Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

Het algemene doel van dit microfluïdische experiment is om tegelijkertijd de afzetting van bloedplaatjes in fibrinevorming op een reactief oppervlak onder stromingsomstandigheden te meten met behulp van real-time videomicroscopie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van transfusiegeneeskunde te beantwoorden over de effecten van bloedplaatjesconcentraatvoorbereiding op de procoagulerende aard van transfusiebloed. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een gelijktijdige analyse van bloedplaatjesfunctie en stollingsprocessen in de stroming mogelijk maakt, waardoor de wisselwerking tussen beide processen kan worden onderzocht.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in contactpadweg-geïnduceerde bloedplaatjesprocoagulatie, kan deze ook worden toegepast op de studie van de extrinsieke padweg door coating met gelipideerd weefselfactor. De procedure zal worden gedemonstreerd door Rosalie Devloo, een technicus van het laboratorium. Begin de microfluïdische stroomkamerinstelling door 0,8 microliter vers gereconstitueerd collageen in vijf zesde van de lengte van elke kanaal aan het ene uiteinde van een nieuwe wegwerpbare microfluïdische biochip met acht rechte parallelle kanalen te pipetten en dit uiteinde van de microchip te labelen als de uitlaat.

Incubeer de biochip gedurende ten minste vier uur bij vier graden Celsius in een bevochtigde en verzegeld container. Aan het einde van de incubatie, vul de gecodeerde kanalen in een gelijk aantal Y-vormige kanalen in een mengbiochip met blokkeerbuffer. Breng de microchip terug in de container gedurende één uur op kamertemperatuur.

Plaats vervolgens een speld in één uiteinde van twee, acht centimeter lange en één, twee centimeter lange stukken slang en in beide uiteinden van één, 46 centimeter lang stuk slang voor elk kanaal dat wordt gebruikt. Gebruik vervolgens de Nanopump-software om alle pompvloeistoffen in de aangesloten slangen met gedistilleerd water te spoelen en een spuit in de spuitconnectorpen om alle andere slangen met blokkeerbuffer te vullen. Bevestig vervolgens de gecodeerde biochip op de geautomatiseerde microscoopstandaard met behulp van een laboratoriumschaarlift om de mengbiochip op dezelfde hoogte als de microscoopstandaard te fixeren.

Gebruik de pinnen in de acht centimeterbuizen om deze stukken slang op de mengbiochipinlaat te bevestigen en plaats het vrije uiteinde van elke buis in een flesje HEPES-gebufferde zoutoplossing. Verbind nu de gecodeerde biochip met de mengbiochip met het 46 centimeter lange stuk slang in een flexibele, maar rechte, lijn. Bevestig een spuitconnectorpen aan de luer-compatibele slang van de spoelpomp.

Verbind vervolgens de pen met het vrije uiteinde van het twee centimeter lange stuk slang en bevestig het andere uiteinde van de slang aan de uitlaat van de gecodeerde biochip. Spoel vervolgens alle slangen en kanalen met één milliliter HBS. Om de perfusiepompen voor te bereiden, opent u de Microfluidic Perfusion Pump Driver-software en dubbelklikt u op het spuitpictogram om de pompen te initialiseren.

Selecteer het type spuit dat zal worden gebruikt en ontkoppel de spoelpomp en de twee centimeter slang erop. Verbind de ontkoppelde twee centimeter slang met zijn spuitconnectorpen op de luer-lock van een stuk dikwandige afvoerslang en gebruik een spuit om de dikwandige slang met standaard pepsinoplossing te vullen. Zet vervolgens het open uiteinde van de dikwandige slang vast met een Kocherklem.

Bevestig de slang aan de uitlaat van de gecodeerde biochip. Ontkoppel de twee buizen van de mengstromingskamer samen en gooi de containers met HBS weg. Nadat de bloedmonsters in geëvacueerde natriumcitraatcontainers zijn verkregen, centrifugeert u de buizen en brengt u het bloedplaatjesrijke plasma over in een nieuwe centrifugeerbuis.

Centrifugeer de containers met bloedplaatjesrijk plasma opnieuw. Breng vervolgens het supernatante bloedplaatjesarme plasma over in een andere centrifugeerbuis. Gebruik vervolgens een 21 gauge naald om de bodem van de natriumcitraatcontainers te perforeren om de gepakte rode bloedcellen te laten druppelen in een nieuwe conische buis.

Wanneer alle gepakte rode bloedcellen zijn verzameld, herstel het bloed voorzichtig door gescheiden gepakte rode bloedcellen te combineren met bloedplaatjesarm plasma en voeg bloedbankbloedplaatjes toe die zijn voorbereid voor transfusie om monsters te verkrijgen met een 40% hematocriet en 2,5 keer 10 tot de vijfde bloedplaatjes per microliterconcentratie tot een eindvolume van 2,5 milliliter en verkrijg een volledige bloedtelling. Voeg vervolgens 13 microliter fluorofoor-gelabeld fibrinogeen toe aan een polystyreen conische buis. Gevolgd door één milliliter van het gereconstitueerde bloed.

Meng nog een milliliter bloed met twee microliters fluorescerende bloedplaatjesverf en voeg de gelabelde bloedmonsters samen. Draai vervolgens de gemengde bloedmonsters voorzichtig om en incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Voordat u begint met de perfusie-assay, focust u de microscoopoptica op de collageenvezels die aan de bodem van het eerste kanaal zijn bevestigd.

Gebruik de acquisitiesoftware om een interessegebied in het geselecteerde kanaal te definiëren. Laad één milliliter voorverwarmde stollingsbuffer in een een milliliterspuit en monteer de spuit op de perfusiepomp. Na een tweede voorzichtige inversie, laadt u het bloed in een tweede milliliterspuit en monteert u de spuit op de perfusiepomp.

Gebruik vervolgens een spuitconnectorpen om beide spuiten aan één stuk van acht centimeter slang te bevestigen en prime de connectoren en slangen op 400 microliter per minuut. Wanneer alle slangen gevuld zijn met ofwel stollingsbuffer of bloed, bevestigt u het andere uiteinde van beide slangen aan de gesplitste poten van het Y-vormige kanaal in de mengbiochip. Verwijder vervolgens de Kocherklem bij de uitlaat van de afvoerslang en start de perfusie bij 4,4 microliter per minuut voor de stollingsbuffer en 44 microliter per minuut voor het gereconstitueerde bloed.

Neem elke 10 seconden gedurende 30 minuten real-time beelden op, waarbij de pompen en beeldacquisitie worden beëindigd na 30 minuten of wanneer het signaal verzadigd is. Gooi vervolgens alle slangen en spuiten weg als biogevaarlijk afval. Dit video biedt een