Name: Magneetroerder werkwijze voor de detectie van Trichinella Larven in Muscle Samples (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer de magneetroerder methode voor het detecteren van Trichinella-larven in spierweefstalen. Deze gouden standaardtechniek vereist geen gespecialiseerde apparatuur maar vraagt wel strikte kwaliteitsbeheersing voor betrouwbare resultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij u vriendelijk bedanken Sabine Reckinger voor een uitstekende technische bijstand en ondersteuning.

1. Voorbereidingen <ol><li> monstername Opmerking: De magneetroerder methode kan worden gebruikt voor een of spier samengevoegde monsters. <ol><li> Verzamel monsters uit de juiste voorliefde sites en in een passend bedrag 9. Raadpleeg de eisen land of aan de aanbevelingen van ICT, OIE of ISO. <ol><li> Voor de Europese Unie, bijvoorbeeld, neem een ​​1 g monster van een diafragma pilaar bij de overgang van spier naar pees van tamme varkens. Zorg ervoor dat alle spieren monsters zijn vrij van alle vet en fascia. </li></ol></li><li> Als de tong wordt getest, verwijdert de oppervlaktelaag voorafgaand aan het testen. </li><li> Pas op als monsters worden bevroren, omdat de meeste Trichinellalarven niet bestand zijn bevriezen en afwikkelen na de dood, zijn minder bestand tegen de spijsvertering en hebben de neiging vast te houden aan de container muren, wat resulteert in verminderde gevoeligheid van de test. Opmerking: Indien bevroren, het dubbele van de steekproefgrootte op loosten en verhoging van de sedimentatie (zie hieronder). </li></ol></li><li> Voorbereiding van de spijsvertering vloeistof <ol><li> Voeg 25% HCl (16 ± 0,5 ml) tot 2 liter leidingwater voorverwarmd tot 46-48 ° C in een 3 L glazen beker. Te lage temperatuur leidt tot onvolledige vertering; te hoge temperatuur deactiveert de enzymatische eigenschappen van pepsine. </li><li> Plaats een roerstaafje in de beker en roer de oplossing op een voorverwarmd bord (46-48 ° C). </li><li> Voeg 10 ± 0,2 g pepsine (1: 10.000 NF, 1: 12.500 BP, 2000 FIP) aan de zure oplossing. Opmerking: De kwaliteit van de pepsine is van het allergrootste belang is en enzymactiviteit moet worden gecertificeerd door de producent. Om laboratorium veiligheidsredenen en om de pepsine activiteit te behouden, moet de volgorde van het toevoegen van digestievloeistof componenten worden nageleefd. </li></ol></li><li> Muscle monstervoorbereiding <ol><li> Hak tot 100 g van de spier monsters in een blender of molen. Om blen vergemakkelijkending, voeg 2 ml voorverwarmd water aan de monsters en mix op max snelheid 2-3 s. </li><li> Voordat de tweede mengen, opent u de blender en overdragen spier monster aan de top van het mengen kom rand marge aan de onderkant en herhaal mengen. Blijven mengen met uitbarstingen van 2-3 s tot er geen zichtbare stukjes vlees blijven. Opmerking: Te weinig vermenging kan leiden tot onvolledige spijsvertering, terwijl te veel mengen de larven aanwezig Trichinella in de monsters 6 kunnen beschadigen. </li></ol></li></ol> 2. Procedure <ol><li> Muscle monsterontsluiting <ol><li> Transfer 1 L van de digestievloeistof in een cilinder. Breng de gemalen vlees in de beker en te verspreiden bij de vertering vloeistof met een lepel of vork. Spoel de mixer deksel blade mixer kom met 500 ml van de voorverwarmde digestie fluïdum in de 3 L bekerglas. Opmerking: Onvolledige spoelen kan resulteren in het verlies van sensItivity. </li><li> Bedek het bekerglas met aluminiumfolie en houdt een constante temperatuur van 44-46 ° C en monitor met een thermometer. </li><li> Roer de digestievloeistof 30 minuten tot een diepe draaikolk zonder spatten ontstaat tot het vlees deeltjes verdwijnen. Afhankelijk van het soort vlees getest (bv vlees van wilde dieren), verhogen de vertering tijd tot een maximum van 60 minuten. </li></ol></li><li> Filtratie en sedimentatie van de digestievloeistof <ol><li> Om de hoeveelheid onverteerd weefsel vast te stellen, de omvang op nul, wegen de zeef voor gebruik, en noteer het gewicht. De zeef moet schoon en vrij van elk weefsel deeltjes, die de Trichinellalarven het bereiken van de sedimentatie trechter kunnen belemmeren. Controleer of de scheiding trechter verticaal wordt genivelleerd. </li><li> Na de vertering, giet de digestievloeistof door een 180 urn zeef in een scheiding glas trechter. De breedte van de scheiding glas trechter mag niet be groter dan 55% van de lengte larve goede sedimentatie mogelijk. Zorg ervoor dat eventuele overflow te voorkomen. </li><li> Om verlies van de gevoeligheid te voorkomen, spoel het bekerglas en de zeef met ongeveer 200 ml leidingwater uit een squeeze wassen fles en breng het spoelwater in de sedimentatie glas trechter. Zorg zorgvuldig spoelen de randen van de 3 L bekerglas. Til de zeef en het gebied afspoelen onder de zeef grondig. </li></ol></li><li> Bepaling van onverteerd weefsel bedrag Opmerking: Als gevolg van fouten in de uitvoering van de werkwijze kan spierweefsel op de zeef blijft, en fascia en bindweefsel onverteerbaar zijn. De hoeveelheid van onverteerd weefsel wordt bepaald gedurende de eerste 10 min sedimentatiestap (zie 2.5). Dit maakt ongeveer 30 minuten voor de zeef droog, het restwater het vastgestelde gewicht van de onverteerd weefsel kan beïnvloeden. <ol><li> Plaats een papieren handdoek op een schaal, en wegen van de zeef met de undigested weefsels. </li><li> Trek de zeef gewicht vóór filtratie uit de zeef gewicht met onverteerd weefsels. Het verteringsproces als voldoende beschouwd indien niet meer dan 5% van het uitgangsgewicht van de zeef (dat wil zeggen 5 g / 100 g uitgangsmateriaal) blijft. </li><li> Als de hoeveelheid onverteerd weefsel 5% overschrijdt, herhaal de test met verse spier monsters. Als het restmateriaal hoofdzakelijk bestaat uit onverteerd spierweefsel en verse monsters beschikbaar zijn, verteren het onverteerde resten telkens onderzoeken aanvulling op de oorspronkelijke monsters. </li></ol></li><li> Sedimentatie van de digestievloeistof <ol><li> Houd de gefilterde digestievloeistof in de scheitrechter gedurende 30 minuten. Als ongemoeid gelaten, zal de Trichinellalarven bezinken op de bodem van de trechter. </li><li> Indien bevroren monsters worden gebruikt, verhogen de sedimentatie tijd maximaal 60 minuten. </li><li> Zodra sedimentatie is voltooid, wordt de kraan volledig openvan de scheitrechter te laten ten minste 40 ml van de digestievloeistof snel af in een bekerglas (80 ml als spier monsters die eerder bevroren was geweest). </li><li> Allereerst de helft van de vloeistof in de cilinder en vervolgens de kraan volledig open in tegengestelde richting 10 ml digestievloeistof laten passen. Tenslotte opent de kraan in de tegengestelde richting nog 10 ml. Deze procedure garandeert dat Trichinellalarven niet worden gevangen in de kraan. Opmerking: voldoende snelheid vereist om nog in de scheitrechter larven te voorkomen, verminderen gevoeligheid. </li></ol></li><li> Sedimentatie van de vertering fluïdum in de cilinder <ol><li> Laat het sediment in de cilinder gedurende 10 minuten om larven te sedimenteren. Verwijder 30 ml supernatant door afzuigen met een pipet zonder de 10 ml sediment. </li><li> Om de hoeveelheid weefsel vezels in het monster te verminderen, voeg 30 ml leidingwater om het sediment en laat nog 10 min. Herhaal dit totdat de vloeistof helder. </li><li> Verwijder supernatant en breng de 10 ml gewassen sediment naar een gerasterde petrischaal of tellen van larven. Spoel de cilinder met 10 ml leidingwater en vervolgens het water toe te voegen aan het monster. Opmerking: Als grote hoeveelheden vuil in het monster kan de identificatie van de Trichinellalarven (figuur 1) te voorkomen, moet verder wasstappen worden uitgevoerd, indien nodig. </li></ol></li><li> Microscopisch onderzoek <ol><li> Gebruik trichinoscoop of stereomicroscoop met een substap uitgezonden lichtbron van regelbare, in een 15 tot 20x vergroting de monsters onmiddellijk na de wasstappen onderzoeken. </li><li> Na het storten van het monster in de gerasterde petrischaal, onderzoekt de schaal / bekken systematisch raster door raster. Als er geen verdachte structuren worden gevonden, beweeg de vloeistof in de gerasterde petrischaal of tellen van larven in een circulaire manier om eventuele Trichinella la toestaanrvae, die mogelijk zijn uitzicht, zich ophopen in het midden van de petrischaal. Herhaal het onderzoek. </li><li> Als een verdachte structuur wordt gevonden, te verhogen vergroting tot 40 - 100X. Verwijderen Trichinellalarven uit de schaal / bekken met een pipet en in een buis met een 90% ethanol. </li><li> Na het volledige gerecht is onderzocht, herhaalt u de procedure, vanaf de zachte schudden van de schotel / bekken. Herhaal de procedure ten minste drie maal of totdat er geen larven meer worden gevonden. </li><li> Tel het aantal larven. Correleren met de hoeveelheid spierweefsel getest en aanwezig larven per gram (lpg). </li><li> Als er te veel larven aanwezig zijn bij de vertering vloeistof naar de larvale aantal betrouwbaar te bepalen zijn, de terugkeer van de vloeistof met de larven van de maatcilinder, afspoelen met leidingwater uit een squeeze wassen fles, en laat larven naar de bodem. </li><li> Na 10 minuten sedimentatie, verminder de supernatant om een bepaald volume (bijvoorbeeld10 mL). Om de exacte volume te bepalen, breng het supernatant naar een nieuwe cilinder met een pipet. </li><li> Suspendeer larven homogeen in de vloeistof door krachtig schudden. Tijdens het schudden beweging, voeg 12 druppels van 20 ul larvale schorsing op een petrischaal. </li><li> Onderzoek elke druppel met een microscoop. Bepaal het aantal larven in 240 pi en verwijder de hoogste en laagste telling. Extrapoleren aantal larven tot het totale volume (bijvoorbeeld 10 ml) supernatant. Opmerking: De kwaliteit van de stereo-microscoop is van het grootste belang voor de identificatie van Trichinellalarven. </li><li> Wanneer de larven in een buis worden verzameld door een pipet, zorgvuldig te controleren dat de larven niet plakken op de pipet muur, maar worden overgebracht naar de buis. Opmerking: Positieve Trichinella bevindingen uit samengevoegde monsters moet terug van het zwembad worden herleid tot het karkas van herkomst. Hier moet de grootte van het zwembad geleidelijk worden verlaagd totdat de positieve karkas is identiteitceerd. De steekproefomvang kan worden verhoogd tijdens dit proces gevoeligheid te verhogen. Wanneer het onderzoek van een verzamelmonster een positieve of onzeker Hierdoor wordt een verdere 20 g monster van elk varken. De 20 g monsters van vijf varkens samengevoegd en onderzocht met behulp van de beschreven werkwijze. Aldus worden monsters van 20 groepen van vijf varkens onderzocht. Wanneer Trichinella in een samengevoegde monster wordt gedetecteerd van vijf varkens, zijn 20 g monsters van de afzonderlijke varkens in de groep en elk wordt afzonderlijk onderzocht totdat de positieve karkas van herkomst wordt gedetecteerd. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gottstein, B., Pozio, E., Nöckler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+Diagnosis%2C+Treatment%2C+and+Control+of+Trichinellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, Diagnosis, Treatment, and Control of Trichinellosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 22, 127-145 (2009).</li>
<li>Pozio, E., Murrell, D. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17134656">Systematics and epidemiology of Trichinella.</a> Adv. Parasitol. 63, 367-439 (2006).</li>
<li>OIE World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. OIE Terrestrial Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://wahis2-devt.oie.int/fileadmin/Home/fr/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf">http://wahis2-devt.oie.int/fileadmin/Home/fr/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf</a> 1-16 (2013).</li>
<li>European Commission. Commission Implementing Regulation (EU) 2015/1375 of 10 August 2015 laying down specific rules on official controls for Trichinella in meat. Off. J. EU. 212, Available from:
 <a target="_blank" href="http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=celex%3A32015R1375">http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=celex%3A32015R1375</a> 7-34 (2015).</li>
<li>United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service. 9 CFR Part 318.10 - Prescribed treatment of pork and products containing pork to destroy trichinae. U.S. Government Publishing Office. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2016-title9-vol2/pdf/CFR-2016-title9-vol2-sec318-10.pdf">https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2016-title9-vol2/pdf/CFR-2016-title9-vol2-sec318-10.pdf</a> (2012).</li>
<li>Gamble, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Commission+on+Trichinellosis%3A+recommendations+on+methods+for+the+control+of+Trichinella+in+domestic+and+wild+animals+intended+for+human+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">International Commission on Trichinellosis: recommendations on methods for the control of Trichinella in domestic and wild animals intended for human consumption.</a> Vet. Parasitol. 93 (3-4), 393-408 (2000).</li>
<li>Gajadhar, A. A., Forbes, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internationally+recognized+quality+assurance+system+for+diagnostic+parasitology+in+animal+health+and+food+safety%2C+with+example+data+on+trichinellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">An internationally recognized quality assurance system for diagnostic parasitology in animal health and food safety, with example data on trichinellosis.</a> Vet. Parasitol. 103, 133-140 (2002).</li>
<li>ISO. Microbiology of the food chain -- Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method 18743. ISO. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.iso.org/">http://www.iso.org/</a> (2015).</li>
<li>Nöckler, K., Kapel, C. M. O. Chapter 3, Detection and surveillance for Trichinella: meat inspection and hygiene, and legislation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%B6ckler%2C+K+%22FAO%2FWHO%2FOIE+Guidelines+for+the+surveillance%2C+management%2C+prevention+and+control+of+trichinellosis%22">FAO/WHO/OIE Guidelines for the surveillance, management, prevention and control of trichinellosis</a>. , World Organization for Animal Health (OIE). Paris. 69-98 (2007).</li>
<li>Boch, J., Schnieder, T., Supperer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoch%2C+J+%22Veterin%C3%A4rmedizinische+Parasitologie%22">Veterinärmedizinische Parasitologie</a>. , Parey Verlag. Stuttgart. 6. Aufl (2006).</li>
<li>Despommier, D. D., Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stichosome+and+its+secretion+granules+in+the+mature+muscle+larva+of+Trichinella+spiralis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The stichosome and its secretion granules in the mature muscle larva of Trichinella spiralis.</a> J. Parasitol. 62 (5), 775-785 (1976).</li>
<li>Marucci, G., Interisano, M., La Rosa, G., Pozio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+nematode+larvae+different+from+those+of+the+Trichinella+genus+detected+by+muscle+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of nematode larvae different from those of the Trichinella genus detected by muscle digestion.</a> Vet Parasitol. 194, 117-120 (2013).</li>
<li>Forbes, L. B., Gajadhar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+Trichinella+digestion+assay+and+an+associated+sampling+and+quality+assurance+system+for+use+in+testing+pork+and+horse+meat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A validated Trichinella digestion assay and an associated sampling and quality assurance system for use in testing pork and horse meat.</a> J. Food Prot. 62, 1308-1313 (1999).</li>
<li>Malakauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+Trichinella+spp.+in+three+Baltic+countries%3A+Lithuania%2C+Latvia%2C+and+Estonia%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of Trichinella spp. in three Baltic countries: Lithuania, Latvia, and Estonia.</a> Parasitol. Res. 100 (4), 687-693 (2007).</li>
<li>Kapel, C. M., Webster, P., Gamble, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+distribution+of+sylvatic+and+domestic+Trichinella+larvae+in+production+animals+and+wildlife%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Muscle distribution of sylvatic and domestic Trichinella larvae in production animals and wildlife.</a> Vet. Parasitol. 132 (1-2), 101-105 (2005).</li>
<li>Interisano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+latex+agglutination+test+for+the+detection+of+Trichinella+infections+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Validation of a latex agglutination test for the detection of Trichinella infections in pigs.</a> Vet. Parasitol. 194, 121-124 (2013).</li>
<li>Pozio, E., La Rosa,, G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-derived+methods+for+the+identification+of+Trichinella+parasites+from+animal+and+human+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">PCR-derived methods for the identification of Trichinella parasites from animal and human samples.</a> Methods Mol. Biol. 216, 299-309 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Hoewel de magneetroerder methode gemakkelijk kan worden uitgevoerd, niet strikt vast te houden aan technische details leidt tot onvoldoende gevoeligheid, waardoor de gezondheid van de consument in gevaar te brengen. De kritische controlepunten zijn gemarkeerd in de bovenstaande tekst. Bovendien, het gebruik van geschikte uitrusting is cruciaal voor het succes van de test. Alle vaten moet worden gemaakt van glas en pipetpunten bekleed met silicium hechting larven reduceren tot het oppervlak. De gevoeligheid van de digestiemethode afhankelijk van het larvale dichtheid in de spieren en de hoeveelheid spiermonster getest. Voor een larvale dichtheid van 3-5 lpg van spierweefsel, een gevoeligheid van 100% werd gerapporteerd, maar onder 1 gpl daalde de gevoeligheid tot 40% 13. Afhankelijk van de geteste soort gastheerdier, kan de gevoeligheid van de test worden verbeterd door de hoeveelheid van het gebruikte monster. de infection last in wilde dieren is meestal laag, dus grotere steekproeven maten worden gebruikt 14. Voorliefde sites ook variëren tussen gastheer dieren. Hier, hoe lager verteerbaarheid van bepaalde spieren zoals de tong rekening moet worden gehouden, die ook kan leiden tot grotere monsterhoeveelheden 15. Verder is het belangrijk te begrijpen dat de magnetische roerder methode geen controles bevat. Daarom, kwaliteitsborging beheer van de monsterneming tot de documentatie is essentieel voor accurate en nauwkeurige resultaten te verkrijgen. De kwaliteit van de prestaties van het laboratorium voor Trichinella larven in de spieren monsters op te sporen moeten worden gecontroleerd door regelmatige deelname van elke analist in ringonderzoeken. Verdere beperkingen van de methode zijn dat de definitieve identificatie fase van de spier larven door microscopie is zeer subjectief en heavily afhankelijk van de kennis van de larvale morfologie door de onderzoeksrechter analist. Een interessant alternatief methode om dit probleem te omzeilen is het magnetische roerder werkwijze / isolatie op filter gevolgd door larven detectie door een latex agglutinatietest. Echter, volgens de EU-wetgeving deze methode wordt alleen als gelijkwaardig beschouwd voor het testen van vlees van varkens, maar niet voor dieren die een hoger risico op infectie, zoals wilde zwijnen 4. De identificatie van de larvale antigeen monoklonale antilichamen maakt de test objectiever, maar ontkent het laboratorium de mogelijkheid van het bepalen van het aantal larven per gram vlees 16. Verdere variaties van de magneetroerder werkwijze omvatten de mechanisch bijgestaan ​​Verzameldigestiemethode methode / sedimentatie techniek, de mechanisch bijgestaan ​​samengevoegd monster digestion methode / isolatie op filter techniek, en de automatische verzameldigestiemethode voor monsters van maximaal 35 g techniek. Deze technieken zijn allemaal gebaseerd op het kunstmatige vertering van het vlees en de visualisatie en telling van Trichinellalarven, maar verschillen in de voor de filtratie en sedimentatie stappen materiaal. De geïsoleerde larven kan verder worden geïdentificeerd op het soort niveau door een moleculaire test (bijvoorbeeld multiplex PCR) 17. Volgens de EU-wetgeving, moeten alle positieve monsters worden naar het nationale referentielaboratorium of EURLP voor de Trichinellasoort vastberadenheid.

Nematoden van het geslacht Trichinella kan worden gedetecteerd in dwarsgestreepte spieren van carnivore en omnivore zoogdieren, vogels, reptielen en wereldwijd. Deze zoönotische aaltjes kunnen mensen bij het rauw of semi-rauw vlees en afgeleide producten te bereiken van varkens, paarden en wild worden ingenomen. Dit zoönose kan een ernstige ziekte bij de mens wordt gekenmerkt door pathognomonisch tekenen en symptomen, zoals diarree, koorts, periorbitaal oedeem en spierpijn en mogelijke complicaties, zoals myocarditis, trombo-embolische ziekte en encefalitis 1 zijn. Trichinella spiralis is de meest voorkomende etiologische agent van Trichinella infectie bij wilde en gedomesticeerde dieren en veroorzaakt de meeste van de menselijke besmettingen wereldwijd. In Europa, Noord- en West-Afrika en West-Azië, Trichinella britovi is een andere bron van de menselijke infecties. Daarnaast worden tien andere taxa minder wordt genoemd als oorzakelijke<html> middelen van de humane ziekte en zijn te vinden in verschillende gebieden van de wereld, meestal bij wilde dieren 2. Naast de wilde dieren zoals wilde zwijnen, beren, walrussen en dassen, varkensvlees is de belangrijkste bron van menselijke besmetting wereldwijd. De beste manier om trichinellose voorkomen is om geen eten van rauwe vleesproducten en geen vlees, vooral wild veilige temperaturen (koken&gt; 65 ° C gedurende 1 min, dat wil zeggen de kleur van het vlees van roze bruin veranderen in de kern van de vleesproduct) 3. De Europese Unie en USDA hebben invriezen en baktijden en temperaturen gespecificeerd voor varkensvlees producten die kunnen worden gebruikt om T. spiralis larven dood vlees 4, 5. Bovendien, aanbevelingen voor de inactivatie van Trichinella in vlees en vleesproducten werden op Trichinellose gepubliceerd door de Internationale Commissie&quot;xref&quot;&gt; 6. In Europa, naast de invoering van gecontroleerde huisvestingsomstandigheden in commerciële varkenskuddes waar het risico op Trichinella infectie verwaarloosbaar het voorkomen van menselijke trichinellose is gebaseerd op onderzoek van het laboratorium van monsters van gevoelige dieren 4. Voor voedselveiligheid doeleinden, spijsvertering assays zijn de enige betrouwbare procedures voor de directe detectie van Trichinella larven in vlees 3, 7. Zelfs als er meerdere variaties van de spijsvertering assay, de magneetroerder methode is de internationaal aanvaarde referentiemethode 3, 4, 7. Deze test is gebaseerd op de detectie van Trichinella larven in dwarsgestreept spierweefsel. Na de enzymatische vertering van het nemen van monsters en daaropvolgende filtratie en sedimentatie stappen, Trichinella larven worden geïdentificeerd met behulp van microscopie. Afhankelijk van de handelsverplichtingen en nationale wetgeving, zijn er een veelheid van kleine variaties in het algemeen protocol van de magneetroerder methode. Hier worden de technische gegevens op basis van de EU-eisen 4, ISO-specificaties 8, ICT richtlijnen 6, en de ervaring van de Europese Unie referentielaboratorium voor parasieten (EURLP) en de Duitse referentielaboratorium voor Trichinella.

<table><tbody><tr><td>Mes, schaar, pincet</td><td></td><td></td><td>Snijden van monsters en verwijderen van niet-verteerbaar weefsel</td></tr><tr><td>Blender&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Met een scherp hakmes</td></tr><tr><td>Magneetroerder</td><td></td><td></td><td>Met thermostatisch gestuurde verwarmingsplaat</td></tr><tr><td>Roerstaaf</td><td></td><td></td><td>Teflon-gecoat, ongeveer 5 cm lang</td></tr><tr><td>Konische scheidingsfles van glas</td><td></td><td></td><td>Inhoud van minimaal 2 L, bij voorkeur voorzien van Teflon-veiligheidspluggen. De breedte mag niet groter zijn dan 55% van de lengte om een goede larvesedimentaties mogelijk te maken.</td></tr><tr><td>Standaards, ringen en klemmen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeef</td><td></td><td></td><td>Maaswijdte 180 micron, buitendiameter 11 cm, met roestvrijstalen gaas</td></tr><tr><td>Trechter</td><td></td><td></td><td>Interne diameter niet minder dan 12&nbsp;cm, om de zeef te ondersteunen</td></tr><tr><td>Glazen maatbeker</td><td></td><td></td><td>Inhoud 3 L</td></tr><tr><td>Glazen meetcilinder</td><td></td><td></td><td>Inhoud 50 tot 100 mL, of centrifugeerbuisje</td></tr><tr><td>Stereo-microscoop</td><td></td><td></td><td>Met een onderliggende lichtbron van instelbare intensiteit of trichinoscoop met een horizontale tafel</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td></td><td></td><td>9 cm diameter, gemarkeerd op hun onderzijde in 10 &times; 10 mm vierkante onderzoeksgebieden met behulp van een puntig instrument of een larveteeltbak voor de tricinoscoop</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td>Alternatief een deksel om de bekers af te dekken</td></tr><tr><td>25% zoutzuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepsine</td><td></td><td></td><td>Sterkte: 1:10.000 NF (US National Formulary) overeenkomend met 1:12.500 BP (British Pharmacopoeia) en met 2.000 FIP (F&eacute;d&eacute;ration internationale de pharmacie), of gestabiliseerd vloeibaar pepsine met minimaal 660 Europese Farmacopee-eenheden/mL</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>70-90% ethylalcohol</td></tr><tr><td>Leidingwater</td><td></td><td></td><td>Verwarmd tot 46-48 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td></td><td></td><td>Accuraat tot ten minste 0,1 g</td></tr><tr><td>Metalen lade</td><td></td><td></td><td>Inhoud 10 tot 15 L, om de resterende spijsverteringssap op te vangen</td></tr><tr><td>Pipetten en pipethouders</td><td></td><td></td><td>Verschillende maten (1, 10 en 25 mL)</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>Accuraat tot 0,5 &deg;C, temperatuurbereik minimaal van 20 &deg; C tot 70&nbsp;&deg;C</td></tr><tr><td>Sifoonpomp</td><td></td><td></td><td>Voor leidingwater</td></tr></tbody></table>

magneetroerder werkwijze voor de detectie van<em&gt; trichinella</em&gt; larven in muscle samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellose is een slopende ziekte bij mensen en wordt veroorzaakt door de consumptie van rauw of onvoldoende verhit vlees van de dieren geïnfecteerd met de nematode larven van het geslacht Trichinella. De belangrijkste bronnen van humane infecties wereldwijd zijn vlees van wild en varkensvlees of varkensvlees producten. In veel landen is het voorkomen dat er trichinellose gebaseerd op de identificatie van geïnfecteerde dieren door de vertering van kunstmatige spieren monsters van relevante kadavers. Er zijn verschillende methoden die zijn gebaseerd op de digestie van vlees maar de magneetroerder werkwijze wordt beschouwd als de gouden standaard. Met deze methode kan de detectie van Trichinella larven door microscopie na de enzymatische afbraak van de monsters spieren en de daaropvolgende filtratie en sedimentatie stappen. Hoewel deze methode speciale en dure apparatuur vereist, kunnen de controles niet worden gebruikt. Daarom moeten strikte kwaliteitsmanagement worden applied gedurende de test. Het doel van dit werk is om gedetailleerde instructies hanteren en kritische controlepunten van de methode aan analisten, op basis van de ervaring van de Europese Unie referentielaboratorium voor parasieten en het Nationaal Referentielaboratorium van Duitsland op Trichinella te bieden.

<html> Na digestie kan de vorm van het infectieuze larven spier variëren, waardoor identificatie bemoeilijkt. Typische vormen omvatten strak opgerold larven, licht opgerold larven of c-vormige of volledig afgewikkeld larven (figuren 2B - 2C). Het aantal larven per gram kan aanzienlijk variëren en kan variëren van een larve tot enkele honderden larven. De morfologie van de spier infectieve larve wordt getoond in figuur 2A. Trichinellalarven zijn 0,7-1,5 mm lang en ongeveer 0,3 mm breed. De slokdarm is smal en heeft een iets afgeronde einde. De cuticula is glad. In de voorste helft van de lichaamsholte, de stichosome, een structuur opgebouwd uit een lange slanke buis omgeven door een rij 45-55 grote cellen (stichocytes), kan worden waargenomen. De endeldarm is ook afgerond zonder uitsteeksels of aanhangsels 10, 11. t &quot;&gt; Andere structuren, naast Trichinellalarven, kan worden na spier- digestie Enkele voorbeelden getoond in Figuren 3A -.. 3F wilde dieren worden vaak geïnfecteerd met andere parasieten of het nemen van monsters voor het testen verontreinigd gedurende het uithalen proces levende of levenloze structuren / organismen. de lengte van de larven, het uiterlijk van de voorste en achterste einden en het optreden van de stichosome helpen om onderscheid tussen verschillende nematode genera 12. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig1.jpg" /> Figuur 1: microscopisch onderzoek van Trichinellalarven After (A) Onvoldoende en (b) voldoende spoelen Steps. Schaalbalken geven 100 urn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om te zien een grotere ve</a>rsion van dit cijfer. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig2.jpg" /> Figuur 2: morfologie van Infectieuze Trichinellalarven Het tonen van de Rectum, Stichosome en de slokdarm van de larve (A). Mogelijke vormen van de spier larven na digestie weergegeven (B) strak opgerold en licht opgerold bewegende larven en (C) afgewikkeld larven. Schaalbalken geven 100 urn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig3.jpg" /> Figuur 3: Voorbeelden van Incidentele bevindingen na ontsluiting van Muscle Monsters met de magneetroerder Method. (A) varkenshaar-achtige haar vanaarde worm aangetroffen bij wilde zwijnen; (B) Alaria alata van wilde zwijnen; (C) spiervezels van wilde zwijnen; (D) metastrongylus sp. van wilde zwijnen; (E) plantaardige vezels gevonden in wilde zwijnen (F): Toxocara sp. larve van wilde zwijnen. Schaalbalken geven 100 urn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Het voorkomen van menselijke trichinellose in veel landen is gebaseerd op onderzoek van het laboratorium van monsters van gevoelige dieren door werkwijzen van de spijsvertering, waarvan de magnetische roerder methode wordt de gouden standaard.

Magneetroerder werkwijze voor de detectie van<em&gt; Trichinella</em&gt; Larven in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Het algemene doel van deze diagnostische methode is het identificeren van vlees, of vleesproducten, die zijn geïnfecteerd met de voedselgerelateerde zoönotische parasiet Trichinella. Deze methode is de gouden standaard voor de directe detectie van Trichinella-larven in vlees. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat deze eenvoudig uit te voeren is en geen gespecialiseerde apparatuur vereist.Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, aangezien interne controles niet kunnen worden gebruikt en er gedurende de gehele test een strikt kwaliteitsbeheer moet worden toegepast. De procedure zal worden gedemonstreerd door Nora Thaben, een technicus uit mijn laboratorium.Hallo! Om een spiermonster voorbij te bereiden voor digestie, plaatst u 100 gram van het monster in een blender of maler.Voeg twee milliliters voorverwarmd water toe om het mengen te vergemakkelijken. Meng op maximale snelheid gedurende twee tot drie seconden. Open vóór het tweede mengproces de blender en verplaats elk spierstuk dat zich aan de bovenrand van de mengbeker bevindt naar de bodem.Herhaal het mengen en blijf mengen in pulsen van twee tot drie seconden totdat er geen zichtbare stukjes vlees meer overblijven. Bereid vóór het starten van deze procedure de digestievloeistof voor in een bekerglas van drie liter, zoals beschreven in het tekstprotocol. Overbreng één liter van de voorverwarmde digestievloeistof naar een kolf.Breng het gemalen vlees over inHet bekerglas. Gebruik een lepel of een vork om het vlees te verspreiden in de digestievloeistof. Spoel de mengbeker, het deksel, de messen en de vork grondig af met de resterende digestievloeistof.Plaats het bekerglas op een warmteplaat om een constante temperatuur van 44 tot 46 graden Celsius te handhaven, terwijl u dit met een thermometer monitort. Dek het bekerglas vervolgens af met aluminiumfolie. Roer het digestievloeistof gedurende 30 minuten om een diepe vortex te creëren zonder spatten, totdat de vleesdeeltjes zijn verdwenen.Na digestie van het spiercelmonster moet het digestievloeistof worden gefilterd en de hoeveelheid onverteerd weefsel worden bepaald. Stel de weegschaal in op nul, weeg een schone zeef van 180 micrometer en noteer het gewicht. Controleer of de scheitrechter verticaal is uitgelijnd.Om een goede sedimentatie van de larven mogelijk te maken, mag de breedte van de glazen scheidingstrechter niet groter zijn dan 55% van de lengte ervan. Giet het digestievloeistof voorzichtig door de zeef in de glazen scheidingstrechter, waarbij overloop wordt voorkomen. Om verlies van gevoeligheid te voorkomen, dient het glazen bekerglas en de zeef grondig te worden gespoeld met ongeveer 200 milliliters kraanwater.En breng het spoelwater over naar de scheidtrechter. Til de zeef op en spoel het gebied onder de zeef grondig schoon met een knijpfles. Het spoelwater moet eveneens worden opgevangen in een scheidtrechter.Laat de zeef gedurende de gehele sedimentatieprocedure op de scheitrechter staan om te drogen. Om de sedimentatieprocedure te starten, laat u het gefilterde digestievloeistof 30 minuten in een scheitrechter staan, zodat de Trichinella-larven naar de bodem van de trechter kunnen bezinken. Zodra de sedimentatie is voltooid, opent u de stopkraan van de scheitrechter volledig om ten minste 20 milliliters van de digestievloeistof snel in een maatkolf te laten uitlopen.Draai vervolgens de stopkraan volledig in de tegenovergestelde richting om 10 milliliters digestievloeistof door te laten. Open ten slotte de stopkraan in de tegenovergestelde richting zodat er nog eens 10 milliliters in de maatkolf stroomt. Laat de 40 milliliters digestievloeistof 10 minuten in de cilinder staan zodat de larven kunnen bezinken.Bepaal vervolgens de hoeveelheid onverteerd weefsel. Til de zeef uit de sedimentatietrechter en droog de zeef af met een papieren handdoek. Trek het gewicht van de zeef vóór filtratie af van het gewicht van de zeef met het onverteerde weefsel.Het digestieproces wordt als bevredigend beschouwd als er niet meer dan 5% van het oorspronkelijke monstergewicht op de zeef achterblijft. Als de hoeveelheid onverteerd weefsel 5% overschrijdt, dient de digestie te worden herhaald met verse spiermonsters. Indien er geen verse monsters beschikbaar zijn, dient het resterende materiaal opnieuw te worden gedigesteerd.Nadat de digestievloeistof 10 minuten in de cilinder heeft gestaan, worden 30 milliliter supernatant verwijderd door middel van aspiratie met een pipet, zonder het sediment van 10 milliliter te verstoren. Om de hoeveelheid weefselvezels in het monster te verminderen, worden 30 milliliter kraanwater aan het sediment toegevoegd en dit nog eens 10 minuten te laten staan. Herhaal dit wasproces totdat de vloeistof helder is.Zodra de vloeistof helder is, verwijdert u het supernatant en brengt u de 10 milliliters gewassen sediment over naar een geprofileerde Petrischaal. Spoel de cilinder met 10 milliliters kraanwater en voeg dit water toe aan het gewassen sediment. Onderzoek de monsters direct na de wasstappen met een trichinoscoop of een stereomicroscoop, voorzien van een transmiseielichtbron onder de objecttafel met instelbare intensiteit.Onderzoek de Petrischaal systematisch, raster voor raster, bij een vergroting van 15 tot 20x. Als er geen verdachte structuren worden gevonden, beweeg dan de vloeistof in de schaal voorzichtig in een cirkelvormige beweging om eventuele over het hoofd geziene Trichinella-larven in het midden van de schaal te laten accumuleren. Herhaal het onderzoek.Als er een verdachte structuur wordt gevonden, verhoog dan de vergroting naar 40 tot 100x. Verwijder de Trichinella-larven uit de schaal met een pipet en verzamel deze in een vat. Nadat de gehele schaal is onderzocht, wordt de microscopische examineerprocedure herhaald, beginnend bij het voorzichtig schudden van de schaal.Herhaal de procedure minimaal drie keer, of totdat er geen larven meer worden gevonden. Bepaal het aantal larven per gram spierweefsel.Als er te veel larven in het digestievloeistof aanwezig zijn om het aantal larven betrouwbaar te bepalen, breng de vloeistof met de larven dan terug naar de maatkoker. Spoel de schaal af met kraanwater uit een knijpfles en laat de larven naar de bodem zinken. Na een sedimentatietijd van 10 minuten wordt het volume van de digestievloeistof gereduceerd tot een gedefinieerde hoeveelheid door de larven vanuit de bodem van de maatkoker in stappen van één milliliter over te brengen naar een nieuwe koker.Suspendeer de larven homogeen in de 10 milliliters door krachtig te schudden. Pipetteer tijdens het schudden 12 druppels van 20 microliters van de larvensuspensie op een Petrischaal. Onderzoek elke druppel van 20 microliters via microscopie en bereken het totale aantal larven zoals beschreven in het tekstprotocol.Vóór het microscopisch onderzoek van Trichinella-larven is het belangrijk om elk monster voldoende te wassen om resten te verwijderen die de identificatie van de larven kunnen belemmeren. Trichinella-larven zijn 0,7 tot 1,5 millimeter lang en ongeveer 0,3 millimeter breed. De slokdarm is nauw met een licht afgerond uiteinde.Het stichosoom is een structuur in de voorste helft van de lichaamsholte, bestaande uit een lange slanke buis omringd door een rij van 45 tot 55 grote cellen. De rectum is eveneens afgerond zonder uitsteeksels of aanhangsels. Na de digestie kan de vorm van de infectieuze spierlarven variëren, wat de identificatie bemoeilijkt.Typische vormen omvatten strak opgerolde en licht opgerolde bewegende larven, C-vormige larven of volledig uitgerolde larven. Na spijsvertering van het spierweefsel kunnen andere structuren dan Trichinella-larven worden aangetroffen. Voorbeelden van incidentele vondsten bij wilde zwijnen zijn een borstelachtig haartje van een regenworm, de trematode Alaria alata, een spiervezel, een nematode uit het geslacht Metastrongylus, plantenvezels en larven van de rondworm Toxocara.Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer twee uur worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe Trichinella-larven in vlees kunnen worden gedetecteerd met de magnetische roermethode, rekening houdend met de belangrijkste kritische beheerspunten.

magnetic-stirrer-method-for-detection-trichinella-larvae-muscle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een protocol om trichothecenen (mycotoxinen van zorg voor de gezondheid van de mens) met behulp van een nieuw ontwikkelde screening methode gebaseerd op een competitief immunochemische methode en een laatste elektrochemische detectie te detecteren is aangetoond.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection

Trichuris Muris-infectie is een intestinale model van de Th2-immuniteit, waar resistente muizen genereren van een beschermende Th2 respons en vatbaar zijn muizen het genereren van een pathologische Th1 respons.

Trichuris Muris Infectie: Een model van type 2 immuniteit en ontsteking in de darm

De analyse van skeletspierweefsels om structurele, functionele en biochemische eigenschappen te bepalen, wordt enorm gefaciliteerd door een geschikte voorbereiding. Dit protocol beschrijft geschikte methoden om skeletspierweefsel voor te bereiden voor een breed scala aan fenotyperingsstudies.

Tissue Triage en Invriezen Modellen van Skeletal Muscle Disease

De werkzaamheid van intramusculaire opname en retrograad transport van moleculen naar corresponderende motorische neuronen hangt af van de locatie van de injectieplaatsen ten opzichte van de motorische eindplaten (MEP's). Hier beschrijven we hoe je MEP's op skeletspieren kunt lokaliseren om het retrograad transport van tracers naar motorische neuronen te optimaliseren.

Intramusculaire injecties Langs de Motor End Plates: een minimaal invasieve benadering van Shuttle Tracers Rechtstreeks in Motor Neuronen

Studies van neuronale morfogenese met behulp van Drosophila larvale dendritische arborization (bis) neuronen profiteren van in situ visualisatie van neuronale en epidermale eiwitten door immunofluorescentie. We beschrijven een werkwijze die immunofluorescentie analyse van da neuronen en omliggende epidermale cellen verbetert door het verwijderen spierweefsel van de larvale lichaamswand.

Verwijdering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Spier Weefsel van Larvale Filets voor Immunofluorescentie Analyse van sensorische neuronen en opperhuidcellen

Actieve autofagie is geassocieerd met productieve spierregeneratie, die essentieel is voor het activeren van spierstamcellen (MuSC). Hier bieden we een protocol voor de in situ detectie van LC3, een autofagie marker in MyoD-positieve MuSCs van spierweefsel secties van controle en gewonde muizen.

In situ Immunofluorescente Staining of Autophagy in Spier Stamcellen

De nauwkeurige identificatie van satelliet cellen is essentieel voor de studie van hun functies onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit artikel presenteert een protocol ter identificatie van de satelliet cellen op volwassen skeletspieren secties door immunofluorescentie gebaseerde kleuring.

Identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met Pax7 en Laminin antilichamen

Hier beschreven is een protocol voor directe immuunetikettering van necrotische myovezels in spier cryosecties. Necrotische cellen zijn permeabel voor serum proteïnen, waaronder immunoglobuline G (IgG). Het onthullen van de opname van IgG door myofibers maakt het mogelijk de identificatie en kwantificering van myovezels die necrose ondergaan ongeacht spieraandoening.

Immunolabeling Myofiber degeneratie in spier biopsies

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.

Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte

Dit protocol heeft tot doel interstitiële extracellulaire blaasjes (SkM-EV's) van skeletspieren te isoleren en te zuiveren uit spierweefsel van knaagdieren door middel van mechanische onthechting, enzymatische dissociatie, filtratie en differentiële ultracentrifugatie. Het toont consistentie en betrouwbaarheid. De geïsoleerde SkM-EV's geven inzicht in spierhomeostase en -ziekten, met mogelijke toepassingen als diagnostische biomarkers of therapeutische voertuigen.

Enzymatische isolatie van interstitiële extracellulaire blaasjes van skeletspieren

Leer de magneetroerder methode voor het detecteren van Trichinella-larven in spierweefstalen. Deze gouden standaardtechniek vereist geen gespecialiseerde apparatuur maar vraagt wel strikte kwaliteitsbeheersing voor betrouwbare resultaten.

Magneetroerder werkwijze voor de detectie van

Meer video's verkennen