuli worden gepresenteerd. Dit wordt de spoorperiode genoemd, waarin de rat het einde van de toon-CS moet koppelen aan het begin van de schok-US, die pas op het tijdstip van 1160 milliseconden wordt toegediend.

De schok-US duurt 100 milliseconden. Van nature lokt de schok-US een defensieve knipperrespons uit, bekend als de ongeconditioneerde respons, of UR, die wordt gemeten in een tijdvenster van 140 milliseconden. Eén trainingssessie bestaat uit 100 trials.

Er zijn 90 trials waarin de CS en US worden gekoppeld en bij elke tiende trial wordt alleen de CS toegediend. Er zijn 10 CS-only trials per sessie. Deze trials stellen ons in staat om te onderzoeken of er wel of geen leerproces van de CS-US associatie heeft plaatsgevonden.

In de vorm van geconditioneerde responsen, of CR's, komt dit tot uiting wanneer de schok US niet aanwezig is. Het inter-trial interval is gemiddeld 30 seconden, zodat het begin van elke trial niet voorspelbaar is. In elke willekeurige trial kan een rat op elk tijdstip knipperen, waarbij de EMG wordt geregistreerd door de software.

Elke afzonderlijke oogknippering die de drempellijn overschrijdt, wordt beschouwd als een respons in een van vier categorieën, afhankelijk van het moment waarop deze plaatsvindt en het tijdvak van de trial. Als de rat knippert tijdens de eerste 80 milliseconden na het begin van de toon CS, wordt de respons beschouwd als een schrikrespons of SR. Dit is een niet-associatieve respons die indicatief is voor de sensorimotorische prestatie, maar niet per se voor het leren van de CS US-associatie. Als de rat knippert na de SR-periode maar voordat de schok US wordt toegediend, heeft deze een geconditioneerde respons vertoond.

Zoals eerder vermeld, is de CR de primaire maatstaf voor associatief leren. De CR wordt niet verwacht te ontwikkelen tijdens de vroege fasen van de training, maar naarmate de training vordert over vele trials en sessies, worden dit soort responsen frequenter, hoger in amplitude en mogelijk beter getimed. We verdelen de CR's in twee typen: totale CR's en adaptieve CR's.

Totale CR's weerspiegelen het algemene leervermogen, terwijl adaptieve CR's het vermogen van het dier weerspiegelen om de knippering nauwkeurig te timen. Als manier om zich voor te bereiden, ligt de adaptieve CR-periode op 200 milliseconden vóór het begin van de shock US. Bij zoogdieren met een intacte hippocampus weerspiegelt de expressie van adaptieve CR's een sterke hippocampale betrokkenheid bij het correct timen van de knippering in relatie tot het toedienen van de twee stimuli.

Vanwege haar eigen aard is trace-klassieke conditionering van het oogknipperreflex veel moeilijker aan te leren dan vertraagde klassieke conditionering van het oogknipperreflex, waarbij de toon-CS en de schok-US elkaar in de tijd overlappen. Hoewel de expressie van CR's per subject kan variëren en ernstig kan worden beïnvloed door verstoringen in specifieke hersencircuits, wordt verwacht dat de UR tijdens elke gekoppelde CS-US-trial wordt vertoond. Deze maatstaf weerspiegelt derhalve de sensorisch-motorische prestaties en is, net als schrikreacties, op zichzelf geen indicatie voor het aanleren van de CS-US-associatie.

In de volgende reeks videoclips ziet u de software-instellingen en het begin van de oogknippertraining. De software voor het knipperen wordt geactiveerd en de twee relevante bestanden worden ingeladen: een rattenbestand met proefdiergegevens en het bestand voor tracey-oogknipperconditionering.

Het programma is ingesteld tot de training begint. Zodra de training start, is er rechtsonder op het scherm een timer te zien die aftelt naar de volgende trial. Hier is een live video-opname van sessie één, trial 15, waarin een UR wordt vertoond maar er nog geen CR's zijn ontwikkeld.

Hier is een weergave op een derde van de snelheid. In de volgende reeks clips ziet u screenshots van dezelfde niet-geintubeerde controle-rat terwijl deze zes trainingssessies doorloopt. Uiteindelijk vertoont deze zowel totale CR's als adaptieve CR's.

Hier is een live videoclip van sessie zes, trial 96, waarin twee oogknipperingen worden uitgezonden, waarvan één een adaptieve CR en de andere een UR is. Hier is een weergave op een derde van de snelheid. In deze laatste clip ziet u een live video van een met alcohol geïntubeerde rat tijdens de laatste trial van sessie zes, een trial met alleen CS; zelfs na 600 trainingstrials zendt deze niet betrouwbaar een adaptieve CR uit. Nadat de gegevens zijn verzameld, worden deze gescreend op foutieve trials, bestaande uit artefacten met veel ruis en ongebruikelijke pre-CS baseline EMG-activiteit, met behulp van een ingebouwd foutalgoritme voor het detecteren van uitschieters.

Goede trials die worden bewaard, worden verder geanalyseerd op SR's, UR's, totale CR's en adaptieve CR's met betrekking tot het percentage responsen, amplitude, latentie en andere kritische maten. Gemiddelde adaptieve CR's over zes trainingssessies worden getoond in deze eerste set resultaten. Zowel de percentage- als de amplitudematen waren statistisch significant tussen de groep met alcohol-intubatie en de twee controlegroepen van sessie twee tot en met sessie zes.

Dit geeft aan dat de frequentie en de sterkte van adaptieve CR's waren aangetast bij ratten die tijdens de vroege ontwikkeling aan alcohol waren blootgesteld. De gemiddelde ongeconditioneerde responsen worden getoond in deze tweede set resultaten. Zowel de frequentie- als de amplitudematen vertoonden geen statistisch significant verschil tussen de groepen.

Deze resultaten geven aan dat vroege blootstelling aan alcohol het vermogen van de ratten om te knipperen bij de ongeconditioneerde stimulus niet heeft aangetast, maar dat de waargenomen beperking te wijten was aan een onvermogen om de CS en US tijdens de acquisitiefase correct te associëren. In dit experiment hebben we de relatie tussen hersenen en gedrag onderzocht door vast te stellen of ontwikkelingsgebonden blootstelling aan alcohol, toegediend op een binge-achtige manier, de hippocampus beïnvloedt, zoals weerspiegeld in tekorten bij trace-oogknipperklassieke conditionering. Inderdaad is oogknipperklassieke conditionering een nuttig instrument om de neurobehaviorale gevolgen te beoordelen die gepaard gaan met blootstelling aan alcohol tijdens de hersenontwikkeling.

Het is zeer veelzijdig, aangezien de functionele integriteit van verschillende hersensystemen buiten de hippocampus kan worden beoordeeld door de stimulusparameters of de eisen voor associatief leren te wijzigen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in de complexiteit van het toedienen van alcohol aan neonatale ratpupjes, het implanteren van elektroden en het uitvoeren van de oogknipper-testprocedure. Wij danken u voor het bekijken van deze video.