Imaging Neuronen binnen Dik Brain af met de Golgi-Cox Method

Het algemene doel van deze procedure is om de effectieve behandeling van de morfologie van neuronen in de hersenen van knaagdieren te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de neurowetenschappen, zoals de normale en experimenteel gemanipuleerde morfologie van neuronen binnen verschillende regio's van de hersenen van knaagdieren. Deze techniek heeft als belangrijkste voordeel dat de kans op het identificeren en visualiseren van gelabelde neuronen die volledig besloten liggen binnen enkele histologische monsters wordt vergroot.

Begin de Golgi-Cox-kleuring door een verse muizenhersenen in een glazen scintillatiebuis van 20 milliliter te plaatsen die 17 milliliter Golgi-Cox-oplossing bevat. Bescherm tegen licht en incubeer gedurende 25 dagen bij kamertemperatuur. Zodra de incubatieperiode is verstreken, wordt de cryobescherming van de hersenen uitgevoerd door deze in 40 milliliter sucrose-cryoprotectant te plaatsen en 24 uur in het donker te incuberen bij 4 graden celsius.

Na de incubatie in sucrose kan het brein worden ingevroren voor langdurige bewaring, of direct worden geblokkeerd voor sectie, zoals wordt getoond in het volgende deel van de video. Bij invriezen wordt het gehele brein ondergedompeld in 200 milliliters isopentaan dat is voorgekoeld op droogijs. Plaats het ingevroren brein vervolgens in een conische buis van 50 milliliter en bewaar deze donker bij minus 80 degrees celsius.

Begin met het verwijderen van de hersenen uit de sucrose. Gebruik een scheermesje om de hersenen voor te bereiden voor het maken van coupes door het cerebellum af te snijden, waarbij een vlakke rand aan het resterende caudale uiteinde van de hersenen overblijft. De hersenen moeten onder een nauwkeurige hoek worden geblokkeerd om ervoor te zorgen dat de neuronen van belang volledig in de resulterende coupes zijn opgenomen.

Voor cerebrale cortex piramidale neuronen gebruiken we bijvoorbeeld een coronale vlak dat perfect loodrecht staat op de rostrale caudale as. Verwarm vervolgens de agar tot deze gesmolten is. Laat het afkoelen tot het net boven het smeltpunt is.

Plaats het brein vervolgens in een klein wegwerpschaaltje voor weging met het caudale uiteinde naar beneden. Voeg gesmolten agar toe om het brein te bedekken. Zodra de agar is gestold, wordt het teveel weggesneden zodat er ongeveer twee tot vier milliliter rondom het brein overblijft.

Gebruik vervolgens een kleine hoeveelheid ethylcyanoacrylaat om het brein met het caudale uiteinde naar beneden op de tafel van een vibratoom te lijmen. Vul het tafelgedeelte van het vibratoom met voldoende sucrose-cryoprotectant om het brein te bedekken. Snijd vervolgens het brein in plakjes met een dikte van 400 tot 500 microns, afhankelijk van de te onderzoeken hersenregio.

Plaats met een klein penseel hersencoupes in de putjes van een six-well tissue culture plate met mesh-bodem inserts, die vooraf zijn gevuld met sucrose M fosfaatbuffer. Bescherm de coupes tegen licht tijdens het snijden. Incubeer de coupes na het snijden een nacht in het donker bij vier graden celsius.

Breng met behulp van de inzetten met gaasbodem de hersensecties over naar een nieuwe put met vijf milliliter paraformaldehyde in fosfaatbuffer. Incubeer gedurende 15 minuten op een rocker met een lage snelheid bij kamertemperatuur en in het donker. Was de secties twee keer door ze over te brengen naar nieuwe putten met vijf milliliter water.

Bescherm tegen licht en was op matige snelheid bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Breng de coupes vervolgens over naar een nieuwe well met vijf milliliters ammoniumhydroxide. Schud langzaam in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.

Was de coupes twee keer door ze over te brengen naar nieuwe putjes met vijf milliliters water. Was op een rocker met een matige snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Breng de coupes over naar een nieuw putje met vijf milliliters verdunde fixatievloeistof A. Incubeer op een rocker met een lage snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten.

Was de coupes tweemaal in water, zoals eerder beschreven. Gebruik een klein penseel om de coupes op een microscopisch objectglas te plaatsen, en gebruik vervolgens een pincet en een klein stukje weefsel om overtollig water en agar te verwijderen. Zorg ervoor dat alle agar is verwijderd voordat u overgaat naar de dehydratatiestappen.

Laat de coupes aan de lucht drogen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. De juiste droogtijd is cruciaal en moet voor elk laboratorium worden bepaald. Een te korte tijd kan ertoe leiden dat de coupes van de objectglazen afvallen tijdens de dehydratiestappen, en een te lange tijd kan ertoe leiden dat de coupes barsten.

Plaats de coupes na het drogen eerst gedurende vijf minuten in het transparatiemiddel. Plaats de coupes vervolgens vijf minuten in 100% ethanol. Ga daarna door een reeks afnemende ethanolconcentraties, telkens gedurende twee minuten.

Plaats de objectglaasjes na de alcoholserie vijf minuten in water. Kleur ze vervolgens zeven minuten met 0,5% cresylviolet in water. Plaats de objectglaasjes na de cresylvioletkleuring twee minuten in water.

Dehydrateer de coupes vervolgens via een reeks oplossingen met toenemende alcoholconcentraties gedurende telkens twee minuten. Volg dit met twee wasbeurten in 100% ethanol van vijf minuten. Plaats de coupes vervolgens gedurende vijf minuten in het helderingsmiddel.

Voeg ten slotte een watervrij monteermedium toe en plaats een dekglas over de coupes. Laat de preparaten horizontaal in het donker bij kamertemperatuur gedurende ten minste vijf dagen drogen. Om afbeeldingstacks met een hoge resolutie te maken van het gebied met het neuron van belang, selecteer eerst een 30X 1.05 NA siliconenolie-immersieobjectief op de microscoop.

Breng vervolgens drie tot vier druppels siliconen immersie-olie aan op het preparaatglas. Plaats het objectief op het glas en zorg voor contact tussen het objectief en de olie. Stel de afbeelding scherp en pas de camera-instellingen aan, waaronder de belichting en het witbalans in de imaging-software.

Stel vervolgens de bovenste en onderste grenzen voor de beeldstapel in door scherp te stellen op de bovenkant van de sectie en daarna op 'set' naast 'top of stack' te klikken in het venster voor beeldacquisitie. Stel vervolgens scherp op de onderkant van de sectie en selecteer 'set' naast 'bottom of stack'. Stel de stapafstand in op 1 µm door 1 µm in te voeren naast 'distance between images' in het venster voor beeldacquisitie.

Leg tot slot de beeldstapel vast door op 'acquire image stack' te klikken in het venster voor beeldacquisitie. Herhaal de vorige stappen om het gehele interessegebied vast te leggen, waarbij u erop let dat alle beeldstapels in de X- en Y-as met ten minste 10% overlappen. Deze afbeelding van de cerebrale cortex is een samengevoegde Z-projectie van beeldstapels die zijn verkregen uit een doorsnede van 500 micron dik met gebruik van een 10X objectief.

Het weefsel in deze afbeelding is verwerkt volgens het hoofdprotocol voor vers weefsel. Het gebied dat is aangegeven met het rode vierkant is gefotografeerd met een 30X siliconen-olie-immersieobjectief, waarbij een samengevoegde Z-projectie-afbeeldingstack met een hogere resolutie is verkregen. De rode pijl toont de tweedimensionale Z-projectie van een neuron dat is getraceerd vanuit de Z-projectie-afbeeldingstack met een hoge resolutie van 30X.

Hier is de nieuwe protocolvariant met cresylvioletkleuring gebruikt. Deze afbeelding met een hogere resolutie toont het met cresylviolet gekleurde coupes. En dit is de verkregen neuron-tracing.

Ten slotte werd dit weefsel verwerkt met de protocolvariant waarbij de hersenen na Golgi-Cox-impregnatie worden ingevroren. Hier is het eerder ingevroren weefsel met een hogere resolutie te zien. En opnieuw is er een hoogwaardige tweedimensionale Z-projectie van de neuronale tracing verkregen.

Deze techniek kan binnen één maand worden voltooid, waarbij de verwerkings- en beeldvormingsstappen in de laatste week worden uitgevoerd. Hersenen kunnen alternatief worden ingevroren na de Golgi-Cox-impregnatie, waardoor de verwerking en beeldvorming op een later tijdstip kunnen worden voltooid. Na deze procedure kunnen neurowetenschappers de vastgelegde beelden gebruiken om gedetailleerde morfologische analyses uit te voeren, zoals dendrietcomplexiteit of spine-dichtheid, om te bepalen hoe een experimentele manipulatie de structuur van neuronen in de hersenen kan veranderen.