Imaging Neuronen binnen Dik Brain af met de Golgi-Cox Method

Het algemene doel van deze procedure is om de effectieve behandeling op de morfologie van neuronen in de hersenen van knaagdieren te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappen, zoals de normale en experimenteel gemanipuleerde morfologie van neuronen in verschillende regio's van de hersenen van knaagdieren. Deze techniek heeft het grote voordeel dat de waarschijnlijkheid van het identificeren en visualiseren van gelabelde neuronen die volledig binnen enkele histologische monsters zijn opgenomen, wordt verhoogd.

Begin met Golgi-Cox-kleuring door een vers muizenbrein in een glas scintillatiebuisje van 20 milliliter te plaatsen dat 17 milliliter Golgi-Cox-oplossing bevat. Bescherm tegen licht en incubeer op kamertemperatuur gedurende 25 dagen. Zodra de incubatieperiode is verstreken, cryo-bescherm het brein door het in 40 milliliter sucrose cryoprotectant te plaatsen en in het donker bij 4 graden Celsius gedurende 24 uur te incuberen.

Na de incubatie in sucrose kan het brein worden ingevroren voor langdurige opslag, of onmiddellijk worden geblokkeerd voor sectiëring zoals weergegeven in het volgende deel van de video. Als u invriest, dompelt u het hele brein onder in 200 milliliter isopentaan dat is voorgekoeld op droog ijs. Plaats vervolgens het bevroren brein in een conische buis van 50 milliliter en bewaar het in het donker op minus 80 graden Celsius.

Om te beginnen, verwijdert u het brein uit de sucrose. En gebruik een scheermes om het te blokkeren voor sectiëring door het cerebellum af te snijden, waardoor een platte rand achterblijft aan het resterende caudale uiteinde van het brein. Het brein moet in een precieze hoek worden geblokkeerd om ervoor te zorgen dat de interessante neuronen volledig zijn opgenomen in de resulterende secties.

Wij gebruiken bijvoorbeeld een coronale vlak die perfect loodrecht staat op de rostrale caudale as voor pyramidale neuronen in de hersenschors. Vervolgens verwarmen we agar tot het gesmolten is. En laten we het afkoelen tot het iets boven het smeltpunt is.

Plaats vervolgens het brein in een kleine wegwerpweegschaal met het caudale uiteinde met de kant naar beneden. Voeg gesmolten agar toe om het brein te bedekken. Zodra de agar is gestold, trimt u het overtollige en laat u ongeveer twee tot vier milliliter rond het brein over.

Gebruik vervolgens een kleine hoeveelheid ethylcyanoacrylaat om het brein op het podium van een vibratoom te lijmen met het caudale uiteinde naar beneden. Vul het podiumgebied van de vibratoom met voldoende sucrose cryoprotectant om het brein te bedekken. Sectieer vervolgens het brein in een dikte van 400 tot 500 micron, afhankelijk van het te onderzoeken deel van de hersenen.

Gebruik een kleine verfkwast om de hersensecties in de putjes van een zes-putjescultuurplaat te plaatsen met gaasbodeminserties en voorgevuld met sucrose M fosfaatbuffer. Bescherm tijdens het sectiëren tegen licht. Wanneer het sectiëren is voltooid, incubeer de secties in het donker bij vier graden Celsius gedurende een nacht.

Gebruik de gaasbodeminserties om de hersensecties over te brengen naar een nieuw putje met vijf milliliter paraformaldehyde in fosfaatbuffer. Incubeer op een rocker die langzaam beweegt bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 minuten. Was de secties tweemaal door ze over te brengen naar nieuwe putjes met vijf milliliter water.

Bescherm tegen licht en was met matige snelheid bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Breng vervolgens de secties over naar een nieuw putje met vijf milliliter ammoniumhydroxide. Schud langzaam in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.

Was de secties tweemaal door ze over te brengen naar nieuwe putjes met vijf milliliter water. Was op een rocker die met matige snelheid beweegt in het donker bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Breng de secties over naar een nieuw putje met vijf milliliter verdund fixatief A. Incubeer op een rocker die langzaam beweegt in het donker bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten.

Was de secties tweemaal in water zoals hiervoor. Gebruik een kleine verfkwast om de secties op een microscoopglaasje te plaatsen, gebruik vervolgens een pincet en een klein doekje om overtollig water en agar te verwijderen. Zorg ervoor dat al het agar is verwijderd voordat u doorgaat met de dehydratatiestappen.

Laat de secties bij kamertemperatuur in het donker beschermd tegen licht aan de lucht drogen. De juiste droogtijd is cruciaal en moet voor elk laboratorium worden bepaald. Te korte tijd kan ertoe leiden dat secties tijdens de dehydratatiestappen van de glijbanen vallen, en te lange tijd kan ertoe leiden dat secties scheuren.

Na het drogen, plaatst u de glijbanen eerst vijf minuten in clearingmiddel. Plaats de glijbanen vijf minuten in 100% ethanol. Beweeg vervolgens door een reeks afnemende ethanolconcentraties gedurende twee minuten per keer.

Na de alcoholreeks plaatst u de glijbanen vijf minuten in water. Kleur vervolgens in 0,5% cresylviolet in water gedurende zeven minuten. Na de cresylvioletkleuring plaatst u de glijbanen gedurende twee minuten in water.

Dehydrateer vervolgens de secties door een reeks toenemende alcoholconcentraties gedurende twee minuten per keer. Vervolgens twee wasbeurten in 100% ethanol gedurende vijf minuten. Plaats in clearingmiddel gedurende vijf minuten.

Voeg tenslotte een anhydrous montagemedium toe en plaats een dekglas over de secties. Laat de glijbanen horizontaal in het donker bij kamertemperatuur gedurende ten minste vijf dagen drogen. Om hoogwaardige beeldstacks van het gebied met de geïnteresseerde neuron vast te leggen, selecteert u eerst een 30X 1.05 NA siliconenolië immersieobjectief op de microscoop.

Breng vervolgens drie tot vier druppels siliconenimmersieolie aan op de glijbaan. Plaats het objectief over de glijbaan en zorg voor contact tussen het objectief en de olie. Focus het beeld en pas de camera-instellingen aan, inclusief de belichting en het witbalans in de beeldverwerkingssoftware.

Stel vervolgens de b