Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Het algemene doel van deze microchirurgische techniek is om colorectale tumorcellen in de cecale wand te injecteren om reproduceerbare en metastaserende colorectale tumoren bij muizen te induceren. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden op het gebied van circulatie van tumorcellen, de belangrijkste voordelen zijn de zeer reproduceerbare en uniforme tumoren, waardoor betrouwbare stadiumvoorspelling en voorspelling van circulerende tumorcellen mogelijk is. Begin door een atraumatische pincet te gebruiken om voorzichtig het cecum van een zes tot acht weken oude immuungecompromitteerde muis te buiten te brengen.

Plaats het blinde uiteinde van het cecum op de buik zodat de zak craniaal wijst. Voor de intra-cecale injectie, monteer een standaard ene milliliter spuit uitgerust met een 30 gauge canella en laad deze met de tumorcellen op een micro injectiepomp die is gemonteerd op een micro manipulator. Gebruik vervolgens de atraumatische pincet om voorzichtig de punt van het cecum vast te pakken en gebruik een tweede pincet, bevochtigd met warme zoutoplossing om het cecum voorzichtig glad te strijken met neerwaartse bewegingen.

Verplaats nu het dier onder een binoculaire chirurgische microscoop en met de canella direct parallel aan en boven het cecum, gebruik twee atraumatische pincetten om voorzichtig het weefsel aan beide uiteinden van het buitengebrachte uiteinde van het cecum te strekken. Trek langzaam het cecum over de canella, zorg ervoor dat u niet het hele bandje van de wand of de serosa voorbij het initiële penetratiepunt doorboort en plaats de canella boven de bloedvaten en onder het dunne doorschijnende membraan binnen het bandje van de wand. Wanneer de canella op zijn plaats is, gebruik een voetschakelaar om 20 microliter cellen te injecteren gedurende een periode van 20 seconden.

Tussen de dunne doorschijnende serosa voering, boven de intramural bloedvaten en de muscularis. Wanneer alle cellen zijn geïnjecteerd, verwijdert u voorzichtig de canella en plaatst u een droge swap onder het cecum. Om kunstmatige peritoneale verspreiding te voorkomen, lyseert u eventueel gelekte cellen met een grondige gedistilleerd water spoeling en plaatst u het cecum voorzichtig terug in de buikholte.

Sluit de buikwand met snel absorberende loopnaden, in de huid met chirurgische wondclips. Plaats vervolgens de muis op een verwarmingsmat ingesteld op 38 graden Celsius met monitoring tot volledige recumbentie. Om de circulerende tumorcellen te isoleren, vult u bij het juiste experimentele eindpunt 15 milliliter kegelvormige buizen met vijf milliliter dichtheidsgradiënt medium per buis en brengt u zorgvuldig bloedmonsters die zijn verzameld van tumordragende dieren over naar de dichtheidsgradiëntlagen.

Scheid de cellen door centrifugatie en herstel voorzichtig het interface dat de mononucleaire cellen bevat. Pipetteer de mononucleaire cellen in een nieuwe 15 milliliter buis voor een tweede centrifugatie. Gevolgd door buis wasbeurten in PBS.

Na de tweede wassing, resuspendeer de pellets in 200 microliter PBS, aangevuld met EDTA en voeg vier microliter anti amp camp antilichaam toe aan elk monster, voor 20 minuten incubatie op ijs in het donker. Gebruik vervolgens een hydrofobe barrière pen om een cirkel van ongeveer één centimeter te tekenen in een steriele zes centimeter petrischaal per monster en voeg 700 microliter picking buffer toe aan elke cirkel, gevolgd door 50 microliter celsuspensie. Gebruik een microscoop om de dichtheid van de cellen te controleren en laat de monsters ongeveer vijf minuten bezinken.

Screen vervolgens de druppel cellen op amp camp positiviteit en gebruik de micromanipulator om de cellen van belang over te brengen in 15 microliter van de geschikte buffer voor de beoogde volgende downstream analyse. Het gebruik van colorectale cellen in dit model resulteert betrouwbaar in meer overvloedige muizen binnen 35 dagen na injectie van tumorcellen, met de primaire tumoren die ongeveer 10 millimeter in grootte zijn, en met lever- en longmetastasen, en circulerende tumorcellen, bijna altijd aanwezig. Verder kunnen de circulerende tumorcellen gemakkelijk worden geïsoleerd voor downstream analyse.

Eenmaal beheerst en als het goed wordt uitgevoerd, kan deze techniek binnen 10 minuten worden uitgevoerd, wat de vorming van uniforme en metastaserende tumoren vergemakkelijkt die zowel voor therapeutische als moleculaire studies kunnen worden gebruikt. Beperkingen van het model omvatten, de afhankelijkheid van cellyse, die hun eigen beperkingen hebben, evenals de immunodeficiëntie van de muizen, beide kunnen worden overwonnen door het gebruik van mutante colorectale kankercellen. Vanwege zijn eenvoud kan dit model een waardevol aanvulling zijn op de momenteel beschikbare modellen van colorectale kanker.