Name: Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer een microfluïdische methode voor hemostaseonderzoek met real-time analyse van trombocytdepositie en fibrinevorming onder stromingsomstandigheden. Deze techniek biedt inzicht in transfusiegeneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de Stichting voor Onderzoek en Ontwikkeling van het Belgische Rode Kruis-Vlaanderen Dienst voor het Bloed. Wij erkennen financiële steun van &quot;Bijzonder onderzoeksfond&quot; (BOF - BOF) aan de Universiteit Gent voor het project met een contract nummer BOF30290744.

Dit protocol volgt de institutionele ethische richtlijnen voor onderzoek naar menselijke monsters, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle betrokken donoren. Goedkeuring voor de hier beschreven experimenten werd verkregen van de institutionele review board van het Universitair Ziekenhuis Antwerpen (erkenningsnummer 16/10/120). OPMERKING: Temperatuur indicaties zijn altijd kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. 1. Microfluidics Setup <ol><li> Bereid de microfluïdische stroom kamer kanalen, slangen, en verbindingspennen <ol><li> Resuspendeer het collageen stock flacon door vortex mengen, en vervolgens verdund in isotone glucoseoplossing van de fabrikant tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml. LET OP: Gebruik paarden pees collageen, voornamelijk samengesteld uit type I vezels. Paarden collageen type I wordt vaak aangeduid als &quot;Horm&quot; collageen en is de gouden standaard voor dit type assay, zowel historischbiologische redenen. Humaan type III collageen kunnen ook worden gebruikt, maar deze fibrillen vacht minder goed en het trombocytenrespons niet zo sterk. Andere coatings oppervlakken kunnen ook worden gebruikt, zoals von Willebrand factor, fibrinogeen, fibronectine, laminine, vitronectine, trombospondine-1 of combinaties van deze 3. </li><li> Neem een ​​nieuwe wegwerpbare microfluïdische biochip met acht rechte, parallelle kanalen en afmetingen, in mm, van 0,4 W x H 0,1 x 20 L. Pipetteer 0,8 pi van collageen in het kanaal (s) van de biochip aan de ene kant en label dit als de outlet. Vullen slechts 5/6 van de kanaallengte zodat de collageen fibrillen niet de kanaalinlaat bekleed, omdat dit kan leiden tot verstopping, hetgeen een doeltreffende perfusie belemmert. </li><li> Incubeer de biochip bij 4 ° C gedurende ten minste 4 uur in een bevochtigde en doos. </li><li> Om weefselfactor (extrinsieke) gemedieerde coagulatie onderzoeken in combinatie met het contact pad (intrinsieke), laag de kanalen met collagen en recombinant tissue factor (rhTF) mens. <ol><li> Verdun rhTF in 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) -buffered zoutoplossing (HBS; 0,9% (w / v) NaCl, pH 7,4, 1: 3000, voorraadconcentratie: 4,5 nM). </li><li> Verwijder de collageen-bekledingsoplossing via de uitlaat. Pipet 0,8 pl rhTF in HBS (verdunning 1/500 van voorraadconcentratie, eindconcentratie: 09:00) in de uitgang van het kanaal vullen 5/6 van de kanaallengte, vergelijkbaar met de collageen-coating strategie. </li><li> Incubeer de biochip gedurende nog 30 min in een vochtige en doos. </li></ol></li><li> Vul het gecoate kanalen met blokkerende buffer (1,0% (w / v) runderserumalbumine en 0,1% (w / v) glucose in HBS), uitgaande van het andere uiteinde (aangeduid als de inlaat). Vul een gelijk aantal Y-vormige kanalen met dezelfde blokkerende buffer in een meng biochip. <ol><li> Zorg ervoor dat alle kanalen en het kanaal armen zijn volledig gevuld met blokkerende buffer. Incubate beide biochips ten minste 1 uur in een bevochtigde en doos. </li></ol></li><li> Voor elk kanaal in gebruik, bereiden twee buizen van 8 cm, een 2 cm lengte, en een 46 cm lang. Plaats een pin in een uiteinde van de drie kleinere buis en in beide uiteinden van de langste buis. </li></ol></li><li> Bereid de spoelen pomp <ol><li> Spoel alle pomp fluïdica en de aangesloten buis met gedestilleerd water. </li><li> Ontvet casting van de biochip&#39;s met een precisie stofvrij vegen en gedenatureerde alcohol om afdrukken en stof te verwijderen. </li><li> Vul alle buis met blokkerende buffer voordat ze worden aangesloten op de biochips. </li><li> Bevestig de gecoate biochip van de geautomatiseerde microscoop podium. Bevestig het mengen biochip op dezelfde hoogte als de microscooptafel met een klinisch schaar jack. </li><li> Sluit de beklede biochip de biochip mengen met de langste buis, 46 cm lang. Controleer beide biochips op een afstand zodat de buis vormt een flexibele maar rechte lijn. </li&gt; <li> Bevestig een injectiespuit connector pin in de Luer-compatible buis van het spoelen pomp. Aansluiten op het vrije einde van de 2 cm buis en bevestig het andere uiteinde met de uitlaat van de beklede biochip. </li><li> Bevestig de twee 8-cm slang aan op de mengen biochip inlaat met behulp van de pinnen. Zet het vrije uiteinde van elke buis in een flacon HBS. Spoel alle slangen en alle kanalen met 1 ml HBS. OPMERKING: HBS stroomt van het flesje via de 8-cm slang aan het mengen chip en door de 46-cm slang aan de beklede chip (die uit de onbeklede naar de beklede deel) als gevolg van de trekkracht van de spoelpomp. Deze stap verwijdert de blokkerende buffer en slecht gehandeld collageen (of rhTF in dubbel gecoat biochips). </li></ol></li><li> Bereid de perfusie pompen <ol><li> Open de driver-software van de perfusie pompen. Initialiseren van de pompen door te dubbelklikken op het pictogram van injectiespuiten in de software. </li><li> Selecteer het type spuit worden gebruikt: 1 ml spuiten voor de coagulatie bUffer en 2 ml spuiten voor de bereide bloed. </li></ol></li><li> Sluit de spuiten op de biochip bouw <ol><li> Koppel de spoelpomp en alle buizen, behalve de ene die de twee biochips. De losgekoppelde buis wordt hergebruikt in de volgende stappen. </li><li> Sluit de 2-cm buis met de spuit-connector pin aan de Luer lock van een dikwandige buizen afval. Vul het dikwandige buizen met standaard pepsine oplossing met behulp van een injectiespuit. OPMERKING: De toevoeging van pepsine het afval buis remt en lyseert na perfusie stolling en voorkomt dus verstopping van het systeem aan de achterkant. </li><li> Zet het open einde van de dikwandige buis met een Kocher klem. Plaats een geschikte afvalhouder met bleekmiddel hieronder om de doorstroming te verzamelen. </li><li> Bevestig de buis met zijn as aan de uitlaat van de beklede biochip. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding bloedmonsters <ol><li>Verzamel bloed van een gezonde vrijwilliger en te scheiden zijn componenten 4 <ol><li> Verzamelen van bloed in een geëvacueerde ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) container. Gebruik dit monster alleen voor het uitvoeren van een complete bloedbeeld (CBC) met behulp van een geautomatiseerde hematologie-analyse. </li><li> Verzamelen van bloed in geëvacueerde natriumcitraat containers. 5 ml bloed nodig per kanaal. </li><li> Het monster (s) op een horizontale rotator afwachting bloed oplossen. LET OP: De test moet binnen 3 uur van aderlaten worden afgerond. Bloedplaatjes concentraat en hele bloedmonsters zijn ABO / RhD bloedgroep geëvenaard. </li><li> Centrifugeer gedurende 13 minuten bij 250 xg om bloedplaatjes rijk plasma (PRP) te bereiden. Gebruik de centrifuge rem om verstoring van de los gepakt pellet te voorkomen. </li><li> Breng de PRP een nieuwe conische centrifugebuis. Centrifugeer 10 minuten bij 4500 xg (met rem) de bloedplaatjes pellet bereiden bloedplaatjes-arm plasma (PPP). Gooi de platElet pellet. Incubeer de PPP in een waterbad bij 37 ° C. </li><li> Breng de rode bloedcellen een nieuwe conische buis door het perforeren van de bodem van de originele met een 21 G naald. OPMERKING: De resterende bloedplaatjes in de gepakte rode cellen fractie 11 ± 4 x 10 3 per pi (gemiddelde ± SD, n = 10). </li></ol></li><li> reconstrueren bloed <ol><li> Bepaal de hematocriet van de rode bloedcellen bereid in stap 2.1.6 behulp van een geautomatiseerde hematologie-analyse. </li><li> Bepaal de bloedplaatjes concentratie van de bloedplaatjes concentraat dat wordt gebruikt voor analyse met een geautomatiseerde hematologie-analyse. </li><li> Bereken het volume van verpakte rode bloedcellen, bloedplaatjes concentraat en PPP dat een 40% hematocriet en 250 x 10 3 bloedplaatjes / ul oplevert in een 2,5 ml eindvolume. Meng deze met gereconstitueerde bloed voorbereiden en uitvoeren van een CBC. OPMERKING: Andere doelwit titers van cellen kan worden gebruikt, afhankelijk van The onderzoeksvraag. </li><li> Bereid een &quot;blanco&quot; controlemonster, waarbij het volume van bloedplaatjes concentraat wordt vervangen door een gelijk volume zoutoplossing om de concentratie van &quot;endogeen&quot; bloedplaatjes (dwz niet-bloedbank bloedplaatjes) bepaald. </li></ol></li><li> Label de gereconstitueerde bloed voor bloedplaatjes en fibrinogeen <ol><li> Pipetteer 13 ul van een 10,7 mg / mL oplossing van Alexa Fluor 405-gelabeld fibrinogeen (70 ug / ml eindconcentratie) in een reageerbuis en voeg 1 ml gereconstitueerde bloed. OPMERKING: Fibrinogeen werd gelabeld met een commercieel verkrijgbare kit volgens de handleiding van de fabrikant. </li><li> Meng nog een 1 ml gereconstitueerde bloed in een reageerbuis met 2 ui 1 mM Dioc 6 (1 uM eindconcentratie) of met 2 pl van 5 mM calceïne AM (5 uM eindconcentratie). Voeg dit toe aan de buis met het bloed met fibrinogeen, waardoor een eindvolume van 2 ml van bloedplaatjes en fibrinogeen-sgehandhaafd bloed. LET OP: De keuze van de kleurstof kan afhangen van de vraag onderzoek of de voorkeur van de onderzoeker 5. Wees ervan bewust dat excitatie van elke kleurstof fotochemische artefacten kan veroorzaken. </li><li> Meng door omkeren. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Bereid de coagulatie buffer <ol><li> Bereid coagulatie buffer die 10 mM CaCl2 en 3,75 mM MgCl2 in HBS. Bereid 1 ml coagulatie buffer voor één kanaal. </li><li> Filter-steriliseer de coagulatie buffer door een 0,2 pm filter. Pre-warm deze tot 37 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Perfusie Assay <ol><li> Focus de microscoop optiek om de collageenvezels gehecht aan de bodem van het kanaal. Gebruik fase contrast of differentieel interferentie contrast (DIC). Selecteer &quot;Set huidige Z voor geselecteerde tegel regio&#39;s&quot; in het experiment software om de geselecteerde focus digitaal op te lossen. </li><li> Definieer een interessegebied (ROI) in het geselecteerde kanaal met de acquisitie software van de microscoop. LET OP: De ROI kan elk oppervlak willekeurig gekozen binnen een perfusie kanaal. Het wordt niet aanbevolen aan trombusvorming en fibrine generatie vlakbij de inlaat en uitlaat analyseren om te voorkomen verwerven afbeeldingen ongelijk verdeeld trombi. De ROI oppervlakte moet een aanzienlijk aantal trombi bevatten mogelijk te maken voor de nivellering van het signaal variabiliteit door individuele bloedplaatjes. De locatie van de ROI in het xy-vlak van het kanaal is altijd vast, welomschreven vóór perfusie. Desgewenst kan het onbeklede deel van het kanaal in de analyse opgenomen om te bepalen of bloedplaatjes niet specifiek binden aan het plastic biochip. </li><li> Bereiden monsters voor perfusie <ol><li> Monteer een 1 ml spuit met 1 ml voorverwarmde buffer coagulatie in de perfusiepomp. </li><li> Meng de voorverwarmde opgelost bloed door voorzichtig omkeren en de belasting 2 mL in een 2 ml spuit. </li><li> Zorg ervoor dat alle lucht uit beide spuiten verwijderd en sluit elk met een 8-cm slang met behulp van een injectiespuit connector pin. </li><li> Prime de aansluitingen en leidingen van beide spuiten met hoge snelheid (400 pL / min) en stopt wanneer alles is gevuld met buffer stolling of bloed. OPMERKING: Bij het vullen van de buis, de coagulatie buffer en geregenereerde bloed onmiddellijk worden gemengd in het Y-vormig kanaal van het mengen biochip bij het starten van het experiment, het vermijden van de introductie van lucht naar de perfusiekamers. </li></ol></li><li> Met pennen, bevestig het andere uiteinde van beide buizen om de splitsing benen van de Y-vormige kanaal in het mengen biochip. Het onderste been wordt gebruikt voor het perfuseren coagulatie buffer en het bovenbeen voor gereconstitueerd bloed. </li><li> Begin het experiment door het initiëren perfusie aan 4,4 ul / min gedurende coagulatie buffer en 44 ul / min gedurende gereconstitueerd bloed. Verwijder de Kocher klem bij de uitlaat van de buis afvalstoffen toe te staan ​​Japanse producteSion. LET OP: Flow tarief kan worden veranderd afhankelijk van de vraagstelling. Start een stopwatch om de tijd tussen het begin van het experiment en de start van de real-time beeld acquisitie te bepalen. </li><li> Record beelden elke 10 s gedurende 30 minuten in real time via de verwerving en experiment software van de microscoop. Opname starten wanneer de mix gereconstitueerd bloed coagulatie buffer gaat de beklede biochip geplaatst op de microscoop podium. LET OP: Andere grafieken kunnen worden gebruikt afhankelijk van de experimentele opstelling. Gebruik een 100X vergroting (10x objectief en 10x lenzen). </li></ol> 4. Terminating Experiment <ol><li> Sluit de pompen en beeldopname na 30 min of minder, als het signaal verzadigd. Maak alle slangen en spuiten en gooi ze als biologisch gevaarlijk afval. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Bepaal groei trombus (groene fluorescentie) en de vorming van fibrine (violet fluorescence) kinetiek met beeldanalyse software. De volgende opdrachten zijn specifiek voor de software die hier gebruikt: <ol><li> Open de plugin Processing: stiksels om te borduren de side-by-side beelden per tijdstip. </li><li> Open de plugin Image Analysis aan de oppervlakte dekking van de bloedplaatjes te bepalen. </li><li> Open de plugin Measure. Definieer de ROI door het tekenen van een rechthoek regio met inbegrip van alle trombi en fibrine vezels; in dit protocol, de ROI is een rechthoek van 637 mm 2. Selecteer het tabblad Alle Uitzicht naar alle geregistreerde tijdstippen omvatten. </li><li> Gebruik tabellen maken om automatisch een spreadsheet dat de gemiddelde fluorescentie-intensiteit waarde van de geselecteerde rechthoek regio elk tijdstip bevat. </li><li> Sla de spreadsheets in xml-formaat. </li></ol></li><li> Open een werkblad in een spreadsheet programma voor verdere berekeningen. <ol><li> Trek de aanvankelijke (background) waarde van alle gegevens. </li><li> Zet de fluorescentie als functie van de perfusie tijd voor zowel de groene (bloedplaatjes) en de violette (fibrine) kleurstoffen. LET OP: Houd rekening met de tijd tussen de pomp initialisatie en de daadwerkelijke beginpunt van het beeld acquisitie. Trombusvorming algemeen een twee-stappen in dit model: (1) &quot;langzaam&quot; bloedplaatjesadhesie (dwz adhesie) aan geïmmobiliseerd collageen gevolgd door (2)-coagulatie aangedreven trombus groei met een &quot;snelle&quot; toename van zowel bloedplaatjesbinding ( dwz accumulatie) en fibrine depositie (dwz coagulatie) (figuur 1). </li><li> Bereken de helling van bloedplaatjesadhesie en accumulatie door lineaire regressie; deze helling geeft bloedplaatjes thrombus groeikinetiek in elke fase van zijn vorming. </li><li> Bereken de helling van fibrine coagulatie en extrapoleren deze lijn aan de X-as onderscheppen, bepalen het moment van aanvang. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Levi, M., Hunt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+point-of-care+coagulation+testing+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of point-of-care coagulation testing in critically ill patients.</a> J. Thromb. Haemost. 13 (11), 1960-1967 (2015).</li>
<li>Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Flow+Chambers+Using+Reconstituted+Blood+to+Model+Hemostasis+and+Platelet+Transfusion+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro.</a> J. Vis. Exp. (109), e53823(2016).</li>
<li>Witt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+platelet+function+defects+by+multi-parameter+assessment+of+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation.</a> Nat. Commun. 5, 4257(2014).</li>
<li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol. Biol. 272, 13-28 (2004).</li>
<li>Roest, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber-based+assays+to+measure+thrombus+formation+in+vitro%3A+requirements+for+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization.</a> J. Thromb. Haemost. 9 (11), 2322-2324 (2011).</li>
<li>Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-protein+interactions+in+blood+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipid-protein interactions in blood coagulation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1376 (3), 433-453 (1998).</li>
<li>Dargaud, Y., Luddington, R., Baglin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+contact+factor+activation+improves+measurement+of+platelet-dependent+thrombin+generation+by+calibrated+automated+thrombography+at+low-concentration+tissue+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor.</a> J. Thromb. Haemost. 4 (5), 1160-1161 (2006).</li>
<li>Bevers, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Ca%282%2B%29-induced+microvesiculation+and+deficient+expression+of+procoagulant+activity+in+erythrocytes+from+a+patient+with+a+bleeding+disorder%3A+a+study+of+the+red+blood+cells+of+Scott+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective Ca(2+)-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant activity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: a study of the red blood cells of Scott syndrome.</a> Blood. 79 (2), 380-388 (1992).</li>
<li>Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+prothrombin-converting+activity+and+the+exposure+of+phosphatidylserine+at+the+outer+surface+of+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets.</a> Eur. J. Biochem. 122 (2), 429-436 (1982).</li>
<li>Muller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+polyphosphates+are+proinflammatory+and+procoagulant+mediators+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo.</a> Cell. 139 (6), 1143-1156 (2009).</li>
<li>Smith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphate+modulates+blood+coagulation+and+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (4), 903-908 (2006).</li>
<li>Tiberghien, P., Follea, G., Muller, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+Transfusions+in+Acute+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Platelet Transfusions in Acute Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. 375 (1), 96-97 (2016).</li>
<li>Deckmyn, H., Feys, H. B. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/voxs.12053/pdf">Assays for quality control of platelets for transfusion.</a> ISBT Science Series. 8 (1), 221-224 (2013).</li>
<li>Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+platelet+adhesion+to+artery+subendothelium+is+mediated+by+factor+VIII-Von+Willebrand+factor+bound+to+the+subendothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium.</a> Nature. 279 (5714), 636-638 (1979).</li>
<li>Alevriadou, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+shear-dependent+thrombus+formation+and+its+blockade+by+inhibitors+of+von+Willebrand+factor+binding+to+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets.</a> Blood. 81 (5), 1263-1276 (1993).</li>
<li>Nesbitt, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat. Med. 15 (6), 665-673 (2009).</li>
<li>Stalker, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+in+the+hemostatic+response+and+its+relationship+to+the+platelet-signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network.</a> Blood. 121 (10), 1875-1885 (2013).</li>
<li>Swieringa, F., Kuijpers, M. J., Lamers, M. M., vander Meijden, P. E., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate-limiting+roles+of+the+tenase+complex+of+factors+VIII+and+IX+in+platelet+procoagulant+activity+and+formation+of+platelet-fibrin+thrombi+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Rate-limiting roles of the tenase complex of factors VIII and IX in platelet procoagulant activity and formation of platelet-fibrin thrombi under flow.</a> Haematologica. 100 (6), 748-756 (2015).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li>
<li>Gutierrez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+studies+of+shear-dependent+platelet+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for studies of shear-dependent platelet adhesion.</a> Lab. Chip. 8 (9), 1486-1495 (2008).</li>
<li>Hartman, R. L., McMullen, J. P., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciding+whether+to+go+with+the+flow%3A+evaluating+the+merits+of+flow+reactors+for+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Deciding whether to go with the flow: evaluating the merits of flow reactors for synthesis.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (33), 7502-7519 (2011).</li>
<li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/early/2016/07/18/blood-2016-02-696898?sso-checked=true">Blood coagulation factors bound to procoagulant platelets are concentrated in their cap structures to promote clotting</a>. , Blood. (2016).</li>
<li>Der Meijden, P. E. V. an, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-+and+erythrocyte-derived+microparticles+trigger+thrombin+generation+via+factor+XIIa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor XIIa.</a> J. Thromb. Haemost. 10 (7), 1355-1362 (2012).</li>
<li>Nickel, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polyphosphate-factor+XII+pathway+drives+coagulation+in+prostate+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The polyphosphate-factor XII pathway drives coagulation in prostate cancer-associated thrombosis.</a> Blood. 126 (11), 1379-1389 (2015).</li>
<li>Okorie, U. M., Denney, W. S., Chatterjee, M. S., Neeves, K. B., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+surface+tissue+factor+thresholds+that+trigger+coagulation+at+venous+and+arterial+shear+rates%3A+amplification+of+100+fM+circulating+tissue+factor+requires+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow.</a> Blood. 111 (7), 3507-3513 (2008).</li>
<li>Shen, F., Kastrup, C. J., Liu, Y., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+response+of+initiation+of+blood+coagulation+by+tissue+factor+in+patterned+microfluidic+capillaries+is+controlled+by+shear+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28 (11), 2035-2041 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Transfusie van bloedplaatjes concentraten wordt voorgeschreven voor de trombocytopenische patiënt te voorkomen of te stoppen met bloeden. De klinische impact werd onlangs benadrukt in een historisch overzicht van acute leukemie 12, eraan herinnerend dat verhoogde overlevingskansen van pediatrische patiënten in de jaren zestig en zeventig waren grotendeels toe te schrijven aan de verbetering van (trombocyten) transfusiegeneeskunde. Bloedplaatjes concentraten worden ook gebruikt om stam bloeden in acuut trauma of tijdens de operatie. Onder deze omstandigheden worden plaatjes met uitstekende stollingsbevorderende eigenschappen die snel hemostase initiëren voorkeur, maar bloedplaatjes concentraten worden bereid uit donaties van vrijwillige donors en, in tegenstelling farmacologische medicatie, zijn gestandaardiseerd door voorbereidende, niet door (chemische) samenstelling. Daarom is een aantal vragen op het gebied van bloed bankieren zijn onbeantwoord, waaronder die op een optimale donatie modaliteiten, de bewaarcondities en de transfusie praktijken. Op het gebied van platelet (transfusie) biologie, veel vragen op mobiele klaring uit de circulatie, de bijdrage van transfusie bloedplaatjes aan hemostase, of hun immunologie ook blijven onbeantwoord. Tal van laboratoriumtechnieken voor de bloedplaatjes functie analyse beschikbaar zijn, maar deze zijn vooral bestemd voor een bijzonder aspect van de functie van de bloedplaatjes, zoals aggregatie of degranulatie 13. In grote lijnen bloedplaatjes en bloedplaatjes concentraten te beoordelen, uitgebreide modellen van hemostase zijn onmisbaar, en deze moeten hydrodynamica bevatten. Bloedreologie cruciaal bloedplaatjes gedrag correct te interpreteren in hemostase 14, 15 of 16 trombose, zelfs als anticoagulatie verhindert Ca2 + en / of trombine te nemen in aanwezigheid van citraat of heparine respectievelijk 2. Om de wisselwerking tussen coagulatie en functie van de bloedplaatjes studeren onder stroom 17, 18, normale trombinevorming is vereist, en derhalve vrij Ca2 + ook. De experimentele opstelling voor het bestuderen hemostase onder deze omstandigheden is complex, omdat maatregelen &quot;artefact&quot; of ongecontroleerde activering van bloedstolling moet zoveel mogelijk worden voorkomen. Bovendien hebben veel gespecialiseerde onderzoeksgroepen gebruiken op maat gemaakte hardware 19, 20, die een aanzienlijke inter-laboratorium variabiliteit veroorzaakt 5. Typische beperkingen van deze benadering is het gebruik van rechthoekige vorm, niet-pulserende stromingsprofielen en niet-humane oppervlaktebekledingen 5. De test hier beschreven gebruikt handel verkrijgbare gereedschappen en derhalve geschikt zijn voor normalisatie. Omdat de stollingscascade reactie gemakkelijk wordt geactiveerd zodra bloed niet is opgenomen in het menselijk lichaam, bestuurd recalcificatietijd is een cruciale stap. To dit te bereiken, de toevoeging van Ca 2+ moet worden uitgesteld tot vlak voor perfusie over de reactieve collageen oppervlak, want als de Ca 2+ buffer wordt geleverd in bulk aan statische bloed, stolling vindt onvermijdelijk plaats, uiteindelijk verstopping van de slang en vertekenende data interpretatie (gegevens niet getoond). De oplossing voor dit probleem is om de Ca2 + buffer en het bloed afzonderlijk te pompen, waardoor het mengen van convectie en diffuse krachten tijdens perfusie op weg naar de analysekamer. Volledige menging wordt bereikt in een 46-cm slangsegment tussen de meng- en analyse kamers. Deze lengte werd berekend voor de optimale verblijftijd van de reagentia te mengen op basis van fundamentele wetten van massa- en convectief transport 21 tijdens perfusie met een debiet gebruikt (1000 s-1). Deze aanpak bleek controleerbaar en reproduceerbaar. Contactactivering van coagulatie wordt soms gezien als een artefact van eenvoudigebemonstering en bloed te vermijden bij de interpretatie van stollingstijden. Daarom hebben we aangetoond dat, in afwezigheid van remmers, contact-geïnduceerde coagulatie begint bij 16,7 min (± 3,7 min) van perfusie. In aanwezigheid van CTI tot FXIIa gemedieerde contact activatie remt, wordt in de coagulatie niet willekeurig gedefinieerd verloop van het experiment (30 min) ingeleid. Dit venster van experimenteren is voldoende lang om monsters die pro- of anti-trombose zijn te onderscheiden. Hoewel coagulatie bij contact met de activering van een ongewenst gevolg van het bloed in contact brengen kunstgras kan zijn, onze gegevens tonen een duidelijke biologische dosis effect van bloedplaatjes. Dit kan van belang zijn voor transfusie geneeskunde, omdat recente bevindingen op FXII, bloedplaatjes polyfosfaten 10, fosfatidylserine distributie 22 en bloedplaatjes micropartikels 23 daadwerkelijk geherwaardeerd contact route coagulatie als een belangrijke bijdrage aan de hemostase, evooral in de context van trombose 24. Bijvoorbeeld kan de variabele opbrengst aan bloedplaatjes bij patienten of variabele phosphatidylserine expressie van opgeslagen bloedplaatjes aldus variabiliteit induceren therapeutische werking indien succesvol coagulatie wordt getoond afhankelijk van deze factoren. Door co-immobilisatie gelipideerde rhTF met collageen, de extrinsieke coagulatie route of TF route wordt geactiveerd tijdens afzetting van bloedplaatjes op collageen. Hierdoor wordt de bepaling om de meest uitgebreide modus als voorbeeld voor verwondingen die bloed in contact brengen met TF-dragende cellen en weefsels. Onze gegevens tonen aan dat co-immobilisatie van collageen en TF vermindert het moment van coagulatie optreden, maar niet de snelheid van de bloedstolling niet. Van belang is de hoeveelheid rhTF geïmmobiliseerd aan het oppervlak is een belangrijke variabele in het model 25, 26 en gelijk te trekken binnen een gegeven onderzoek. In de presence CTI, kan het TF pathway uitsluitend bestudeerd (niet getoond) omdat contactactivering voorkomen. Concluderend onze experimentele opstelling combineert een model van transfusie door reconstitutie van trombocytopenische bloed met dwarshelling bloedplaatjes en een model van hemostase door calcium-afhankelijke afzetting van trombocyten en fibrinevorming onder hydrodynamische stroming. Deze test wordt gebruikt om vragen over de procoagulant aard van opgeslagen bloedplaatjes beantwoorden en de effecten bloedplaatjesconcentraat bereidingstechnieken hebben op deze.

Primaire en secundaire hemostase werden oorspronkelijk opgevat als twee relatief gescheiden biochemische processen. Primaire hemostase werd gezien als een belangrijke bijdrage van de arteriële stroomomstandigheden, die een sleutelrol vervullen voor bloedplaatjes, terwijl secundaire hemostase waargenomen coagulatie domineren onder veneuze bloedstroom, waardoor de protease cascade om onoplosbaar fibrine te vormen. De laatste decennia hebben deze traditionele opvatting aanzienlijk hervormd, erkennen dat bloedplaatjes activering en stolling van elkaar afhankelijk zijn en zijn even belangrijk processen tijdens fysiologische en pathologische hemostase in alle (niet-extreme) hydrodynamische milieus. Deze visie is vertaald naar de kliniek, waar de assays bedacht om volledig te meten hele bloedstolling worden steeds vaker gebruikt, zij het met veel resterende vragen over de relevantie, toepasbaarheid en het nut 1. We hebben onlangs een functionele analyse van bloedplaatjesconcentraten gebruikt microfluïdische stroomkamers bekleed met fibrillair collageen in een in vitro model van transfusie 2, met monsters die normale hoeveelheid rode bloedcellen, plasma en bloedplaatjes. Deze werkwijze gebruikt heparine of hirudine anticoagulanteerd bloed, impliceert geen of beperkte betrokkenheid secundaire hemostase, die afhankelijk is van trombinevorming en geïoniseerd calcium (Ca2 +). Trombine vorming ondersteunen en aldus alle aspecten van hemostase onder microfluïdische stroom omvatten, ontwikkelden we een aanvullende methode hetzelfde technische platform, nu ook vrij Ca2 +. Zo kan afzetting van trombocyten en fibrinevorming bestudeerd, opnieuw in een model van trombocytentransfusie, bloedplaatjes concentraat kwaliteit te beoordelen. In deze werkwijze worden de bloedplaatjes en fibrinogeen gelabeld met fluoroforen die volledig emissiespectra gescheiden. Tweekleurige, real-time video microscopie maakt dan is de analyse van deprimaire bloedplaatjesadhesie, alsmede coagulatie initiatie en fibrine depositie. Een belangrijke variabele in dit type test is recalcificatietijd, omdat de toevoeging van Ca2 + statische bloed vóór perfusie, zal onvermijdelijk contact geïnitieerde coagulatie in de houder veroorzaken. Deze initiatie zal vertekening van de uitlezing als gevolg van verstopping van de slang en biochip inhammen voorafgaand aan de perfusie. Dus in onze werkwijze, citraat geanticoaguleerd bloed en Ca2 + -bevattende buffer afzonderlijk gepompt door de bovenbenen van een Y-vormige inlaatkamer. De componenten worden gemengd tijdens perfusie alvorens een analysekamer bekleed met alleen of in combinatie met recombinant humaan weefselfactor (rhTF) collageen. Door het aanpassen van de stroomsnelheden van de afzonderlijke pompen en de concentratie van Ca2 + in de buffer, een 10% verdunning van het laatste bloedmonster plaatsvindt. Gebruik van deze uitgebreide protocol tonen we de bijdrage van coagulatie factor XII (FXII) en bloedplaatjes concentratie contact route coagulatie initiatie onder stroom. Onze gegevens tonen ook aan dat door bekleding rhTF naast collageen, de tissue factor pathway kan gelijktijdig gemeten.

<table><tbody><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>A00434</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Syringe</td><td>BD</td><td>307727</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405</td><td>Life Technologies</td><td>A30100</td><td>De handleiding van de fabrikant werd gevolgd voor het labelen van fibrinogeen</td></tr><tr><td>BD vacutainer Eclipse</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>Bloedopnamenaald met vooraf bevestigde houder</td></tr><tr><td>BD vacutainer tube with EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>BD vacutainer tube with Sodium Citrate</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>Blocking buffer</td><td>in house preparation</td><td>in house preparation</td><td>1,0% (w/v) bovijn serum albumine en 0,1% (w/v) glucose in HBS</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Molecular probes</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Coagulation buffer</td><td>in house preparation</td><td>in house preparation</td><td>10 mM CaCl2 en 3,75&nbsp;mM MgCl2 in HBS</td></tr><tr><td>Conical tube 15 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>Conical tube 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Corn trypsin inhibitor (CTI)</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>CTI</td><td></td></tr><tr><td>Denaturated alcohol</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td>3,3'-Dihexyloxacarbocyanine jodide - 1 mM oplossing in DMSO</td></tr><tr><td>Exigo microfluidic pump</td><td>Cellix</td><td>EXIGO-PC-FS7.0-MF</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3879</td><td>In house gelabeld met AF 405 - stamconcentratie 10,7&nbsp;mg/mL</td></tr><tr><td>Hematology analyzer</td><td>Sysmex</td><td>pocH-100i</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffered saline (HBS)</td><td>in house preparation</td><td>in house preparation</td><td>10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0,9% (w/v) NaCl), pH 7,4</td></tr><tr><td>Horm Collagen</td><td>Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>Natief equijn tendon collageen (type I) Isotone glucose-oplossing om collageen te verdunnen is aangevuld</td></tr><tr><td>Humidified box</td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Incubation water bath</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>uitgerust met een colibri-LED en een CCD-camera met hoge resolutie</td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>met Multiflow8</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Brand</td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 100-1000</td><td>Greiner bio-one</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 1-10</td><td>Eppendorf</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 2-200</td><td>Greiner bio-one</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>Platelet concentrate orbital shaker</td><td>Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>Precision wipes</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin solution&nbsp;</td><td>Hanna instrument</td><td>HI7073L&nbsp;</td><td>2 g pepsine per 75 mL oplossing, eiwitreinigingsoplossing met pepsine</td></tr><tr><td>Recombinant Human Tissue Factor Innovin</td><td>Dade Berhing</td><td>B4212-40</td><td>rhTF met synthetische fosfolipiden</td></tr><tr><td>Software microscope&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>Sterile docking device</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Table Top Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>Tube Roller</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>Tubing Sealer</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 syringe connector pin</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>Gecoate biochip</td></tr><tr><td>Vena8 Needles</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Tubing</td><td>Cellix</td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td></td></tr><tr><td>VenaDelta Y1 Biochips</td><td>Cellix</td><td>VDY1-400-100-01-02</td><td>Mixende biochip</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>ZEN2012 software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een microfluïdische flow kamer model voor trombocytentransfusie en hemostase maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine formation in real-time

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluïdische modellen van hemostase beoordelen bloedplaatjes functie onder omstandigheden van hydrodynamische afschuifkrachten, maar in aanwezigheid van anticoagulantia, wordt deze analyse beperkt tot bloedplaatjes afzetting. De ingewikkelde relatie tussen Ca 2+ -afhankelijke stolling en bloedplaatjes functie vereist een zorgvuldige en gecontroleerde recalcificatietijd van het bloed voorafgaand aan analyse. Onze setup maakt gebruik van een Y-vormige mengen kanaal, dat geconcentreerde Ca 2+ / Mg 2+ buffer levert aan stromend bloed vlak voor perfusie, waardoor een snelle recalcificatietijd zonder monster stasis. Een tienvoudige verschil in stroomsnelheid tussen beide reservoirs minimaliseert verdunning. De recalcified bloed wordt vervolgens doorbloed in een met collageen beklede analyse kamer, en differentiële labeling maakt real-time beeldvorming van zowel het aantal bloedplaatjes en fibrine afzetting met behulp van fluorescentie microscopie video. Het systeem gebruikt handel verkrijgbare instrumenten, de kansen op normalisatie. Reconstructie van thrombocytopenic bloed met plaatjes van dwarshelling concentreert zich bovendien modellen bloedplaatjestransfusie, bewijst het gebruik ervan in dit onderzoeksdomein. Voorbeeldgegevens aangetoond dat coagulatie begin en fibrine depositie was lineair afhankelijk van de concentratie van bloedplaatjes, hetgeen de verhouding tussen de primaire en secundaire hemostase in ons model. In een tijdsbestek van 16 perfusie min, had contact activering niet plaats, ondanks recalcificatietijd normaal Ca 2+ en Mg 2+ niveaus. Wanneer coagulatie factor XIIa werd geremd door maïs trypsineremmer deze periode was zelfs langer, hetgeen een aanzienlijke dynamische bereik waarin de veranderingen in de procoagulant aard van de bloedplaatjes kan worden beoordeeld. Co-immobilisatie van tissue factor met collageen verminderde significant de tijd tot begin van bloedstolling, maar niet de snelheid. De mogelijkheid om de weefselfactor en / of de contact route bestuderen verhoogt de veelzijdigheid en het nut van de test.

De analyse van real-time door data is beschreven in figuur 1. Eerst, bloedplaatjes zich aan het reactieve oppervlak, waardoor een gestage toename geregistreerd groene fluorescentie (Figuur 1A, i), genoemd hechting. Tijdens deze fase is er weinig violet fluorescentie, wat aangeeft dat fibrine niet of slechts marginaal gevormd (Figuur 1B). Na het instellen van coagulatie, violet oplichtende fibrine afzettingen snel (iii), en in die tijd, bloedplaatjes groene fluorescentie verhoogd op ongeveer dezelfde snelheid, hier aangeduid als bloedplaatjes accumulatie (ii). Een enkel experiment dus terugkeert drie tarieven van de fluorescentie verhoging (i, ii, en iii) als een surrogaat marker voor de snelheid waarmee de bloedplaatjes en fibrine depositie vindt plaats in dit model. Verder wordt een moment van coagulatie aanzet (schip-of-onset (iv)) geëxtrapoleerd, hetgeen een determinant van bloedplaatjesprocoagulante potentieel. Aangezien TF, coagulatie initiatie traag en vooral loopt via het contact pad waar de intrinsieke TENase complex activeert FX via directe activatie van FIX 6 door FXI en / of FXII. Om FXII afhankelijkheid tonen, 4 uM maïs trypsineremmer (CTI) werd toegevoegd aan geactiveerde FXII remmen (FXIIa) 7. Deze remming heeft geen invloed op bloedplaatjesadhesie (figuur 2A), maar coagulatie niet begonnen voor willekeurig gedefinieerd totale duur van de perfusie experiment (figuur 2B en aanvullende Video 1). In vitro, kan de contactpersoon route worden gestart door vreemde materialen zoals glas, of in de klinische testen met behulp van een mineraal materiaal zoals kaolien. In vivo geactiveerde plaatjes over een negatieve lading 8 &lt;/ sup&gt; door het membraan blootgesteld zure fosfolipiden 9, zoals fosfatidylserine en / of door het vrijkomen van polyfosfaten (poliep) 10, 11. De microfluïdische real-time test bootst de laatste omdat, in verschillende concentraties bloedplaatjes, de hemostatische reactie afhankelijk van de bloedplaatjestelling (figuur 3). Door het aantal bloedplaatjes in het gereconstitueerde monster, de snelheid van hechting (figuur 3A), accumulatie (Figuur 3B, groen) en coagulatie (figuur 3B, violet) lineair toe. Het moment-of-onset aanzienlijk verkort (figuur 3C) van toenemende concentratie van bloedplaatjes, wat suggereert dat een drempelwaarde aantal (geactiveerd) afgezette bloedplaatjes nodig om coagulatie te activeren. Bij weefselschade in vivo echter, TF-dragende cellen zal initiate het stollen van bloed via de FVIIa-TF extrinsieke TENase complex in de aanwezigheid van Ca2 +. Dit wordt nagebootst in onze experimentele opstelling door post-bekleden van de collageen-bevattende perfusie kamers met gelipideerd rhTF. In een gepaarde analyse kanalen bekleed met alleen of in combinatie met rhTF collageen, coagulatie begin significant sneller (Figuur 4A). De snelheid van bloedplaatjesadhesie niet lineair, dus geen lineaire regressie kunnen worden uitgevoerd (data niet getoond). Zowel de snelheid van de stolling en bloedplaatjes accumulatie waren niet verschillend tussen de omstandigheden (figuur 4B-4C, Aanvullende Video 2). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55351/55351fig1.jpg" /> Figuur 1: Regressie analyse van bloedplaatjesadhesie en coagulatie in microfluïdische perfusiekamers. Deze figuur verduidelijkt de parameters afgeleid van real-time fluorescentie ruwe data<html> opgedaan tijdens recalcified bloedstroom over een reactief oppervlak. (A) gemiddelde intensiteit van groene fluorescentie toont bloedplaatjes afzetting als functie van de tijd perfusie. De curve beschrijft een bimodale proces begint met (i) langzaam toenemende lineaire bloedplaatjesadhesie gevolgd door (ii) snelgroeiende lineaire accumulatie. Zowel lineaire delen van de curve worden regressie en de helling van deze beschrijft de twee tarieven van trombusvorming door bloedplaatjes fluorescentie; (I) hechting en (ii) accumulatie. (B) De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van violet toont afzetting van fibrine als functie van de tijd. Tijdens de hechting van bloedplaatjes, violet fluorescentie is in wezen afwezig is, terwijl het snel ontwikkelt volgende start van de coagulatie. De (iv) schip-of-onset is gedefinieerd als het snijpunt met de x-as van de geëxtrapoleerde lineaire regressie van (iii) de tweede fase van trombusvorming door hier aangeduid als coagulatie fibrine fluorescentie.ef = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55351/55351fig2.jpg" /> Figuur 2: Aangezien TF, coagulatie in met collageen beklede perfusie stroomkamers afhankelijk FXIIa. Microfluïdische perfusie van geregenereerde bloed met CTI of controle buffer (controle) werd uitgevoerd bij een afschuifsnelheid van 1000 s-1 gedurende in totaal 30 min. (A) De snelheid van de hechting van bloedplaatjes (s -1) was niet afhankelijk van CTI. (B) Het moment-of-onset voor CTI-behandelde monsters was boven de 30 min grens van het experiment (getoond als een stippellijn), waaruit de afhankelijkheid FXIIa van deze parameter. Bars en stippen zijn gemiddelde waarden, snorharen zijn standaarddeviatie. Statistische analyse werd met gepaarde t-test. (NS = niet significant, n ≥3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55351/55351fig3.jpg" /> Figuur 3: Coagulatie onderbroken wordt afhankelijk van het aantal plaatjes. Microfluïdische perfusie experimenten werden uitgevoerd in met collageen beklede kamers met gereconstitueerde bloed in de aanwezigheid van Ca2 + en variërende concentraties van bloedplaatjes (n ≥3). (A) Waardering van bloedplaatjesadhesie (B) percentage bloedplaatjes accumulatie (groen) en coagulatie (violet) en (C) schip-of-onset getoond als functies van bloedplaatjes concentraties in bloed gereconstitueerd. Dots zijn gemiddelde waarden, snorharen zijn standaarddeviaties. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versi bekijken</a>op van dit cijfer. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55351/55351fig4.jpg" /> Figuur 4: Activering van zowel TF en contact route coagulatie verkort aanzienlijk het moment-of-onset van de bloedstolling. Gereconstitueerd bloed in aanwezigheid van Ca2 + werd geperfuseerd via de kamers bekleed met alleen of met collageen en rhTF het contact pad alleen of een combinatie van het contact en TF paden bestuderen collageen. (A) Het moment-of-onset stolling aanzienlijk verkort TF-bevattende stromingskamers. (B) De snelheid van de ophoping van bloedplaatjes tijdens stolling en (C) de snelheid van de bloedstolling zijn niet significant verschillend tussen collageen alleen of collageen en rhTF-gecoate stroom kamers. Bars en stippen zijn gemiddelde waarden; snorharen zijn standaarddeviaties. Statistische analyse werd met gepaarde t-test. (NS = niet significant, * P &lt;<html> 0,05, n ≥3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/55351/55351vid1.jpg" /> Aanvullende Video 1: Aangezien TF, coagulatie in met collageen beklede perfusie stroomkamers afhankelijk FXIIa. De rol van het contact route wordt bepaald met collageen beklede perfusie flow cellen. (A) Overlaid beeld fluorescentie sequentie van bloedplaatjes (groen) en fibrine (fibrinogeen) (violet) depositie in afwezigheid van CTI. (B) dezelfde sequentie als paneel A maar met het groene kanaal uitgeschakeld. (C) Overlay image fluorescentie sequentie van bloedplaatjes (groen) en fibrine (fibrinogeen) (violet) depositie in de aanwezigheid van CTI. (D) dezelfde sequentie als panel C maar met het groene kanaal uitgeschakeld.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om deze video te downloaden. <img alt="video 2" src="/files/ftp_upload/55351/55351vid2.jpg" /> Aanvullende Video 2: Activering van zowel TF en het contact route verkort aanzienlijk de coagulatie ogenblik-of-onset. Om de rol van TF te bestuderen, werden stroomkamers bekleed met alleen of met collageen en collageen rhTF gebruikt. (A) Overlaid beeld fluorescentie sequentie van bloedplaatjes (groen) en fibrine (fibrinogeen) (violet) depositie in flow kamers alleen bekleed met collageen. (B) dezelfde sequentie als paneel A maar met het groene kanaal uitgeschakeld. (C) Overlay image fluorescentie sequentie van bloedplaatjes (groen) en fibrine (fibrinogeen) (violet) depositie in flow kamers bekleed met zowel collageen en rhTF. (D) dezelfde sequentie als panel C maar met het groene kanaal switched off. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_2.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

Dit artikel beschrijft een experimenteel model van hemostase die gelijktijdig meet bloedplaatjesfunctie en coagulatie. Bloedplaatjes en fibrine fluorescentie wordt gemeten in real-time en bloedplaatjesadhesie rate, coagulatie snelheid, en het begin van coagulatie bepaald. Het model wordt gebruikt voor bloedplaatjes stollingsbevorderende eigenschappen bepalen onder stroom concentraten voor transfusie.

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Het algemene doel van dit microfluïdische experiment is om met behulp van real-time videomicroscopie gelijktijdig de plaatjesdepositie in fibrineming op een reactief oppervlak onder stromingscondities te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de transfusiegeneeskunde over de effecten van de bereiding van plaatjesconcentraten op de procoagulante eigenschappen van getransfundeerd bloed. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de gelijktijdige analyse van plaatjesfunctie en stolling in de stroom faciliteert, waardoor de interactie tussen beide processen kan worden onderzocht.Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de door de contactroute geïnduceerde plaatjesprocoagulatie, kan deze ook worden toegepast bij de studie van de extrinsieke route door te coaten met gelipideerde weefselfactor. De procedure wordt gedemonstreerd door Rosalie Devloo, een laborant van het laboratorium. Begin de opstelling van de microfluïdische stroomkamer door 0,8 µL vers gereconstitueerd collageen te pipetteren over vijf zesde van de lengte van elk kanaal aan één uiteinde van een nieuwe wegwerp microfluïdische biochip met acht rechte parallelle kanalen, en markeer dit uiteinde van de microchip als de uitlaat.Incubeer de biochip gedurende ten minste vier uur bij vier graden Celsius in een bevochtigde en afgesloten container. Vul aan het einde van de incubatie de gecodeerde kanalen in een gelijk aantal Y-vormige kanalen in een mengbiochip met blokkeringsbuffer. Plaats de microchip voor één uur bij kamertemperatuur terug in de container.Plaats vervolgens een pin in één uiteinde van twee stukken slang van 8 cm lang en één stuk slang van 2 cm lang, en in beide uiteinden van één stuk slang van 46 cm lang voor elk gebruikte kanaal. Gebruik daarna de Nanopump-software om alle pompfluidica in de aangesloten slangen te spoelen met gedestilleerd water, en gebruik een spuit in de spuitenconnectorpin om alle overige slangen te vullen met blokkeringsbuffer. Fixeer vervolgens de gecodeerde biochip op de geautomatiseerde microscooptafel met behulp van een laboratoriumschaarhefboom om de mengbiochip op dezelfde hoogte als de microscooptafel te fixeren.Gebruik de pinnen in de buizen van acht centimeter om deze stukken slang vast te zetten aan de inlaat van de mengbiochip en plaats het vrije uiteinde van elke slang in een vial met HEPES-gebufferde zoutoplossing. Verbind nu de gecodeerde biochip met de mengbiochip met het stuk slang van 46 centimeter in een flexibele, maar rechte lijn. Bevestig een spuitconnectorpen aan de luer-compatibele slang van de spoelpomp.Verbind vervolgens de pin met het vrije uiteinde van het stukje slang van twee centimeter en bevestig het andere uiteinde van de slang aan de uitlaat van de gecodeerde biochip. Spoel daarna alle slangetjes en kanalen met één milliliter HBS. Om de perfusiepompen voor te bereiden, opent u de software Microfluidic Perfusion Pump Driver en dubbelklikt u op het spuiten-icoon om de pompen te initialiseren.Selecteer het type spuit dat gebruikt zal worden en koppel de spoelpomp en de twee centimeter lange slang die eraan is verbonden los. Verbind de losgekoppelde slang van twee centimeter, met de spuitconnectorpen, met de luer-lock van een stuk dikwandige afvalslang en gebruik een spuit om de dikwandige slang te vullen met standaard pepsine-oplossing. Zet vervolgens het open uiteinde van de dikwandige slang vast met een Kocher-klem.Bevestig de slang aan de uitlaat van de gecodeerde biochip. Koppel de twee slangen samen los van de mengstroomkamer en gooi de containers met HBS weg. Nadat het bloedmonster is afgenomen in vacuümbuizen met natriumcitraat, worden de buizen gecentrifugeerd en wordt het bloedplaatjesrijk plasma overgebracht naar een nieuwe centrifugeerbuis.Centrifuge de containers met bloedplaatjesrijk plasma opnieuw. Draag vervolgens het supernatant van het bloedplaatjesarm plasma over naar een andere centrifugebuis. Gebruik daarna een naald van gauge 21 om de bodem van de natriumcitraatcontainers te perforeren, zodat de gepakte rode bloedcellen in een nieuwe conische buis kunnen druppelen.Wanneer alle gepakte rode bloedcellen zijn verzameld, wordt het bloed voorzichtig gereconstitueerd door de gescheiden gepakte rode bloedcellen te combineren met plaatjesarm plasma; voeg vervolgens bloedbankplaatjes toe die zijn voorbereid voor transfusie om monsters te verkrijgen met een hematocriet van 40% en een concentratie van 2,5 × 10⁵ plaatjes per µL in een eindvolume van 2,5 mL, en bepaal een volledig bloedbeeld. Voeg vervolgens 13 µL fluorofoor-gelabeld fibrinogeen toe aan een conische polystyreen buis, gevolgd door 1 mL van het gereconstitueerde bloed.Meng nog één milliliter bloed met twee microliters fluorescerende bloedplaatjeskleurstof en voeg de gelabelde bloedmonsters samen. Keer de gemengde bloedmonsters vervolgens voorzichtig om en incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37 °C. Stel voor aanvang van de perfusie-assay de microscoopoptiek scherp op de collageenvezels die aan de bodem van het eerste kanaal zijn gehecht.Definieer met de acquisitiesoftware een region of interest in het geselecteerde kanaal. Laad één milliliter voorverwarmde coagulatiebuffer in een spuit van één milliliter en monteer de spuit op de perfusiepomp. Laad na een tweede voorzichtig omkeren het bloed in een spuit van twee milliliter en monteer de spuit op de perfusiepomp.Gebruik vervolgens een spuitenverbindingspen om beide spuiten aan één stuk slang van acht centimeter te bevestigen en spoel de connectoren en slangen door met een snelheid van 400 µL per minuut. Wanneer alle slang gevuld is met ofwel coagulatiebuffer of bloed, bevestig dan het andere uiteinde van beide slangen met pennen aan de splitspoten van het Y-vormige kanaal in de mengbiochip. Verwijder daarna de Kocher-klem bij de uitlaat van de afvalslang en start de perfusie met 4,4 µL per minuut voor de coagulatiebuffer en 44 µL per minuut voor het gereconstitueerde bloed.Neem elke 10 seconden beelden op gedurende 30 minuten in real-time, en stop de pompen en de beeldverwerving na 30 minuten of wanneer het signaal verzadigd raakt. Gooi vervolgens alle slangetjes en spuiten weg als biologisch gevaarlijk afval. Deze video biedt een uitstekend voorbeeld van de opbouw van bloedplaatjestrombi en fibrineafzetting.Aan het begin van de perfusie hechtten de bloedplaatjes zich aan het reactieve oppervlak, wat resulteerde in een gestage toename van de geregistreerde groene fluorescentie. Tijdens deze adhesiefase is er weinig violette fluorescentie, wat aangeeft dat er slechts marginaal fibrine wordt gevormd. Bij de start van de stolling zet het violet fluorescerende fibrine zich snel af, terwijl de groene fluorescentie van de bloedplaatjes in ongeveer hetzelfde tempo accumuleert.Het moment van het begin van de stolling kan daarom worden geëxtrapoleerd als een determinant voor het procoagulante potentieel van de bloedplaatjes. De toevoeging van corn trypsin inhibitor aan het gereconstitueerde bloed heeft geen invloed op de adhesie van bloedplaatjes, maar de stolling start niet gedurende de volledige duur van het perfusie-experiment. Door het aantal bloedplaatjes in een gereconstitueerd monster te verhogen, nemen de snelheid van adhesie, accumulatie en stolling lineair toe.Het moment van aanvang wordt aanzienlijk verkort door de bloedplaatjesconcentratie te verhogen, wat suggereert dat een drempelwaarde van geactiveerde, gedeponeerde bloedplaatjes vereist is om stolling te triggeren. Bovendien is, in een gepaarde analyse van kanalen die uitsluitend met collageen zijn gecoat, of in combinatie met recombinant gelipideerd weefselfactor, de aanvang van de stolling significant sneller, hoewel noch de totale stollingssnelheid, noch de accumulatie van bloedplaatjes verschilt tussen de condities. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een microfluidisch flowkamer-experiment uitvoert met dubbel gelabeld gereconstitueerd bloed voor de simultane analyse van bloedplaatjesfunctie en stolling.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de transfusiegeneeskunde om de interacties tussen bloedplaatjes en stolling onder stroming te onderzoeken. In deze video hebben we ons gericht op het demonstreren van een gestandaardiseerd experiment. Er kunnen echter wijzigingen in de oppervlaktecoating, schuifspanningen of calciumconcentratie worden aangebracht om specifieke, relevante onderzoeksvragen te beantwoorden.

a-microfluidic-flow-chamber-model-for-platelet-transfusion-hemostasis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De hechting van bloedplaatjes cascade vindt plaats in het bijzijn van shear flow, een factor niet goed voor in conventionele (statisch) goed-plaat assays. In dit artikel wordt verslag gedaan van een bloedplaatjes-aggregatie assay gebruik maakt van een microfluïdisch goed plaat formaat om fysiologische afschuifstroming omstandigheden na te bootsen.

Bloedplaatjes adhesie en aggregatie Onder Flow met behulp van Microfluïdische Flow Cellen

Trombocyttransfusie en hemostase werden gemodelleerd met behulp van bloedreconstitutie en microfluïdische stroomkamers om de functie van bloedbanktrombocyt te onderzoeken. De gegevens tonen de gevolgen van trombocyt-opslageffect op hemostase, in vitro aan.

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; In Vitro</em

Dit werk beschrijft een fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methode voor het bestuderen van bloedplaathechting, verspreiding en afscheiding onder stroming. Dit veelzijdige platform maakt het mogelijk om bloedplaatjesfunctie te onderzoeken voor mechanistisch onderzoek naar trombose en hemostase.

Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming

De bloedplaatjesfunctie onder stroom kan worden beoordeeld en gesimuleerde hemostatische reanimatie kan worden gemodelleerd met behulp van een microfluïdisch apparaat, dat toepassingen heeft in de trauma- en transfusiegeneeskunde.

Microfluïdica bij het beoordelen van de bloedplaatjesfunctie

We beschrijven een methode om onder hechtende cellen aan laminaire stroming shear stress in een steriele continue stroom circuit. De cellen 'hechting, kan morfologie worden bestudeerd door de transparante kamer, monsters verkregen van het circuit voor de metaboliet-analyse en-cellen geoogst na afschuiving blootstelling voor toekomstige experimenten of cultuur.

Parallelle plaat flow kamer en Continuous Flow Circuit te endotheliale progenitorcellen Evalueer onder laminaire stroom Afschuifspanning

Time-lapse microscopie- en beeldverwerkingstechnieken werden gebruikt om fibroblastgemedieerde gelverdichting en fibrinevezelherschikking in een milieuvriendelijke bioreactor gedurende een periode van 48 uur te observeren en te analyseren.

Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction

Protocollen voor de studie van biofilmvorming in een microfluïdisch apparaat dat poreuze media nabootst, worden besproken. Het microfluïdische apparaat bestaat uit een array van micro-pillaren en de biofilmvorming door Pseudomonas fluorescens in dit apparaat wordt onderzocht.

Protocol voor Biofilm Streamer Vorming in een microfluïdische apparaat met micro-pijlers

We presenteren een methode voor microfluïdische depositie van genipine en fibronectine met een patroon op PDMS-substraten, waardoor een langere levensvatbaarheid van weefsels met een hoge dichtheid aan vasculaire gladde spiercellen mogelijk wordt. Deze weefselfabricagemethode wordt gecombineerd met eerdere technologie voor dunne vaatwandfilms om de vasculaire contractiliteit te meten gedurende tijdsverlopen die relevant zijn voor ziekten.

Microfluïdische Genipin Deposition Techniek voor Extended Cultuur van micropatterned Vascular Gespierd Thin Films

De creatie van functionele microweefsels binnen microfluïdische apparaten vereist de stabilisatie van celfenotypen door traditionele celkweektechnieken aan te passen aan de beperkte ruimtelijke dimensies in microapparaten. Aanpassing van collageen maakt de laag-voor-laag afzetting van ultradunne collageenstructuren mogelijk die primaire cellen, zoals hepatocyten, kunnen stabiliseren als microfluïdische weefselmodellen.

Layer-by-layer Collageen depositie in Microfluïdische Inrichtingen voor Microtissue Stabilization

Leucocyt-Plaatjerijk Fibrine (L-PRF) vertegenwoordigt een door de FDA goedgekeurde bereiding van autologe bloedplaatjesconcentraten die een unieke fibrine-architectuur, verrijkte bloedplaatjes en overvloedige groeifactoren bezit. Hier presenteren we een protocol voor de generatie van L-PRF aan de patiëntkant, evenals evalueren we zijn mechanische eigenschappen, inclusief uniaxiale testen en hechtingssterktetesten.

Karakterisering van Leukocyte bloedplaatjes Rich fibrine, A Novel Biomateriaal

Leer een microfluïdische methode voor hemostaseonderzoek met real-time analyse van trombocytdepositie en fibrinevorming onder stromingsomstandigheden. Deze techniek biedt inzicht in transfusiegeneeskunde.

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time (Video) | JoVE Journal

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

Meer video's verkennen