Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)
7 maart 2017
Dit protocol beschrijft een methode voor de snelle verwerking van post-mortem diffuse intrinsieke pontijnse glioom monsters voor de oprichting van de patiënt afgeleide celcultuur modellen of directe karakterisering van tumor en micro-omgeving van de cellen.
Het algemene doel van dit snelle post-mortem celkweekprotocol is om duurzame op de patiënt afgeleide celculturen van diffuse intrinsieke pontine glioom te genereren om de experimenten mogelijk te maken die nodig zijn om DIPG te begrijpen en uiteindelijk effectieve therapieën voor DIPG te ontwikkelen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over de fundamentele biologie van en therapeutische strategieën voor diffuse intrinsieke pontine glioom, zoals of bepaalde medicijnen werken in verschillende op de patiënt afgeleide culturen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het directe studie van de biologie van op de patiënt afgeleide cellen mogelijk maakt.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar therapie voor DIPG, omdat het de test van verschillende therapeutische strategieën over verschillende genetische subtypes van de ziekte mogelijk maakt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in DIPG, kan het ook worden toegepast op andere ziekten, zoals andere pediatrische hooggradige gliomen, volwassen glioblastoma's of andere centraal zenuwstelseltumoren. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze techniek worstelen, omdat het moeilijk is om autopsiemonsters op efficiënte wijze te verkrijgen en snel te verwerken.
Voorafgaand aan de monstervoorbereiding, steriliseer de weefselkweekhood, samen met scheermessen, gebogen hemostatische klemmen en andere niet-steriele gereedschappen onder UV-licht gedurende een uur, en voer alle volgende stappen uit onder steriele omstandigheden. Breng vervolgens het weefsel over in een celkweekschaal met hoge wanden van 100 millimeter bij 20 millimeter. Verwijder het medium dat overblijft van de verzending en vervang het door 10 tot 15 milliliter koud kweekmedium.
Gebruik vervolgens de gebogen hemostatische klem om een scheermes vast te grijpen, snijdt het weefsel fijn terwijl u de bloedvaten of hersenvliezen verwijdert. De uiteindelijke weefselfragmenten moeten kleiner zijn dan één millimeter. Breng vervolgens het weefsel over in een schone 50-milliliter conische buis.
Was de celkweekschaal met een extra vijf milliliter koud kweekmedium en breng het monster over in de conische buis. Herhaal deze wasstap zo nodig om het resterende weefsel over te brengen. Gebruik een 10-milliliter serologische pipet en tritureer het monster voorzichtig vier tot vijf keer.
Laat grotere weefselfragmenten naar de bodem van de buis zakken. Indien nodig, centrifugeer het monster kort gedurende één minuut. Om de gedissocieerde fractie te verzamelen, verwijdert u het supernatant en filtreert u het door een 100-micron filter in een nieuwe 50-milliliter conische buis gelabeld als Mechanische Dissociatie.
Keer de filter om over de originele conische buis en was deze met kweekmedium om de weefselfragmenten te herstellen. Centrifugeer vervolgens de mechanische dissociatiefractie gedurende vijf minuten. Vervolgens verwijdert u het supernatant van de gepelletiseerde mechanische dissociatiefractie en suspendeert u het weefsel opnieuw in koud kweekmedium.
Als er meer dan vijf milliliter weefsel in de conische buis voor mechanische dissociatie zit, verdeelt u het weefsel in andere 50-milliliter conische buizen zodat geen enkele buis meer dan vijf milliliter weefsel bevat. Bewaar vervolgens de mechanisch gedissocieerde fractie op ijs tot de sucrosegradiënt centrifugatiestap. In deze procedure centrifugeer je de conische buis met de resterende weefselfragmenten gedurende vijf minuten.
Verwijder vervolgens het supernatant en voeg de voorverwarmde enzymatische verteringsoplossing toe, zodat er vijf milliliter verteringsoplossing is voor elke milliliter weefsel. Vervolgens verzegel je het conische buisdeksel met laboratoriumfilm en incubeer je de reactie op een rotator bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Na incubatie tritureer je de monsters voorzichtig.
Gebruik een 10-milliliter serologische pipet, pipetteer het monster zes tot acht keer op en neer en vermijd het genereren van overmatige luchtbellen. Voeg vervolgens een 1.000 microliter pipettip toe aan het uiteinde van de pipet en tritureer het monster nog eens zes tot acht keer. Laat eventuele resterende brokken naar de bodem van de buis zakken.
Vervolgens verwijdert en filtert u het supernatant met de cellen nog steeds gesuspendeerd door een 100-micron filter in een nieuwe 50-milliliter conische buis gelabeld Enzymatische Dissociatie en bewaart het op ijs. Volg daarna de centrifugatie van de enzymatische dissociatiebuis gedurende vijf minuten en ga door met sucrosegradiënt centrifugatie. Als het monster nog steeds gesuspendeerd is in oplossing, centrifugeer het dan gedurende vijf minuten.
Verwijder vervolgens het supernatant en suspendeer het weefsel opnieuw in 20 milliliter koud HBSS zonder calcium en magnesium. Breng vervolgens het volume op tot 25 milliliter met koud HBSS. Voeg langzaam 25 milliliter van 1,8 molaire sucrose-oplossing toe en draai de buis om om te mengen.
Dit resulteert in een 0,9 molaire sucrosegradiënt. Centrifugeer vervolgens het monster zonder pauze gedurende 10 minuten. Aspibeer voorzichtig de myelinedebris in zoveel mogelijk sucrose sucrose-oplossing.
Was vervolgens het monster door 30 milliliter koud HBSS zonder calcium en magnesium toe te voegen en voorzichtig te mengen. Centrifugeer het vervolgens gedurende vijf minuten. Verwijder in deze procedure het wassupernatant.
Suspendeer het uiteindelijke celpellet in 10 tot 15 milliliter warm compleet TSM met groeifactoren en bepaal de levensvatbare celdichtheid op een hemocytometer, met behulp van Trypan blue uitsluiting. Breng vervolgens de uiteindelijke celsuspensie over in een nieuwe T75 kweekfles. Voeg om de dag extra groeifactoren toe om de algehele groeifactorniveaus te handhaven en bewaak de ontwikkeling van tumorcelneurosferen.
Hier zijn verschillende voorbeelden van hoe de monsters eruit kunnen zien vanaf de vroege stadia van kweken tot een duurzame cultuur. Aanvankelijk lijken geplateerde en vroege culturen vaak niet veel overlevende cellen te bevatten. Bovendien vertonen vroege celclusters vaak niet de mate van contrast die typisch geassocieerd is met neurosferen.
Echter, de eerste passage van deze celclusters, in combinatie met omgekeerde filtering van celclusters, kan gezonde tumor
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor de snelle verwerking van post-mortem diffuse intrinsieke pontine glioom-monsters om patiëntafgeleide celcultuurmodellen te etaleren. Deze techniek vergemakkelijkt het onderzoek naar tumorbiologie en therapeutische strategieën.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Oncologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Diffuus intrinsiek pontine glioom (DIPG) is een uitdagende pediatrische hersentumor.
- Het begrijpen van de DIPG-biologie is cruciaal voor het ontwikkelen van effectieve therapieën.
- Patiëntafgeleid celkweken kunnen inzicht geven in het tumorgedrag.
- Deze methode kan ook worden toegepast op andere hooggradige gliomen en CNS-tumoren.
Doel van het onderzoek
- Om duurzame patiëntafgeleid celkweken van DIPG te genereren.
- Om experimenten te vergemakkelijken die gericht zijn op het begrijpen van de DIPG-biologie.
- Om therapeutische strategieën te testen over verschillende genetische subtypen heen.
Gebruikte methoden
- Post-mortem monsterverwerking onder steriele omstandigheden.
- Mechanische en enzymatische dissociatie van weefselmonsters.
- Sucrose-gradient centrifugatie voor celscheiding.
- Celcultuuronderhoud met groeifactoren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van patiëntafgeleid celkweken.
- Inzichten in de biologie van DIPG en potentiële therapeutische reacties.
- Aangetoonde toepasbaarheid op andere CNS-tumoren.
Conclusies
- Dit protocol maakt direct onderzoek van patiëntafgeleid DIPG-cellen mogelijk.
- Het biedt een platform voor het testen van verschillende therapeutische strategieën.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot andere pediatrische en volwassen hersentumoren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the critical need for physiologically relevant models in pediatric oncology by enabling rapid generation of patient-derived DIPG cultures from post-mortem tissue. It supports target validation and preclinical de-risking by providing a scalable system to evaluate therapeutic response across genetic subtypes. The method enhances translational continuity from discovery to lead identification by supplying durable cultures for mechanistic and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using patient-derived cells that retain tumor-specific biology.
- Operational Value: Provides a renewable source of DIPG cells for functional target validation and pathway analysis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing drug response comparison across genetically distinct cultures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dissociated cell suspensions suitable for FACS isolation and downstream molecular profiling.
- Operational Value: Standardizes sample preparation to produce consistent inputs for high-throughput screening platforms.
- Scalability: Enables production of sufficient cell numbers for multi-well assay formats and dose-response testing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains tumor-derived neurosphere-forming capacity, preserving key pathobiological features for preclinical modeling.
- Operational Value: Facilitates orthotopic xenograft establishment for in vivo efficacy and pharmacokinetic studies.
- Translational Alignment: Bridges discovery findings to preclinical validation through continuous culture passaging.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supplying validated biological systems for lead identification and preclinical evaluation. It enables hypothesis-driven screening and supports go/no-go decisions through quantitative, reproducible outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing direct testing of drug effects on patient-derived DIPG cells.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions ready for compound library screening and target engagement assays.
- Analytics: Enables quantification of viable cell density and neurosphere formation as phenotypic readouts for compound screening.
- Translational Research: Provides a continuous culture system that maintains tumor properties for longitudinal preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating CNS tumor models applicable to multiple therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing reliance on non-predictive cell lines and enhancing biological relevance.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissociation, filtration, and centrifugation steps under sterile conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early elimination of ineffective compounds using patient-relevant models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating efficacy data across multiple DIPG genetic subtypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling and enzymatic dissociation techniques.
- Depends on access to post-mortem tissue and rapid processing infrastructure to maintain sample viability.
- Necessitates standardized protocols across teams to ensure culture consistency and comparability of results.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other CNS tumor types with differing tissue characteristics.
- Limited by the difficulty in procuring and rapidly processing autopsy samples, which affects throughput and accessibility.
