Name: Imaging Neuronen binnen Dik Brain af met de Golgi-Cox Method (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Leer de Golgi-Cox methode voor visualisatie van neuronen met lange dendrietbomen in dikke hersensneden van knaagdieren. Dit protocol omvat cresylviolet tegenkleuring en cryobescherming voor langetermijnopslag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een Discovery Grant CDCB van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC), een John R. Evans Leaders Fund onderzoeksinfrastructuur subsidie ​​aan CDCB uit Canada Stichting voor Innovatie (CFI projectnummer 30381), en door een Discovery Grant NJM van NSERC. ELL werd ondersteund door een Ontario Graduate Scholarship en door een OVC Scholarship van de Ontario Veterinary College van de Universiteit van Guelph. CDS werd ondersteund door een Undergraduate Student Research assistentschap van NSERC. ALM werd ondersteund door een Alexander Graham Bell Scholarship uit NSERC en door een OVC Scholarship van de Ontario Veterinary College van de Universiteit van Guelph.

Volwassen vrouwelijke CD1-stam muizen werden gebruikt in deze studie. Vergelijkbare kleuring kan worden bereikt met behulp van beide geslachten op verschillende leeftijden. Proefdieren werden verzorgd volgens de principes en richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care, en de experimentele protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Guelph Animal Care Committee. 1. Golgi-Cox kleuring <ol><li> Golgi-Cox Impregneren van Brains <ol><li> Maak het Golgi-Cox oplossing van 1% (w / v) kaliumdichromaat, 0,8% (w / v) kalium- chromaat en 1% (w / v) kwikchloride door oplossing van kaliumdichromaat en kalium- chromaat in hoogwaardige water afzonderlijk . Meng de oplossingen, voeg het kwikchloride en filtreer de eindoplossing behulp graad 1 filtreerpapier. Bewaar de oplossing in het donker voor maximaal een maand. </li><li> Verdoven van de muis met behulp van 5% isofluraan. </li><li> Euthanaseren de muis door onthoofding en snel de hersenen te verwijderen. </li><li> Plaats de hersenen in een 20 ml glazen scintillatieflesje met 17 ml Golgi-Cox-oplossing en incubeer in het donker bij kamertemperatuur 25 d. </li><li> Cryoprotect de hersenen door deze in een 50 ml conische buis met 40 ml sucrose cryoprotectant (30% (w / v) sucrose in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4) in het donker bij 4 ° C gedurende 24 uur. OPMERKING: De volgende optionele drie stappen kunnen worden toegepast als alternatief voor de belangrijkste protocol om de hersenenvorst in dit stadium voor langetermijnopslag. </li><li> Bevries de volledige hersenen door onderdompeling in isopentaan 200 ml die is voorgekoeld op droogijs. </li><li> De bevroren hersenen in een 50 ml conische buis en bewaar in het donker bij -80 ° C. </li><li> Wanneer zover om ontdooien de hersenen door deze in een 50 ml conische buis met 40 ml sucrose koude beschermend middel in het donker bij 4 ° C gedurende 24 uur. </li></ol></li><li> Brain-Sectie <ol><li> Verwijder het brein van sucrose en block het voor snijden door het afsnijden van het cerebellum met behulp van een scheermesje en laten een vlakke rand op het resterende caudale einde van de hersenen. </li><li> Warmte agar (3% (w / v) in water) totdat het gesmolten is en laat afkoelen tot het iets boven het smeltpunt. </li><li> Plaats de hersenen in een kleine wegwerp weeg schaal met staarteinde face-down en voeg een voldoende hoeveelheid gesmolten agar naar de hersenen te dekken. </li><li> Zodra de agar gestold trimmen overtollige agar laat ongeveer 2-4 mm rond de hersenen en lijm de hersenen om het stadium van een vibratome met zijn staarteinde verdekt met een kleine hoeveelheid ethyl cyanoacrylaat lijm. </li><li> Vul het podium van de vibratome met een voldoende hoeveelheid sucrose cryoprotectant naar de hersenen en deel de hersenen bedekken met een plakdikte van 400-500 urn (afhankelijk van de hersenen te onderzoeken gebied) met een trillingsfrequentie van 86 Hz en een blad voortbewegingssnelheid van 0,125 mm / s. </li><li> Met behulp van een kleine kwast, Plaats hersensecties in een putje van een 6-well weefselkweekplaat met commercieel verkrijgbare mesh-inserts en onder vooraf gevuld met 10 ml 6% (w / v) sucrose in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4. </li><li> Incuberen van plakjes in het donker bij 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Ontwikkelende hersenen Secties <ol><li> Met de mesh-inserts bodem, transfer hersensecties in een nieuw putje dat 5 ml 2% (w / v) paraformaldehyde (PBD) in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4. Incubeer op een rocker beweegt met lage snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. </li><li> Wassen secties tweemaal door ze naar nieuwe putjes met 5 ml water. Was op een rocker beweegt met een gematigde snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Overdracht delen in een nieuwe put met 5 ml 2,7% (v / v) ammoniumhydroxide. Incubeer op een rocker beweegt met een lage snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. </li><li> Wassen secties tweemaal door ze naar nieuwe putjes met 5 ml water. Was ona rocker beweegt met een gematigde snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Overdracht secties in een nieuw putje dat 5 ml Fixatief A (zie tabel Materials) dat in water 10x verdund is van de oorspronkelijke concentratie gekocht. Incubeer op een rocker beweegt met een lage snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten. </li><li> Wassen secties tweemaal door ze naar nieuwe putjes met 5 ml water. Was op een rocker beweegt met een gematigde snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li></ol></li><li> Montage Brain secties <ol><li> Met behulp van een kleine kwast, zet de secties op microscoopglaasjes. Overtollig water en agar met een pincet en een kleine weefsel. Zorg ervoor dat alle agar alvorens verder te gaan met uitdroging wordt verwijderd. </li><li> Toestaan ​​secties aan de lucht drogen bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 45 minuten (400 urn secties) of 90 min (500 um secties). OPMERKING: De timing en de juiste droogniveau is kritisch en moet worden bepaald in elklaboratorium afhankelijk van de omgevingstemperatuur en luchtvochtigheid. Een te korte droogtijd leidt tot secties vallen van dia&#39;s tijdens de daaropvolgende dehydratatie stappen, en te lange droogtijd leidt tot secties kraken. Secties zullen nog steeds weergegeven glanzend te zijn op het juiste niveau van droogte. </li><li> Vlek secties met cresyl violet door het plaatsen van dia&#39;s in Coplin kleurbakjes zoals aangegeven. OPMERKING: Deze optionele stap kan worden gebruikt voor de delen die nog nooit was bevroren, met het oog op neuronale kernen met cresyl violet vlekken. We hebben ontdekt dat clearing en rehydrating delen voordat incubatie in cresylviolet leidt tot nog vlekken en lage achtergrond overkant secties. <ol><li> Plaatsen klaringsmiddel gedurende 5 minuten. Herhaal dit een keer. </li><li> Plaats in 100% ethanol gedurende 5 minuten. Herhaal dit een keer. </li><li> Plaats in 95% ethanol in water, daarna 75% ethanol in water en daarna 50% ethanol in water gedurende 2 min elk. </li><li> Leg ze in water gedurende 5 minuten. </li><li> Plaatsen 0,5% (w / v) CREsyl violet in water gedurende 7 minuten. </li><li> Plaats in water gedurende 2 min. Herhaal dit een keer. </li></ol></li><li> Uitdrogen delen door het plaatsen van dia&#39;s in Coplin kleurbakjes zoals aangegeven. <ol><li> Plaats in 50% ethanol in water, daarna 75% ethanol in water en daarna 95% ethanol in water gedurende 2 min elk. </li><li> Plaats in 100% ethanol gedurende 5 minuten. Herhaal dit een keer. </li><li> Plaatsen klaringsmiddel gedurende 5 minuten. Herhaal dit een keer. LET OP: Deze uitdroging en clearing tijden voldoende zijn om muizenhersenen te verwerken zoals beschreven in dit manuscript. We hebben echter ook bij andere species met inbegrip van ratten en cowbird, dat de laatste stap clearing moet mogelijk worden verlengd tot 15 minuten totaal. </li></ol></li><li> Dekglaasje gebieden af ​​met watervrij fixeermiddel. </li><li> Toestaan ​​slides horizontaal drogen in het donker bij kamertemperatuur gedurende ten minste 5 d. </li></ol></li></ol> 2. Imaging Stained neuronen in Dik Brain secties <ol><li> Het vastleggen van Afbeeldingenstapels </strong&gt; <ol><li> Schakel de microscoop lamp, camera, en het podium controller. </li><li> Open de microscoop software (bijv Neurolucida). </li><li> Plaats een dia op de microscoop podium. </li><li> Leg een 2D-beeld van de hersenpreparaat grote kijkhoek met een lage objectiefvergroting zoals 1,25x 0,4 NA PlanApo of 4X 0,16 NA <ol><li> Focus beeld en instellingen, inclusief de belichtingstijd en de witbalans. </li><li> Maak een referentiepunt door met de linkermuisknop te klikken ergens op de afdeling </li><li> Leg het beeld door te kiezen voor &quot;enkel beeld te verwerven&quot; in het venster beeldacquisitie. </li></ol></li><li> Leg afbeeldingsstapels van het gebied met de neuronen (s) plaats halverwege resolutie met behulp van een 10x NA 0,3 uPlan FL N doelstelling. <ol><li> Focus het beeld en de camera-instellingen zoals de belichting en witbalans aan te passen. </li><li> Stel de boven- en ondergrenzen voor de afbeeldingsstapel door zich tot de bovenkant van de sectie eennd u &quot;set&quot; naast &quot;boven stapelen&quot; in de beeldacquisitie venster en gericht naar de bodem van de sectie en de &quot;set&quot; naast &quot;onderaan stack&quot; binnen het venster beeldacquisitie selecteren. </li><li> Stel de stapafstand tot 5 urn door &quot;5 micrometer&quot; naast &quot;afstand tussen beelden&quot; in het venster beeldacquisitie. </li><li> Leg het beeld stack door &quot;image acquire stack&quot; in het venster beeldacquisitie. </li><li> Herhaal de bovenstaande stappen om het gehele gebied van belang te vangen, om ervoor te zorgen dat alle afbeeldingsstapels breedte van ten minste 10% in de X- en Y-assen. </li></ol></li><li> Leg afbeeldingsstapels van het gebied met het neuron plaats hoge resolutie, onder toepassing van een 30X 1,05 NA siliconenolie-immersie objectief. <ol><li> Toepassing 3-4 druppels silicone immersieolie de slede en plaats het objectief op de slede, zodat het contact tussen het objectief en oi makenl. </li><li> Focus het beeld en de camera-instellingen zoals de belichting en witbalans aan te passen. </li><li> Stel de boven- en ondergrenzen voor de afbeeldingsstapel door zich tot de bovenkant van de sectie en de &quot;set&quot; selecteren naast &quot;bovenste stapel&quot; in het venster beeldacquisitie en vervolgens gericht naar de bodem van de sectie en het selecteren van &quot;set&quot; naast de &quot;onderkant van de stapel&quot; in het venster beeldacquisitie. </li><li> Stel de stapafstand tot 1 urn door &quot;1 micrometer&quot; naast &quot;afstand tussen beelden&quot; in het venster beeldacquisitie. </li><li> Leg het beeld stack door &quot;image acquire stack&quot; in het venster beeldacquisitie. </li><li> Herhaal de bovenstaande stappen om het gehele gebied van belang te vangen, om ervoor te zorgen dat alle afbeeldingsstapels breedte van ten minste 10% in de X- en Y-assen. </li></ol></li><li> Sla het bestand en bewaar alle beeldbestanden in TIFF-formaat voor externe verwerking. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Het maken van Z-projectie Beelden en Afbeelding Montages <ol><li> Maak Z-projectie beelden in ImageJ <ol><li> Open ImageJ software die de Bio-Formats plugin heeft geïnstalleerd. </li><li> Selecteer &quot;Plugins&quot; -&gt; &quot;Bio-Formats&quot; -&gt; &quot;Bio-Formats Importer&quot;. </li><li> Selecteer het beeld stack-bestand te openen. </li><li> Zodra het bestand wordt geopend, verander het formaat in RGB door &quot;Beeld&quot; -&gt; &quot;Type&quot; -&gt; &quot;RGB kleur&quot;. </li><li> Maak de Z-projectie door &quot;Beeld&quot; te selecteren -&gt; &quot;Stacks&quot; -&gt; &quot;Z Project ...&quot;. </li><li> Sla tweedimensionaal beeld Z-projectie als een TIFF-bestand. </li></ol></li><li> Maak een tweedimensionaal beeld montage van het gehele gebied van belang. <ol><li> Open de software (bijvoorbeeld Adobe Photoshop). </li><li> Selecteer &quot;File&quot; -&gt; &quot;Automatiseren&quot; -&gt; &quot;Photomerge&quot;. </li><li> Selecteer &quot;Bladeren&quot; en voeg dan alle images bestanden die moeten worden samengevoegd. </li><li> Zorg dat &quot;Blend Images Together&quot; is geselecteerd en selecteer vervolgens &quot;OK&quot;. </li><li> Sla de resulterende montage beeld van het gehele gebied van belang als een TIFF-bestand. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Golgi, C. <a target="_blank" href="http://ppp.unipv.it/camillogolgi/pdf/Sullasostanza%20grigia.pdf">Sulla struttura della sostanza grigia del cervello.</a> Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).</li>
<li>Cox, W. H. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF02954290">Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen.</a> Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).</li>
<li>Zaqout, S., Kaindl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi-Cox+Staining+Step+by+Step%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Golgi-Cox Staining Step by Step.</a> Front Neuroanat. 10, 38(2016).</li>
<li>Levine, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+thin+tissue+Golgi-Cox+impregnation%3A+fast%2C+reliable+methods+for+multi-assay+analyses+in+rodent+and+non-human+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain.</a> J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).</li>
<li>Ranjan, A., Mallick, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+method+for+consistent+and+reliable+Golgi-Cox+staining+in+significantly+reduced+time%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time.</a> Front Neurosci. 1, 157(2010).</li>
<li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).</li>
<li>Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Golgi+staining+protocol+for+use+in+the+human+brain+stem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).</li>
<li>Narayanan, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appraisal+of+the+effect+of+brain+impregnation+duration+on+neuronal+staining+and+morphology+in+a+modified+Golgi-Cox+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method.</a> J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).</li>
<li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23681640">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li>
<li>Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippocampus+makes+a+significant+contribution+to+experience-dependent+neocortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity.</a> Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).</li>
<li>Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+binge-like+alcohol+exposure+decreases+dendritic+complexity+while+increasing+the+density+of+mature+spines+in+mPFC+Layer+II%2FIII+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons.</a> Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).</li>
<li>Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressive-like+behaviours+and+decreased+dendritic+branching+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+mice+with+tumors%3A+A+novel+validated+model+of+cancer-induced+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression.</a> Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).</li>
<li>Frauenknecht, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+with+experimental+antiphospholipid+syndrome+display+hippocampal+dysfunction+and+a+reduction+of+dendritic+complexity+in+hippocampal+CA1+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).</li>
<li>Camacho-Abrego, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangement+of+the+dendritic+morphology+of+the+neurons+from+prefrontal+cortex+and+hippocampus+after+subthalamic+lesion+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats.</a> Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).</li>
<li>Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+changes+in+dendritic+structure+and+complexity+in+the+adult+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus.</a> Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).</li>
<li>Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+alpha5+subunits+drive+developmental+changes+in+the+activation+and+morphology+of+prefrontal+cortex+layer+VI+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons.</a> Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).</li>
<li>Lytton, W. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLytton%2C+WW+%22From+computer+to+brain+%3A+foundations+of+computational+neuroscience%22">From computer to brain : foundations of computational neuroscience</a>. , Springer. (2002).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd, Academic. (2001).</li>
<li>Ha, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Golgi-Cox+method+with+counterstain+for+the+study+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses.</a> Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).</li>
<li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+locus+coeruleus%3A+a+cytoarchitectonic%2C+Golgi+and+immunohistochemical+study+in+the+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat.</a> Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).</li>
<li>Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+combining+Golgi+and+Nissl+staining+to+study+neuronal+morphology+and+cytoarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture.</a> J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

We beschrijven hier een Golgi-Cox kleuringsprotocol met twee nuttige varianten voor het visualiseren van neuronen in hersenen dikke secties. Zoals getoond in de representatieve resultaten, het gebruik van een hoge-resolutie doelstelling met een lange werkafstand 800 pm heeft zorgt voor een betrouwbare weergave van gehele neuronen gehele diepte van hersensecties snijden bij 500 urn. Deze studie relatief dikke hersencoupes vermindert de waarschijnlijkheid dat gekleurde neuronen van elk type volledig binnen de slice, wat v...

De visualisatie van de individuele neuronen in weefselmonsters maakt het mogelijk om in situ analyse van neuron morfologische kenmerken, die aanzienlijk heeft geavanceerde ons begrip van de hersenen en hoe het kan worden beïnvloed door endogene ziekte of exogene omgevingsfactoren. Het Golgi-Cox kleuringsmethode een kosteneffectief, relatief eenvoudig middels kleuren van een steekproef van neuronen in de hersenen. Eerst ontwikkeld door Golgi 1 en gewijzigd door Cox 2 in de jaren 1800, hebben de onderzoekers verder verfijnd deze techniek door de jaren heen aan duidelijke, goed gekleurde neuronen die kunnen worden gebruikt om te visualiseren en te kwantificeren zowel dendritische boom morfologie en de wervelkolom dichtheid 3, 4 te produceren, 5, 6, 7, 8, 9. Een belangrijke technische overweging voor de visualisatie van gekleurde neuronen in hersenen secties de maximale plakdikte, die wordt begrensd door de werkafstand beschikbare sterke vergroting / microscoopobjectieven hoge resolutie. Gemeenschappelijke doelstellingen olie-immersie in de jaren 60 - 100X bereik te bieden uitstekende resolutie, maar worden beperkt door hun werkafstanden die zijn meestal niet groter dan 200 urn. Hersenplakjes gesneden op 200 um bereik kan voldoende zijn om bepaalde types neuron welke op deze plakdikte bijvoorbeeld piramidale neuronen in ondiepe lagen van de hersenschors 10, 11, 12, piramidale neuronen in het CA1-gebied van het visualiseren hippocampus 13, 14 en granule cellen in de dentate gyrus van de hippocampus 15. Neuronen met relatief langeredendritische bomen, zoals piramidale neuronen in diepe lagen van de hersenschors die voor muizen kan meer dan 800 urn uitstrekken vanaf het cellichaam 16, verschaffen een grotere uitdaging omdat hersenen zou moeten worden doorgesneden op een perfecte hoek met de gehele dendriet structuur bevatten minder dan 200 urn plakjes. Dit kan zelfs onmogelijk zijn als een dendriet of een van de vertakkingen zich uitstrekken in de rostrale en caudale richting. Hoewel het mogelijk is om deze beperking aan te pakken door het traceren van een neuron over meerdere aangrenzende hersenen secties, deze aanpak introduceert een belangrijke technische uitdaging bij de aanpassing van de delen nauwkeurig voor het traceren van 17. Een meer praktische benadering zou zijn gehele neuronen opgenomen in hersensecties die een grotere dikte worden gesneden visualiseren. Wij rapporteren hier een techniek om neuronen in 400 vlekken - 500 urn dikke hersenen secties van muizen met behulp van de Golgi-Cox methode, en hun mo visualiserenrphology behulp van een hoge-resolutie siliconenolie-immersie objectief dat een 800 pm werkafstand heeft. Het Golgi-Cox impregneren en verwerkingsprotocol we beschrijven is gemodificeerd van een van de meest geciteerde moderne protocollen in de literatuur 6. Onze aanpak dikke hersencoupes verschaft het voordeel van het verhogen van de waarschijnlijkheid van het identificeren neuronen van elke soort die volledig zijn vervat binnen de sectie. Naast de belangrijkste protocol, we ook twee varianten die unieke voordelen verschaffen: (1) Golgi-Cox kleuring met cresyl violet tegenkleuring op het oppervlak gemonteerde secties, teneinde grenzen van hersengebieden te definiëren en lagen van de identiteit cerebrale cortex, en (2) Golgi-Cox kleuring met een tussenproduct bevriezingsstap voor langetermijnopslag geïmpregneerd gehele hersenen vóór snijden en eindverwerking.

<table><tbody><tr><td>kaliumdichromaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>P188-100</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>kaliumchroomaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>P220-100</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>kwikchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25423</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>Whatman filterpapier graad 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>1001-185</td><td></td></tr><tr><td>isofluraan</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>20 mL scintillatieglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Bioshop Canada</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>natriumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5011-500G</td><td></td></tr><tr><td>natriumfosfaat dibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390-500G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische buis</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>isopentaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC126470010</td><td>Ook bekend als 2-methylbutaan; gevaarlijk</td></tr><tr><td>agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296-100G</td><td></td></tr><tr><td>kleine weegschaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>6-wells weefselkweekplaten</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1b</td><td></td></tr><tr><td>weefselkweekinserts met gaasbodem</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-214</td><td></td></tr><tr><td>paraformadelhyde (PFA), 16%</td><td>Electron Microscope Sciences</td><td>15710-S</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>ammoniumhydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>Kodak Fixatie A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7542</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus glazen plaatjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>CitroSolv clearing agent</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-143-975</td><td></td></tr><tr><td>anhydrisch ethylalcohol</td><td>Commercial Alcohols</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>cresylviolet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1791</td><td></td></tr><tr><td>permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>oprechte microscoop</td><td>Olympus</td><td>BX53 model</td><td></td></tr><tr><td>kleurencamera, 12 bit</td><td>MBF Biosciences</td><td>DV-47d</td><td>QImaging onderdeel 01-MBF-2000R-F-CLR-12</td></tr><tr><td>3D gemotoriseerde microscoopstandaard, controller en enoders</td><td>MBF Biosciences</td><td>N/A</td><td>Geleeverd en geïntegreerd met microscoop door MBF Biosciences</td></tr><tr><td>4X microscoopobjectief</td><td>Olympus</td><td>4x 0.16 N.A. UplanSApo</td><td></td></tr><tr><td>10X microscoopobjectief</td><td>Olympus</td><td>10x 0.3 N.A. UPlan FL N&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>30X microscoopobjectief</td><td>Olympus</td><td>30x 1.05 N.A. UPlanSApo&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60X microscoopobjectief</td><td>Olympus</td><td>60x 1.42 N.A. PlanAPO N</td><td></td></tr><tr><td>silicone dompelolie</td><td>Olympus</td><td>Z-81114</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida software</td><td>MBF Biosciences</td><td>Versie 10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>U. S. National Institutes of Health</td><td>Huidige versie</td><td>Met de OME Bio-Formats plugin geïnstalleerd</td></tr><tr><td>Photoshop software</td><td>Adobe</td><td>versie CS6</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging neuronen binnen dik brain af met de golgi-cox method

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

Het Golgi-Cox methode neuron kleuring is gebruikt voor meer dan tweehonderd jaar aan ons begrip van neuron morfologie te bevorderen binnen histologische hersenen monsters. Hoewel het de voorkeur verdient vanuit praktisch oogpunt hersenen secties de grootste dikte materialen te bereiden, teneinde de waarschijnlijkheid van het identificeren bevlekt neuronen die volledig zijn vervat binnen enkele secties verhogen, deze benadering beperkt technisch oogpunt de werkafstand van high -Vergroting microscoop doelstellingen. Wij rapporteren hier een protocol om neuronen te kleuren volgens de methode Golgi-Cox in muizenhersenen secties 500 pm dikte gesneden, en neuronen te visualiseren over de hoogte van die gebieden af ​​met een rechtopstaande microscoop uitgerust met een hoge-resolutie 30X 1,05 NA siliconen olie-immersie objectief dat een 800 pm werkafstand heeft. Wij rapporteren ook twee nuttige varianten van dit protocol dat kan worden gebruikt om het oppervlak van tegenkleuringgemonteerde hersensecties met cresyl violet Nissl vlek of gehele hersenen voor langdurige opslag bevriezen voorafgaand aan snijden en eindverwerking. De belangrijkste protocol en de twee varianten produceren lood dikke hersencoupes, gedurende welke volledige neuron dendritische bomen en dendriet stekels betrouwbaar kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd.

Dit Golgi-Cox kleuringsprotocol en twee optionele beschreven varianten kunnen worden toegepast om individuele neuronen te visualiseren binnen 400-500 urn dikke hersencoupes. Representatief beeld montages tweedimensionale Z-uitsteeksels opgenomen met een 10X objectief en 5 urn stappen in de Z-as zijn weergegeven in Figuur 1: A1 - C1 voor een groot gebied van coronale hersenplakjes de anterior cingulate cortex gebied 1 en het omvat secundaire motorische cortex <sup class="...

We presenteren een protocol voor het gebruik van Cox Golgi-kleuring werkwijze dikke hersenpreparaten, teneinde neuronen met lange dendritische bomen opgenomen in één weefselmonsters zichtbaar. Twee varianten van dit protocol worden ook getoond dat cresyl violet tegenkleuring, en het bevriezen van onbewerkte hersenen voor langdurige opslag omvatten.

Imaging Neuronen binnen Dik Brain af met de Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Het algemene doel van deze procedure is om de effectieve behandeling van de morfologie van neuronen in de hersenen van knaagdieren te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de neurowetenschappen, zoals de normale en experimenteel gemanipuleerde morfologie van neuronen binnen verschillende regio's van de hersenen van knaagdieren. Deze techniek heeft als belangrijkste voordeel dat de kans op het identificeren en visualiseren van gelabelde neuronen die volledig besloten liggen binnen enkele histologische monsters wordt vergroot.Begin de Golgi-Cox-kleuring door een verse muizenhersenen in een glazen scintillatiebuis van 20 milliliter te plaatsen die 17 milliliter Golgi-Cox-oplossing bevat. Bescherm tegen licht en incubeer gedurende 25 dagen bij kamertemperatuur. Zodra de incubatieperiode is verstreken, wordt de cryobescherming van de hersenen uitgevoerd door deze in 40 milliliter sucrose-cryoprotectant te plaatsen en 24 uur in het donker te incuberen bij 4 graden celsius.Na de incubatie in sucrose kan het brein worden ingevroren voor langdurige bewaring, of direct worden geblokkeerd voor sectie, zoals wordt getoond in het volgende deel

imaging-neurons-within-thick-brain-sections-using-the-golgi-cox-method

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the process of visualizing a biocytin-filled interneuron in a rat hippocampal section, highlighting its neurochemical identity through the use of specific antibodies and fluorescence microscopy.

Immunostaining of Interneurons in a Rat Hippocampal Section

Source: Louth, E. L.,  et al. Imaging neurons within thick brain sections using the Golgi-Cox method. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates imaging neurons in a Golgi-Cox stained thick brain section by setting upper and lower focus boundaries and capturing overlapping images. Multiple locations are imaged to ensure detailed neuronal projections, which are combined to create a 3D representation.

Microscopic Imaging of Neurons in a Mouse Brain Section Using Golgi-Cox Metallic Staining

Dit artikel beschrijft de procedures voor de tactiele stimulatie van pups rat en de daaropvolgende Golgi-Cox kleuring van neuronale morfologie. Tactiele stimulatie is een positieve ervaring die wordt toegediend in de perinatale periode door strelen pups met een huishouden stofdoek. Golgi-cox kleuring is een betrouwbare procedure waardoor de visualisatie van hele neuronen.

Visualiseren van de effecten van een positieve vroege Experience, Tactiel Stimulatie, op dendritische morfologie en Synaptic Connectiviteit met Golgi-Cox kleuring

We beschrijven twee methoden voor visualisatie en kwantificering van dendritische arborisatie in de hippocampus van muizenmodellen: real-time en extended depth of field beeldvorming. Terwijl de eerste methode geavanceerd topografisch traceren en kwantificering van de mate van vertakking toelaat, biedt de laatste snelle visualisatie van de dendritische boom.

Beoordeling van Dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in Muizen

Dit protocol geeft een werkwijze voor de morfologische herstel van neuronen patched tijdens elektrofysiologische opnames via biocytine vullen en immunohistochemische latere nabewerking. We laten zien dat dikke-biocytine gevuld secties die werden gekleurd en afgedekt kunnen worden restained met een tweede primair antilichaam dagen of maanden later.

Immunokleuring van biocytine gevuld en Verwerkte secties voor Neurochemische Markers

Dit protocol beschrijft grootschalige reconstructies van selectieve neuronale populaties, het label na retrograde infectie met een gemodificeerde rabiësvirus uiten van fluorescerende markers, en onafhankelijke, onpartijdige cluster analyses waarmee uitgebreide karakterisering van morfologische metrics onder verschillende neuronale subklassen.

Grootschalige Reconstructies en Onafhankelijk, Unbiased Clustering Gebaseerd op morfologische Metrics om neuronen te classificeren in Selective Populaties

Hier presenteren we een Golgi-Cox protocol in uitgebreid detail. Deze betrouwbare weefselvlekmethode zorgt voor een hoogwaardige beoordeling van de cytoarchitectuur in de hippocampus, en door de hele hersenen, met minimale probleemoplossing.

Beoordeling van Hippocampale Dendritische Complexiteit in Oude Muizen Met behulp van de Golgi-Cox Methode

Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Het protocol beschrijft een wijziging van de snelle Golgi-methode, die kan worden aangepast aan elk deel van het zenuwstelsel, voor het kleuren van neuronen in de hippocampus en de mediale prefrontale cortex van de rat.

Snelle Golgi-vlek voor dendritische wervelkolomvisualisatie in hippocampus en prefrontale cortex

Leer de Golgi-Cox methode voor visualisatie van neuronen met lange dendrietbomen in dikke hersensneden van knaagdieren. Dit protocol omvat cresylviolet tegenkleuring en cryobescherming voor langetermijnopslag.

Imaging Neuronen binnen Dik Brain af met de Golgi-Cox Method

Meer video's verkennen