Organotypic Hippocampal Slice culturen als een Model voor de studie neuroprotectie en invasiviteit van tumorcellen

Voorbereiding en snijden met een vibratoom. Drie agarbloeken zijn nodig om de hersenen te stabiliseren tijdens de snijprocedure. Gebruik een geautoclaveerde set instrumenten om contaminatie te voorkomen.

Verwijder de agar. Dit moet worden gedroogd op filterpapier voordat het met medische cyanoacrylaatlijm op de metalen plaat wordt geplakt. Verwijder met een spatel de hersenen en plaats deze voorzichtig in de petrischaal gevuld met preparatiemedium.

Droog vervolgens de hersenen kort af op het filterpapier. Bedek de metalen plaat met medische cyanoacrylaatlijm. Gebruik de pincet en de spatel om de hersenen op de specimenhouder te positioneren.

Gebruik de eerder voorbereide twee stukken agar om aan beide zijden voor mechanische stabiliteit te zorgen. Op dit punt moet het brein naast het agarblok worden geplaatst en gestabiliseerd met twee verdere blokken om beschadiging tijdens het snijden te voorkomen. Plaats de metalen plaat in de vibratoom en bedek het weefsel met koud preparatiemedium.

Dissekeer daarna het weefsel horizontaal in OHSC-plakjes van 350 micrometers dik met behulp van een sliding vibratoom. Draag de plakjes over naar de Petrischaal door de achterkant van een gebroken Pasteurpipet te gebruiken om de plakjes te verzamelen. Bewaar de hersenplakjes in koud preparatiemedium.

Evalueer de coupes optisch met een binoculaire microscoop. Scheid het hippocampaal gebied en dring door tot in de binnenste cortex met een scalpel met een rond mesje van maat 15. Het is belangrijk om alleen coupes te nemen met een intacte cytoarchitectuur, geïsoleerd uit het middelste deel van de hippocampus tussen de dorsale en de ventrale hippocampus.

OHSC's van lage kwaliteit moeten onmiddellijk worden weggegooid. Breng twee tot drie van de verkregen plakjes over naar een celkweekinsert met een poriegrootte van 0,4 micrometer. Aspireer het preparatiemedium van de bovenkant van het celkweekinsert met een Pasteurpipet.

Plaats de insert in een six-well kweekplaat met één milliliter kweekmedium per well. Incubeer de six-well platen bij 35 °C in een volledig bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 en versoon het celkweekmedium om de tweede dag. Na zes dagen kweek voor rattenweefsel, of 14 dagen voor muizenweefsel, zijn de ontstekingsreacties die gepaard gaan met de slicing-procedure zelf verdwenen.

Experimenten kunnen nu worden uitgevoerd. Representatieve resultaten voor neuroprotectiestudies. Afbeelding deel A toont niet-gelesioneerde OHSC die gedurende negen dagen in vitro in cultuurmedium zijn gehouden zonder enige behandeling, die dienen als controle-slices.

Zoals bevestigd door confocale laserscannende microscopie, vertoonde de controle-OHSC een goede neuronale preservatie. De Isolectine B4-positieve microgliacellen waren hoofdzakelijk gelokaliseerd in de moleculaire en plexiforme lagen en vertoonden een vertakt fenotype. In de korrelcellaag van de gyrus dentatus werden slechts enkele Isolectine B4-positieve microgliacellen en vrijwel geen Propidiumjodide-positieve kernen aangetroffen.

Een andere set OHSC, getoond in afbeeldeel B, werd gedurende zes dagen in kweekmedium gehouden, beschadigd met 50 micromolaire NMDA gedurende vier uur en vervolgens nog eens drie dagen in kweekmedium gehouden. Na de NMDA-beschadiging vond een massale accumulatie van geactiveerde Isolectine B4-positieve microgliacellen plaats die hechtten aan de plaats van het neuronale letsel, verspreid over alle lagen van de gyrus dentatus.

Kwantitatieve analyse wees uit dat in de korrelcellaag van de gyrus dentatus het aantal Isolectin B4-positieve microgliacellen hoger was in de beschadigde OHSC vergeleken met de controlecondities. Op een soortgelijke manier was het aantal Propidiumjodide-positieve degenererende neuronen sterk toegenomen in de korrelcellaag van NMDA-beschadigde coupes. Voorbeelden van resultaten voor tumorinvasiestudies.

Alle afbeeldingen tonen resultaten van tumorinvasie SS met gebruik van OHSC, gefotografeerd met een confocale laserscanningmicroscoop. De rode kleur markeert de cytoarchitectuur van de OHSC en de groene kleur de tumorcellen. Afbeelding A laat een typisch invasiepatroon zien voor U138 glioblastoomcellen die vier dagen de tijd kregen om te invaderen.

Heldere, sferische, duidelijk onderscheidbare tumoren kunnen worden waargenomen en de structuur van de OHSC lijkt intact, met een duidelijk zichtbare gyrus dentatus en Cornu Ammonis. Afbeelding B toont een ander invasiepatroon, gegenereerd door LN229 glioblastoomcellen na vier dagen. In dit geval kunnen individuele tumoren niet duidelijk worden onderscheiden vanwege het gevormde netwerk dat een groot deel van de OHSC bedekt, hoewel de cytoarchitectuur intact blijft met een niet-gedeformeerde gyrus dentatus en Cornu Ammonis.

Verder kan worden geconcludeerd dat LN229-cellen invasiever zijn dan U138-cellen. Afbeelding C en D tonen hetzelfde resultaat van tumorinvasie voor LN229-cellen na vier dagen invasie. Aan de linkerkant is te zien dat de tumormassa bijna het gehele gezichtsveld bedekt.

Afbeelding D toont de overeenkomstige kleuring met Propidiumjodide. In deze coupe is de cytoarchitectuur niet langer intact, aangezien de Cornu Ammonis niet meer zichtbaar is en ook de gyrus dentatus vervormd is. Een mogelijke reden voor een dergelijk resultaat zou een OHSC kunnen zijn die aan het begin van dat experiment niet volledig intact was, een te hoog aantal toegepaste tumorcellen, of een te lange invasietijd die heeft geleid tot het waargenomen verlies van structuur.

Dergelijke invasieresultaten moeten daarom worden verworpen. Organotypische hippocampal slice-culturen vormen een zeer goed in vitro-model dat de fysiologie van de hersenen met intacte neuronale verbindingen weerspiegelt. Omdat er uit één model meerdere slice-culturen kunnen worden verkregen, is het mogelijk om diverse condities te testen in weefsel van één enkel dier en zijn de resultaten zeer reproduceerbaar.

Vanwege de hoge mate van toegankelijkheid zijn organotypische hippocampus-plakculturen uitstekend geschikt voor een veelheid aan experimentele typen. Dit omvat elektrofysiologische en neurogenese-studies, maar ook experimenten naar neuroprotectie, tumorinvasie en interacties van tumorcellen met gezond hersenweefsel.