Name: Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Leer een snel post-mortem celcultuurprotocol voor diffuse intrinsieke pontine glioom (DIPG) om patiënt-afgeleide celculturen te genereren. Deze methode ondersteunt onderzoek naar tumorbiologie en therapeutische strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs dankbaar erkennen de steun van de McKenna Claire Foundation, het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (NINDS K08NS070926 en R01NS092597), Department of Defense (NF140075), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM RB4-06093 en RN3-06510), Alex&#39;s Lemonade Stand Foundation, The Cure Starts Now Foundation en DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Foundation, Unravel Pediatric Cancer, Childhood Brain Tumor Foundation, Matthew Larson Foundation, V Foundation, Godfrey Family Fund in het geheugen van Fiona Penelope, de Wayland Villars DIPG Foundation, de Dylan Jewett Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, en Jennifer Kranz Memorial Funds, N8 Foundation, Virginia en DK Ludwig Fonds voor Kankeronderzoek, Child Health Research Institute op Stanford Anne T. en Robert M. Bass Endowed Faculteit Scholarship in Pediatric kanker en bloedziekten.

Dit protocol is uitgevoerd met de goedkeuring van onze institutionele review board met geschikte de-identificatie van alle patiëntgegevens en in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn. Het verkrijgen van de nodige institutionele review board goedkeuring en geïnformeerde toestemming van de familie van de patiënt voorafgaand aan het werken met dit protocol. 1. Het verkrijgen van weefselmonsters LET OP: Een cruciaal onderdeel van dit protocol vereist een goede afhandeling van de weefseldonatie met onmiddellijke ingang op het moment van de autopsie. De totale steekproef levensvatbaarheid is sterk afhankelijk van het minimaliseren van de Post-Mortem Interval (PMI), onmiddellijk overbrengen van het weefsel in de juiste koude medium aangevuld met antibiotica / antimycotica, het bijhouden van het monster op nat ijs gedurende het vervoer, en het handhaven van de steriele techniek in het hele protocol. <ol><li> na kennisgevingvan een op handen zijnde schenking, voor te bereiden een monster collectie kit. Met behulp van een scheepvaart doos met een geïsoleerde container die direct kunnen worden gebruikt voor de terugkeer transport van het weefselmonster, onder meer de volgende materialen: <ol><li> Omvatten materialen voor steriele bereiding, met inbegrip van steriele handschoenen, gordijnen, en scalpels. </li><li> Omvatten 8-10 steriele 50 ml conische buizen met 30 ml scheepvaart media in de geïsoleerde container met ijs of koude packs. LET OP: Hoewel elke standaard celcultuur media kan werken, is de beste monster levensvatbaarheid verkregen met Hibernate-A, aangevuld met antibioticum / antimycoticum. </li><li> Omvatten verdere monster buizen voor andere analyses (bijv fixatieven). </li><li> Als de autopsie niet zal worden uitgevoerd op de site van de onderzoeker, zijn voorzien van een document waarin duidelijk staat hoe de tumor monster te verzamelen. Deze bevat details, zoals het handhaven van steriliteit, waardoor monsterbuizen op nat ijs, en met inbegrip van monsters van de middenhersenen en merg als tumor cellen binnenvallen vaak deze regio&#39;s. </li></ol></li><li> Handhaving van de steriliteit tijdens de autopsie. Denk aan de hersenen steriele binnen de schedel, zo observeren steriele techniek (met inbegrip van het veranderen van handschoenen) zodra de schedel is geopend. Zodat verontreiniging met huid en haar kritisch. </li><li> Ontleden de tumor uit de ventrale zijde (de &quot;buik&quot; van de pons, zie Supplemental figuur 1). Met een steriele scalpel, snijd kleine 1 cm stukjes van de tumor en direct overdragen in koud verzending media (zie opmerking in stap 1.1.2) en op nat ijs. Breng 10 ml van weefsel in elke buis, wat resulteert in een uiteindelijk volume weefsel media in elke buis van 40 ml. OPMERKING: Bij DIPG, de tumor infiltreert diffuus pons en vaak de rest van de hersenstam. Als zodanig verzamel zoveel van het monster mogelijk, dat typisch 3-4 tubes (30 - 40 ml weefsel) van pons en 1-2 buizen (10-20 mL weefsel) van middenhersenen en medulla. </li><li> Verzamel samselen van de middenhersenen en medulla geplaatst naast de pons, die vaak bevatten veel tumorcellen. </li><li> Na de monstername, het schip de monsters O / N op nat ijs in de geïsoleerde container. Verschepen niet het monster op droog ijs, zoals het bevriezen van de cellen te doden. </li></ol> 2. Voorbereiding voor het monster verwerking <ol><li> Voorafgaand aan het begin monstervoorbereiding, steriliseren weefselkweek kap met scheermesjes, gebogen hemostats, en andere niet-steriele instrumenten onder UV licht gedurende 1 uur. Voer alle volgende stappen onder steriele omstandigheden om besmetting van de kweken te voorkomen. </li><li> Bereid en steriele filter oplossingen. <ol><li> Tot 1,8 M sucrose oplossing te bereiden, te ontbinden 308,07 g sucrose in 300 ml gedestilleerd water. 50 mL voeg 10x Hank&#39;s-gebufferde zoutoplossing (HBSS) zonder calcium of magnesium en brengt totale volume 500 ml met gedestilleerd water. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Enzymatische vertering te bereiden, neem 50 ml HBSS met calcium en magnesium voor elke 10 ml gehakt weefsel en voeg 500 ul 5 mg / ml deoxyribonuclease I (eindconcentratie 50 gg / ml), 500 pl 2,5 mg / ml collagenase I / II en Dispase-oplossing (eindconcentratie 25 ug / ml) en 500 gl 1 M HEPES-buffer. Voorverwarmen spijsvertering oplossing in een 37 ° C waterbad. </li><li> Om tumorstamcellen media (TSM) voor te bereiden die, meng 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), 5 ml 100x antibioticum-antimycoticum, 5 ml 200 mM L-alanyl-L- glutamine dipeptide (GlutaMAX-A), 5 ml HEPES-buffer, 5 ml 100 mM natriumpyruvaat en 5 ml 100x MEM niet-essentiële aminozuren. </li><li> Om compleet TSM bereiden met groeifactoren, voeg de volgende aanvullingen op TSM basis: 50x B27 Supplement Minus Vitamine A (1:50), de menselijke epidermale groeifactor (H-EGF, 20 ng / ml), de menselijke fibroblast groeifactor (H- FGF, 20 ng / ml), humaan bloedplaatjes afgeleide groeifactor AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml),menselijke bloedplaatjes afgeleide groeifactor BB (H-PDGF-BB, 10 ng / ml) en heparine-oplossing (2 ug / ml). </li></ol></li><li> Voorkoelen een laboratorium centrifuge uitgerust met een swinging-bucket rotor bij 4 ° C. </li></ol> 3. mechanische Dissociatie <ol><li> Breng het weefsel in een high-ommuurde 100 mm x 20 mm celkweek schotel. Verwijder media overblijfsel uit de scheepvaart en te vervangen door 10 - 15 ml koud kweekmedium. </li><li> Met behulp van de gebogen hemostats te vatten een scheermesje, gehakt het weefsel fijn tijdens het verwijderen van de hand liggende bloedvaten of hersenvliezen. LET OP: De laatste weefsel fragmenten moet kleiner zijn dan 1 mm (zie figuur 1B). </li><li> Breng het weefsel in een schone 50 ml conische buis. Was de celkweekschaal met 5 ml koud kweekmedium en plaats het conische buis. Herhaal deze wasstap als nodig is om de resterende weefsel te dragen. </li><li> Met behulp van een 10 ml serologische pipet zachtjes vermaal (4-5 keer). Laat grotere tissue fragmenten naar de bodem van de buis. Eventueel kort centrifugeren van het monster gedurende 1 minuut (350 xg, 4 ° C). </li><li> Verzamel de mechanisch gescheiden fractie. <ol><li> Verwijder de supernatant en filtreer het door een 100 urn filter in een nieuwe 50 ml conische buis met het label &quot;mechanische dissociatie.&quot; Keer de filter over de oorspronkelijke conische buis en was met de cultuur media om weefsel fragmenten te herstellen. </li><li> Centrifugeer de &quot;mechanische dissociatie&quot; fractie gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof uit het ingehulde &quot;Mechanische dissociatie&quot; fractie en resuspendeer het weefsel in koud kweekmedium. Als er meer dan 5 ml van weefsel in de &quot;mechanische dissociatie&quot; conische buis, splitsen de andere weefsel in 50 ml conische buizen zodat geen buis meer dan 5 ml weefsel. </li></ol></li><li> Bewaar de mechanisch gedissocieerde fractie op ijs tot de sucrose gradiënt centrifugeren stap (Step 5). Als alternatief kan de mechanisch gedissocieerde fractie verder met stap 5 tijdens de enzymatische dissociatie incubatietijd (stap 4.4). </li></ol> 4. Enzymatische dissociatie <ol><li> Als er meer dan 5 ml van weefsel in de buis met de grotere resterende weefsel fragmenten gesplitst weefsel in de andere nieuwe 50 ml conische buizen zodat geen buis meer dan 5 ml weefsel. </li><li> Centrifugeer de conische buis (buizen) die het resterende weefsel fragmenten gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). </li><li> Verwijder de supernatant en voeg de voorverwarmde enzymatische digestie oplossing, zodat er 5 ml verteringsoplossing voor elke 1 ml weefsel (bijvoorbeeld 25 ml digestie oplossing voor 5 ml weefsel). </li><li> Dicht de conische buis met deksels laboratorium film en incubeer de reactie op een rotator bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Na de incubatie vermaal de monsters voorzichtig (zie figuur 1C). <ol><li> Met behulp van een 10 ml serologische pipet,pipet het monster op en neer 6-8 keer. Vermijd het genereren van overmatige luchtbellen. </li><li> Voeg 1000 ul pipet tip aan het eind van de pipet en vermaal nog eens 6-8 keer. </li><li> Sta resterende brokken naar de bodem van de buis. Verwijder het supernatant filter met de cellen nog steeds onderbroken door een 100 urn filter in een nieuwe 50 ml conische buis met het label &quot;Enzymatische dissociatie&quot; en bewaar op ijs. </li><li> Bij aanzienlijke weefselfragmenten blijven, voeg nog eens 10 ml HBSS met calcium en magnesium om de fragmenten en herhaal stappen 3.5.1 en 3.5.2. Filter deze laatste oplossing door een 100 pm filter in de &quot;enzymatische dissociatie&quot; tube. </li></ol></li><li> Centrifugeer de &quot;enzymatische dissociatie&quot; buis gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C) en blijft sucrosegradiënt centrifugatie. </li></ol> 5. sucrosegradiënt Centrifugeren <ol><li> Indien monsters nog steeds worden gesuspendeerd in oplossing, centrifugalege gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer weefsel in 20 ml koude HBSS zonder calcium en magnesium. Breng het volume tot 25 ml totaal met koud HBSS. </li><li> Voeg langzaam 25 ml 1,8 M sucrose-oplossing en keren de buis te mengen. Dit resulteert in een 0,9 M sucrose gradiënt. </li><li> Centrifuge zonder rem voor 10 min (800 x g, 4 ° C). Middels een centrifugering rem verloop verstoren en de opbrengst verlagen (zie figuur 1D voor een voorbeeld van een monster voor en na centrifugeren). </li><li> Zorgvuldig aspireren myeline puin en zoveel sucrose oplossing mogelijk. Was het monster door het toevoegen van 30 ml koud HBSS zonder calcium en magnesium en het mengen voorzichtig. Centrifugeer gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). </li></ol> 6. ACK Red Blood Cell Lysis <ol><li> Verwijder het wassen supernatant. Voeg 5 ml ACK-lysisbuffer en voorzichtig resuspendeer de celpellet, zwenken de buis gedurende 1 min bij kamertemperatuur. </li><li> Quench de llyse door toevoeging van 30 ml koude HBSS zonder calcium en magnesium. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). </li></ol> 7. Initial Cultuur Onderhoud <ol><li> Resuspendeer de uiteindelijke celpellet in 10-15 ml warm compleet TSM met groeifactoren en kwantificeren levensvatbare celdichtheid op een hemocytometer behulp van trypan blauw exclusie. LET OP: Het bereik van levensvatbare cellen varieert sterk afhankelijk van de omstandigheden van het weefsel donatie en kwantificatie kan moeilijk in dit vroege stadium te wijten zijn aan overgebleven cellulaire puin. In het ideale geval, gericht op een miljoen levende cellen per monster te hebben. In gevallen waarin buitensporige puin blijft plaat bij een lagere dichtheid in een T175 kolf. </li><li> Breng de laatste celsuspensies om een ​​nieuwe T75 kolf. Aar extra groeifactoren om de dag algemeen groeifactor te handhaven, en toezien op de ontwikkeling van tumorcellen neurosferen (zie figuur 1E en figuur 2). </li><li>Alternatief proces enzymatisch gedissocieerde cellen voor verdere analyse, waaronder flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering. </li><li> Na de ontwikkeling van neurosferen (die duurt gemiddeld 3-4 weken, maar varieert van een paar dagen zolang 2 maanden), omkeringsfilter het monster met een 100 um nylon zeef om de hoeveelheid afval te verminderen. NB: Het filtraat moet in de cultuur in het geval worden gehandhaafd levensvatbare enkele cellen of kleine bolletjes aanwezig zijn. </li><li> De integriteit en zuiverheid van de cultuur door het uitvoeren van DNA-vingerafdrukken tijdens passage, in vergelijking met de oorspronkelijke patiëntmonster. </li></ol>

<ol><li>Fisher, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinicopathologic+reappraisal+of+brain+stem+tumor+classification.+Identification+of+pilocystic+astrocytoma+and+fibrillary+astrocytoma+as+distinct+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities.</a> Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).</li>
<li>Johung, T. B., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma%3A+New+Pathophysiological+Insights+and+Emerging+Therapeutic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic.</a> Curr. Neuropharmacol. , (2016).</li>
<li>Cage, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility%2C+safety%2C+and+indications+for+surgical+biopsy+of+intrinsic+brainstem+tumors+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children.</a> Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).</li>
<li>Puget, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsy+in+a+series+of+130+pediatric+diffuse+intrinsic+Pontine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas.</a> Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).</li>
<li>Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+rethink+the+unthinkable%3A+Upfront+biopsy+of+children+with+newly+diagnosed+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+%28DIPG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Blood+Cancer%22%5BJournal%5D)">Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG).</a> Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).</li>
<li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paediatric+and+adult+glioblastoma%3A+multiform+%28epi%29genomic+culprits+emerge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge.</a> Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).</li>
<li>Jones, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+genetic+and+epigenetic+mechanisms+driving+paediatric+diffuse+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma.</a> Nat. Rev. Cancer. , (2014).</li>
<li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+landscape+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+and+pediatric+non-brainstem+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).</li>
<li>Fontebasso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+somatic+mutations+in+ACVR1+in+pediatric+midline+high-grade+astrocytoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).</li>
<li>Buczkowicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+diffuse+intrinsic+pontine+gliomas+identifies+three+molecular+subgroups+and+recurrent+activating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating.</a> Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).</li>
<li>Monje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-responsive+candidate+cell+of+origin+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+xenograft+mouse+model+of+diffuse+pontine+glioma+designed+for+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing.</a> J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).</li>
<li>Grasso, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+defined+therapeutic+targets+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nat. Med. , 1-10 (2015).</li>
<li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Orthotopic+Transplantation+of+Fresh+Surgical+Specimen+Preserves+CD133+%2BTumor+Cells+in+Clinically+Relevant+Mouse+Models+of+Medulloblastoma+and+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma.</a> Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).</li>
<li>Becher, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+radiation+and+perifosine+in+a+genetically+and+histologically+accurate+model+of+brainstem+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma.</a> Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).</li>
<li>Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+embryonic+stem+cells+to+model+pediatric+gliomas+with+H3.3K27M+histone+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation.</a> Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).</li>
<li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de snelle behandeling van post-mortem tumorweefsel donaties patiënt afgeleide celculturen ontwikkelen die kan worden gebruikt in een verscheidenheid van in vitro of in vivo experimenten. Vanwege de aard van het werken met autopsie monsters handhaven sample levensvatbaarheid moeilijk na. Verscheidene factoren, waaronder de post-mortem autopsie interval of de tijd die nodig is voor het transport van weefsel, worden zo beperkt mogelijk, maar vaak moeilijk te controleren. In onze ervaring, een postmortem interval van minder dan 6 - 8 uur (vanaf het moment van overlijden naar de tijd dat het weefsel wordt geplaatst in ijskoud scheepvaart en transport media) heeft de beste kans van de oprichting van een duurzame celcultuur opgeleverd. Het beste is om vervolgens het weefsel in het laboratorium ontvangt binnen 24 uur, en het verwerken van het voor de cultuur direct na ontvangst. Aangezien de locatie van deze zeldzame gevallen varieert sterk, ende kwaliteit van het weefsel ophalen stap de slaagkans sterk beïnvloedt, kan de logistiek van het uitvoeren van de autopsie uitdagend. In veel gevallen, om de 6-8 uren periode te kunnen realiseren, is het niet haalbaar om het weefsel oogst voeren op academisch centrum. In plaats daarvan, met een tissue recovery service op afroep om de tumor weefsel te herstellen op de begrafenis thuis in het kader van een IRB-goedgekeurde protocol is vaak meer opportuun voor weefselherstel. Het verkrijgen van geïnformeerde toestemming vooraf van de dood wordt aanbevolen en vergemakkelijkt de logistieke planning. Het voorbereiden van self-contained autopsie kits met duidelijke en gedegen instructies en steriel benodigdheden voor tissue retrieval (handschoenen, gordijnen, scalpels) wordt sterk aanbevolen. Bovendien, het vaststellen van duidelijke punten van de communicatie tussen de onderzoeker, patholoog, en rouwcentrum is van cruciaal belang. Zo moet de onderzoeker het protocol met de patholoog voor de autopsie bespreken en markeer voorkomende fouten. Deze fouten zijn microBIAL contaminatie (meestal gist) tijdens weefsel retrieval, het niet het schip door middel van &#39;s nachts / Verzending en het niet het monster op voldoende nat ijs schip in een thermoinsulated container. Tot slot raden we het gebruik van een deur-tot-deur-koeriersdienst voor verzending van het monster om het transport te minimaliseren. Zorg moet ook tijdens weefsel dissociatie worden genomen om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Bijvoorbeeld, het gebruik van media ontworpen om neuraal weefsel gezondheid te behouden voor transport (sluimerstand-A aangevuld met antibiotische / antimycotische) de kans op het genereren van een succesvolle kweek te verhogen. Het is ook belangrijk om het monster bij een lage temperatuur in het protocol te houden door steeds overbrengen van de monsters op ijs. Verzamelen zowel mechanische en enzymatische dissociatie fracties met tritureren minimaliseren kan protocol succes te vergroten, aangezien beide stappen traumatisch cellen. In onze ervaring, terwijl de meeste succesvolle culturen groeien van beide fractiesHebben we gevallen waarin slechts één van de twee preparaten opgenomen duurzame cultuur, mogelijk als gevolg van de delicate aard van deze monsters hadden. Een andere traumatische stap in het protocol is wrijven; een strategie die de mate van trituratie noodzakelijk kan verminderen is te zorgen voor de monsters grondig gemalen aan het begin van het preparaat. Andere voorbeelden van aspecten van het protocol bedoeld om het monster rentabiliteit te verbeteren onder meer het toevoegen van buffers (bijv HEPES) in het gehele protocol, dat is vooral van belang tijdens de enzymatische dissociatie. Een mogelijke wijziging van het protocol om cellevensvatbaarheid verder te verhogen is het verwijderen van de ACK rode bloedcellen lysisstap. In dit geval is vaak het nodig om een ​​ACK lysis stap uit te voeren tijdens de eerste week in kweek om rode bloedcellen te verwijderen. Een ander aspect van dit protocol kan worden aangepast is de eliminatie van myeline en celresten met een sucrose dichthy verloop. Specifiek andere strategieën die zijn gemeld levensvatbaarheid van de cellen van microgliacellen verbeteren zijn ook mogelijk bij deze stap, zoals een discontinue Percoll-dichtheidsgradiënt 18 of magnetische myeline verwijderen kralen. Tenslotte overschilderen oorspronkelijke weefsel dissociatie en het verschijnen van neurosferen varieert tussen monsters en kan variëren van een week tot een maand of meer. Aangezien de aanvankelijke kweken bevatten gewoonlijk een aanzienlijke mate van dode cellen en celresten, kan het lastig zijn om te bepalen of levensvatbare cellen blijven; de kweek moet worden gehandhaafd gedurende ten minste 4-8 weken (figuur 2). Een strategie voor het isoleren groeiende cellen uit het resterende vuil wordt hier gepresenteerd (bijvoorbeeld omgekeerde filtreren celgroepen en opnieuw uitplaten in vers medium). De beslissing over de vraag of door te gaan met een cultuur te handhaven is uiteindelijk een case-by-case beslissing op basis van factoren omliggende the autopsie (bijvoorbeeld een langdurige postmortem interval, problemen tijdens weefsel transport), het weefsel dissociatie (bijvoorbeeld overmatig bloed of puin), en hoe de sample verschijnt in de cultuur. Zodra een cultuur is gebracht, moet de identiteit worden bevestigd met behulp van DNA-vingerafdrukken short tandem repeat analyse of een soortgelijke werkwijze, vergelijken de kweek een monster van de oorspronkelijke tumor behouden hiervoor. We raden u aan regelmatig valideren van culturen door middel van DNA-fingerprinting om ervoor te zorgen dat er geen verontreiniging met andere culturen heeft plaatsgevonden, bijvoorbeeld elke 3-6 maanden. Het genereren van deze patiënt afgeleid DIPG culturen is een belangrijke stap in de succesvolle ontwikkeling van effectieve therapieën. De uitbreiding van de beschikbare-patiënt afgeleid DIPG culturen en xenograft modellen zullen van cruciaal belang voor het identificeren van de meest effectieve therapeutische strategieën en uiteindelijk overwinnen van deze verwoestende ziekte.

DIPG is een agressieve centrale zenuwstelsel maligniteit die ontstaat in het ventrale pons, meestal in het middenseizoen jeugd 1, 2. Ondanks uitgebreide klinische studies huidige behandelingen beperkt tot bestraling door tijdelijke verbetering of stabilisatie van de symptomen biedt en zich slechts mediane overleving met gemiddeld 3 maanden. Zelfs met radiotherapie, mediane overleving is slechts 9 maanden met 90% van de kinderen sterven aan de ziekte binnen 2 jaar na de eerste diagnose. Vanwege de infiltratieve aard van de tumor en de kritische functies van de hersenstam, chirurgische resectie niet mogelijk. Bovendien is in de Verenigde Staten, het verkrijgen chirurgische biopten voor DIPG historisch niet uitgevoerd 3, als histopathologische analyse heeft geen lopende rol in de begeleiding klinische behandeling en diagnose kan typisch door alleen neuroimaging. Zo is de beschikbaarheid van tumorweefsel fof studie is beperkt, het beperken van de inspanningen om het onderzoek naar kandidaat-medicijn moleculen en de onderliggende tumor biologie te voeren. Met name verbetering van beeldvormende en stereotactische technieken hebben geleid tot de ontwikkeling van veilige biopten van DIPG afgelopen jaren 4, die, in combinatie met vooruitgang in de moleculaire biologie hebben ons begrip van de ziekte getransformeerd. Op dit moment, meerdere klinische proeven met upfront biopsie en moleculaire profilering van DIPG te individualiseren behandeling plannen zijn aan de gang (NCT01182350, NCT02274987) 5. DIPG en andere pediatrische hooggradig glioom vertegenwoordigen onderscheiden ziekten van hun volwassen tegenhangers glioblastoma 6, 7 en dus getrouwe experimentele modellen van DIPG nodig zijn unieke pathofysiologie begrijpen ontdekken effectieve therapeutische strategieën. In de afgelopen jaren, pogingen gericht verkrijgen DIPG tumor tkwestie voor onderzoek bij de autopsie of, minder vaak, biopsie hebben ons begrip van en het vermogen om DIPG bestuderen revolutie. Genoombrede sequencing inspanningen bleek een terugkerende mutatie in de H3 histon familie 3A (H3F3A) en histon cluster 1, H3b (HIST1H3B), die het eerste voorbeeld van menselijke ziekte veroorzaakt door mutaties in histon coderende eiwitten 8, 9, 10, 11 . Verder is een subset van DIPGs drukt mutaties in het ACVR1 gen, die niet eerder zijn gerapporteerd bij kanker maar zijn identiek aan mutaties in de kindertijd aangeboren ontwikkelingsstoornis fibrodysplasia ossificans progressiva 8, 9, 10, 11. Als goed, de eerste patiënt afgeleid DIPG celculturen en orthotope xenograft models zijn inmiddels vastgesteld 1, 2, 12, 13, 14, evenals muismodellen door de directe xenotransplantatie van tumorcellen gevestigde immunodeficiënte muizen serial xenotransplantaten genereren 3, 14, 15. Initial drug discovery inspanningen met behulp van deze patiënt afgeleide modellen hebben geïdentificeerd veelbelovende nieuwe middelen voor klinische vertaling 4, 14 en hebben de basis gelegd voor ten minste één klinisch onderzoek (NCT02717455). Deze eerste stappen in de richting van de vooruitgang zijn slechts het begin, en tal van patiënt afgeleide weefselmonsters en cultuur modellen zal nodig zijn om subtypes van de ziekte te bepalen en ontwikkelen van de meest effectieve therapeutische strategieën. genetisch engineEred muismodellen van DIPG zal ook gemakkelijker studies die gericht zijn op het bevorderen van onze fundamentele begrip van de ziekte. Pogingen om genetische modellen voor DIPG genereren wordt geholpen door de fundamentele genomische studies hierboven besproken, maar momenteel een beperkt aantal opties beschikbaar. Een dergelijk model, dat histologisch vergelijkbaar hoogwaardige hersenstam glioom genereert, wordt de virale RCAS / tv-systeem aan PDGF-B overexpressie en Ink4a-ARF verlies rijden nestine-positieve cellen in de fossa posterior van neonatale muizen 5, 16. Een andere benadering omvat indient verscheidene zware DIPG geassocieerde mutaties (histone H3.3 K27M mutatie p53 verlies en PDGFRA activering) in neurale voorlopercellen afkomstig van menselijke embryonale stamcellen, die voldoende is om deze cellen tumorigene 6, 7, 17 maken. De combinatie van genetische methoden en patiënt-derived modellen zullen preklinische testen mogelijk te maken en bevorderen de ontwikkeling van effectieve therapieën. De uitdagingen DIPG onderzoek hierboven beschreven pakken, werd deze snelle obductieprotocol ontwikkeld patiënt afgeleide celculturen voor het onderzoek 8, 9, 10, 11, 12, 14 genereren. Het protocol is bedoeld om de levensvatbaarheid van het weefsel te beschermen en de kans op het genereren van duurzame culturen, ondanks de uitdagingen in verband met uitgebreide post-mortem intervallen en transport te maximaliseren. Bij succes geproduceerd, kunnen deze DIPG kweken worden gebruikt in volgende in vitro manipulaties en in vivo xenograft experimenten, waardoor evaluatie van potentiële therapeutische moleculen op patiënt afgeleide cellen.

<table><tbody><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with Calcium/Magnesium</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH (Collagenase/Dispase)</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimycotic</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement Minus Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Human PDGF-AA</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-16</td><td></td></tr><tr><td>Human PDGF-BB</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-18</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-146</td><td></td></tr><tr><td>Sterile scalpel blades</td><td>Bard Paker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Curved hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Sterile forceps</td><td>TWD Tradewinds</td><td>DF8988-5</td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>3M</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gloves</td><td>Kimberly Clark</td><td>1182307</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>100 micron mesh filter</td><td>Fisher</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Fisher</td><td>1495949A</td><td></td></tr></tbody></table>

een protocol voor snelle post-mortem cell culture of diffuse intrinsieke pontine glioom (dipg)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG) is een kindertijd hersenstam tumor die een universeel fatale prognose draagt. Omdat chirurgische resectie is geen haalbare behandelingsstrategie en biopsie wordt niet routinematig uitgevoerd, de beschikbaarheid van de patiënt monsters voor onderzoek is beperkt. Bijgevolg hebben de inspanningen om deze ziekte te bestuderen uitgedaagd door een gebrek aan trouwe ziekte modellen. Om hieraan te beschrijven we hier een protocol voor de snelle behandeling van post-mortem autopsie weefselmonsters teneinde duurzame patiënt afgeleide celcultuur modellen die kunnen worden gebruikt bij in vitro proeven of in vivo orthotope xenograft experimenten genereren. Deze modellen kunnen worden gebruikt om te screenen op mogelijke therapeutische doelwitten en fundamentele processen in pathobiological DIPG bestuderen. Dit protocol kan verder worden uitgebreid om te analyseren en te isoleren tumor micro-omgeving van de cellen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), die verdere analyse van gen ex maaktpression, eiwitexpressie of epigenetische modificaties van DNA bij de bulk cel of single cell niveau. Tenslotte kan dit protocol worden aangepast aan patiënt afgeleide culturen andere centrale zenuwstelsel tumoren genereren.

De beschreven protocol wordt samengevat als een vijf stappen workflow met afbeeldingen het weefsel bij verschillende bewerkingsstadia in figuur 1. Het monster wordt eerst verkregen door snelle steriele autopsie. Bij mechanische dissociatie wordt het weefsel fijngehakt tijdens het verwijderen van bloedvaten en hersenvliezen uit het monster, en gefiltreerd door een 100 um nylon zeef. Resterende weefsel fragmenten worden enzymatisch gedissocieerd in een opwarming oven. Vervolgens wordt afval verminderd door sucrosegradiënt centrifugatie, isoleren van een afzonderlijke laag van myeline van het monster. Bovendien ACK lysis zichtbaar vermindert de hoeveelheid rode bloedcellen in het monster. Tenslotte worden de cellen uitgeplaat in serum-vrij medium aangevuld met groeifactoren. Aanvullende Figuur 1 is een voorbeeld van de tumor bij autopsie. De tumor groeit als een diffuse infiltratie van de pons eend de aangrenzende gebieden van de hersenstam. Tijdens de steekproef voorbereidingen, moet klein ~ 1 cm x 1 cm stukjes worden gesneden en onmiddellijk in koud verzending media op ijs geplaatst. Figuur 2 toont verscheidene voorbeelden van hoe de monsters kan blijken uit de vroege stadia van het kweken van een duurzame cultuur. Aanvankelijk bedekt en vroege culturen (A, B) vaak niet te veel overlevende cellen bevatten. De vroegtijdige celclusters (C, D) vaak niet de mate van contrast doorgaans geassocieerd met neurosferen vertonen. Met name kan de duur van de tijd in de cultuur voorafgaand aan de verschijning van de cel clusters weken tot een paar maanden. Echter, de initiële passage van deze celgroepen, gecombineerd met reverse filtering van celgroepen, isoleren gezonde tumorcellen die kunnen bollen (F) vormen. Het filtraat (E) bevat meestal overgebleven puin; Toch raden we plating en onderhouden van het filtraat en monitoring voor<html> de ontwikkeling van celgroepen. Deze patiënt afgeleide monsters kunnen vervolgens in de cultuur voor meerdere passages (G, H) worden gehandhaafd. Figuur 3 toont het vermogen van deze cellen xenotransplantatie worden in muizen. In elk van deze gevallen werden de DIPG cellen getransfecteerd met GFP-Luciferase reporter te zien op de ontwikkeling van tumoren door middel van bioluminescentie (A). De tumoren kunnen histologisch worden onderzocht, bijvoorbeeld tumor engraftment (B) of expressie van specifieke markers (C) neemt. Deze in vivo modellen, samen met in vitro testen kunnen worden gebruikt om de effecten van verschillende geneesmiddelen of gen manipulaties beoordelen (bijvoorbeeld 8, 9, 10, 11, 14). les / ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Tissue Monsters in verschillende stadia van verwerking. (A) Verkrijgen van het monster door steriele autopsie procedures en s nachts de scheepvaart op nat ijs. (B) Van links naar rechts: (rij 1) buisjes met tumorweefsel in de scheepvaart media; verse weefsel in een 100 mm x 20 mm celkweek schotel; aanvankelijke hakken van het weefsel; (Rij 2) gedeeltelijk gehakt weefsel; verwijdering van de hersenvliezen en bloedvaten; uiteindelijke grootte van gehakt weefsel stukken. (C) Van links naar rechts: (rij 1) weefsel geïncubeerd op een roterende tafel in een 37 ° C oven; (Rij 2) aanwrijven van weefsel door een 1000 pi pipet tip bevestigd aan een 10 ml pipet; filtering van gedissocieerde weefsel door een 100 um nylon mesh filter. (D) Van links naar rechts: gedissocieerde weefsel gesuspendeerd in 0,9 M sucrose oplossing voorafgaand aan centrifugeren; gedissocieerde weefsel gescheiden over een sucrosegradiënt na het centrifugeren; een zichtbare laag of myeline puin bovenop de sucrosegradiënt; een uiteindelijke celpellet na ACK lysis en wassen. (E) De uiteindelijke steekproef kan in cultuur worden gebracht of worden gebruikt in andere downstream-analyses. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig2.jpg" /> Figuur 2. Beelden van primaire culturen en Early Passage Cells. (A - B) Culturen vergulde direct na dissociatie (SU-DIPG-XXX, A), of die nog niet gegroeid neurosferen (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) vroege verschijning van neurosferen in primaire SU-DIPG-XXVIII (C) en SU-DIPG-XXIX (D). (EF) Eerste doorgang van de primaire kweek van D met behulp van een 100 urn nylon filter, met de filtraat (E) en reverse filtraat (F) verzilverd. (G - H) Mature neurosferen uit de eerste passage van SU-DIPG-XXVII (G) en de derde doorgang SU-DIPG-XXV (H) groeien in kweek. Schaal bar = 200 micrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig3.jpg" /> Figuur 3. Patient afgeleid celkweken engraft en Form tumoren bij muizen. (A) Bioluminescentie beelden van vier verschillende patiënt afgeleide celkweken getransfecteerd met een GFP-Luciferase reporter. (B) sagittale doorsnede van een muis xenograft, tonen tumorcellen geënt in de muis pons. Groen: GFP, Red: Myelin basic protein. Schaal bar = 1 mm. (C) Voorbeeld immunofluoresimage centie tonen GFP tumorcellen geënt in een muis hersenen. Blauw: DAPI, Groen: GFP, Rood: IGF2R. Schaal bar = 40 micrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Aanvullende Figuur 1. Autopsie Voorbeeld van een Pontine Tumor. Onmiddellijke post-mortem uiterlijk van een diffuse intrinsieke pontine glioma. De tumor wordt weergegeven als een grote, myeline-rijke massa op het ventrale oppervlak van de pons. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">Klik hier om download dit beeld.</a>

Dit protocol beschrijft een methode voor de snelle verwerking van post-mortem diffuse intrinsieke pontijnse glioom monsters voor de oprichting van de patiënt afgeleide celcultuur modellen of directe karakterisering van tumor en micro-omgeving van de cellen.

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Het algemene doel van dit snelle post-mortem celkweekprotocol is het genereren van duurzame, van patiënten afgeleide celculturen van diffuus intrinsiek pontijn glioma om de experimenten te faciliteren die nodig zijn om DIPG te begrijpen en uiteindelijk effectieve therapieën te ontwikkelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de fundamentele biologie van en therapeutische strategieën voor diffuus intrinsiek pontijn glioma, zoals de vraag of bepaalde geneesmiddelen werkzaam zijn in verschillende van patiënten afgeleide culturen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het directe studie van de biologie van van patiënten afgeleide cellen mogelijk maakt.De implicaties van deze techniek reiken tot therapie voor DIPG, omdat het mogelijk maakt om verschillende therapeutische strategieën te testen over verschillende genetische subtypes van de ziekte heen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in DIPG, kan deze ook worden toegepast op andere ziekten, zoals andere pediatrische hooggradige gliomen, glioblastomen bij volwassenen of andere tumoren van het centraal zenuwstelsel. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek enige moeite hebben, omdat het lastig is om autopsie monsters op een efficiënte manier te verkrijgen en snel te verwerken.Steriliseer vóór de monstervoorbereiding de weefselkweekkap, samen met de schemessen, gebogen hemostaten en andere niet-steriele instrumenten, gedurende één uur onder UV-licht, en voer alle volgende stappen onder steriele omstandigheden uit. Plaats vervolgens het weefsel in een cellentestschaal met hoge wand van 100 millimeter bij 20 millimeter. Verwijder het resterende transportmedium en vervang dit door 10 tot 15 milliliter koud kweekmedium.Gebruik vervolgens gebogen hemostaten om een scheermesje vast te pakken en hak het weefsel fijn terwijl de bloedvaten of meninges worden verwijderd. De uiteindelijke weefselfragmenten moeten kleiner zijn dan één millimeter. Draag het weefsel daarna over naar een schone conische buis van 50 milliliter.Was de celkweekschaal met nog eens vijf milliliter koud kweekmedium en overbreng het monster naar de conische buis. Herhaal deze wasstap indien nodig om het resterende weefsel over te brengen. Tritureer het monster voorzichtig vier tot vijf keer met een serologische pipette van 10 milliliter.Laat grotere weefselfragmenten naar de bodem van de buis zakken. Indien nodig, centrifugeer het monster kort gedurende één minuut. Om de gedissocieerde fractie te verzamelen, verwijdert u het supernatant en filtert u dit door een 100-micron filter in een nieuwe, gelabelde conische buis van 50 milliliter met de naam Mechanische Dissociatie.Keer het filter om boven de oorspronkelijke conische buis en was het met kweekmedium om de weefselfragmenten terug te winnen. Centrifugeer vervolgens de mechanisch gedissocieerde fractie gedurende vijf minuten. Verwijder daarna het supernatant van de gepelletteerde mechanisch gedissocieerde fractie en resuspendeer het weefsel in koud kweekmedium.Als er meer dan vijf milliliter weefsel in de conische buis voor mechanische dissociatie zit, verdeel het weefsel dan over andere conische buizen van 50 milliliter, zodat geen enkele buis meer dan vijf milliliter weefsel bevat. Bewaar vervolgens de mechanisch gedissocieerde fractie op ijs tot de stap van sucrosegradiëntcentrifugatie. Centrifugeer in deze procedure de conische buis met de resterende weefselfragmenten gedurende vijf minuten.Verwijder daarna het supernatant en voeg de voorverwarmde enzymatische digestie-oplossing toe, zodanig dat er vijf milliliters digestie-oplossing aanwezig is voor elke ene milliliter weefsel. Sluit vervolgens het dopje van de conische buis af met laboratoriumfolie en incubeer de reactie op een rotator bij 37 °C gedurende 30 minuten. Tritureer de monsters na incubatie voorzichtig.Pipetteer het monster zes tot acht keer op en neer met een serologische pipet van 10 milliliter en voorkom dat er overmatig luchtbellen ontstaan. Bevestig vervolgens een pipetpunt van 1.000 microliter aan het uiteinde van de pipet en tritureer het monster nogmaals zes tot acht keer. Laat eventuele resterende klonten naar de bodem van de buis zakken.Verwijder vervolgens het supernatant met de nog gesuspendeerde cellen en filter dit door een 100-micron filter in een nieuwe, als Enzymatische Dissociatie gelabelde 50-milliliter conische buis en bewaar deze op ijs. Centrifugeer daarna de buis voor enzymatische dissociatie gedurende vijf minuten en ga door met de sucrose-gradiëntcentrifugatie. Als het monster nog steeds in oplossing is gesuspendeerd, centrifugeer het dan gedurende vijf minuten.Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer het weefsel in 20 milliliter koude HBSS zonder calcium en magnesium. Vul het volume daarna aan tot 25 milliliter met koude HBSS. Voeg langzaam 25 milliliter 1,8 molaire sucrose-oplossing toe en keer de buis om om te mengen.Dit resulteert in een 0,9 molair sucrosegradiënt. Centrifugeer de monster vervolgens 10 minuten zonder rembreuk. Aspireer voorzichtig het myeline-debris in zoveel mogelijk sucroseoplossing.Was vervolgens het monster door 30 milliliters koud HBSS zonder calcium en magnesium toe te voegen en voorzichtig te mengen. Centrifugeer het daarna gedurende vijf minuten. Verwijder bij deze procedure het wassupernatans.Voeg vijf milliliter ACK-lysebuffer toe en resuspendeer het celpellet voorzichtig door de buis gedurende één minuut bij kamertemperatuur te wervelen. Stop vervolgens de lyse door 30 milliliter koude HBSS zonder calcium en magnesium toe te voegen. Centrifugeer het mengsel daarna gedurende vijf minuten.Resuspendeer het uiteindelijke celpellet in 10 tot 15 milliliter warme complete TSM met groeifactoren en kwantificeer de levensvatbare celdichtheid op een hemocytometer met behulp van Trypanblauw-uitsluiting. Draag daarna de uiteindelijke celsuspensie over naar een nieuwe T75-kweekfles. Voeg om de dag extra groeifactoren toe om de algemene groeifactorwaarden op peil te houden en monitor de ontwikkeling van tumorcel-neurosferen.Hier zijn verschillende voorbeelden van hoe de monsters eruit kunnen zien, van de vroege stadia van de cultuur tot een stabiele cultuur. In het begin lijken geplaatste en vroege culturen vaak niet veel overlevende cellen te bevatten. Bovendien vertonen vroege celclusters vaak niet de mate van contrast die typisch wordt geassocieerd met neurosferen.Echter, de initiële passage van deze celclusters, gecombineerd met reverse filtering van celclusters, kan gezonde tumorcellen isoleren die in staat zijn om sferen te vormen. Het filtraat bevat doorgaans resterend debris. Deze patiëntafgeleide monsters kunnen vervolgens gedurende meerdere passages in cultuur worden gehouden.Zodra deze techniek beheerst is, kan deze in drie tot vier uur worden uitgevoerd indien correct gewerkt wordt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het monster bij elke stap koud wordt gehouden, behalve tijdens de enzymatische dissociatie, en om traumatische behandeling van het monster te minimaliseren. Na deze procedure kunnen aanvullende studies worden uitgevoerd, zoals in vitro drugscreening of orthotope xenografting, om daaropvolgende vragen over de pathobiologie van DIPG te beantwoorden.Na de ontwikkeling heeft deze kweektechniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de pediatrische neuro-oncologie om nieuwe therapeutische wegen te verkennen voor kinderen met DIPG. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u protocollen voor snelle post-mortem celkweek op hersentumorstalen uitvoert. Vergeet niet dat werken met menselijk weefsel gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen en een steriele techniek, altijd moeten worden toegepast.

a-protocol-for-rapid-post-mortem-cell-culture-diffuse-intrinsic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video demonstrates the process of isolating and culturing glial progenitor cells from diffuse intrinsic pontine glioma, or DIPG-affected brainstem tissue. Glial cells isolated from tumor tissue via an enzymatic digestion are cultured in a neurobasal medium, which promotes their growth and the development of free-floating neurospheres.

Isolating and Culturing Cells from Diffuse Intrinsic Pontine Glioma

Kwaadaardige gliomen vormen een heterogene groep van zeer infiltratieve gliane neoplasmata met duidelijke klinische en moleculaire kenmerken. Primaire orthotopische xenograften heroveren de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypes in preklinische diermodellen.

Primaire orthotopische glioom xenograften recapituleren infiltratieve groei en isocitraat dehydrogenase I mutatie

Protocol voor vermeerdering van gedissocieerde hoogwaardige glioom chirurgische specimens in serumvrij neurosfeermedium om te selecteren voor cellen met kankerstamcelfenotype. Voor specimens die niet als neurosferen groeien, wordt een alternatief protocol voorgesteld. Een paraffine-inbeddingstechniek voor het behoud van de 3D-neurosfeerarchitectuur voor immunocytochemie wordt beschreven.

Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Hier presenteren we een ex-vivo gemengd monolaag cultuur systeem voor de studie van Human glioom Cell (HGC) migratie in real-time. Dit model biedt de mogelijkheid om interacties tussen Hgc's en zowel myelinehoudende als niet-myelinehoudende axonen in een gecompartimenteerde kamer te observeren.

Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen

Dit werk beschrijft de ontwikkeling van flexibele interdigitated elektroden voor implementatie in 3D hersentumormodellen, namelijk in vitro cultuur, in ovo model en in vivo murine  model. De voorgestelde methode kan worden gebruikt om de effecten van gepulseerde elektrische velden op tumoren op verschillende niveaus van complexiteit te evalueren.

Flexibele organische elektronische apparaten voor gepulseerde elektrische veldtherapie van glioblastoom

Deze studie introduceert een geautomatiseerde methode om van patiënten afgeleide glioblastoom 3-dimensionale organoïden te genereren met behulp van een weefselhakselaar. De methode biedt een geschikte en effectieve aanpak om dergelijke organoïden te verkrijgen voor therapeutisch onderzoek.

Ex vivo van patiënten afkomstige glioomorganoïden kweken met behulp van een weefselhakselaar

We presenteren een nieuwe benadering voor twee-fotonmicroscopie van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide-nanodeeltjes aan glioblastoom in een muismodel.

Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

IDH1-mutant diffuse laaghangstroomgliomen zijn zeldzame tumoren die moeilijk te kweken zijn. We introduceren een eenvoudige, niet-enzymatische explant-methode die de expressie van IDH1-mutante eiwitten behoudt en culturen maandenlang in stand houdt. Belangrijk is dat deze techniek werkt met diepvriesgeconserveerde tumoren en een waardevolle bron biedt voor glioomonderzoek.

Een protocol voor explantaatculturen van IDH1-mutant diffuse laaggradige gliomen

Leer een snel post-mortem celcultuurprotocol voor diffuse intrinsieke pontine glioom (DIPG) om patiënt-afgeleide celculturen te genereren. Deze methode ondersteunt onderzoek naar tumorbiologie en therapeutische strategieën.

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Meer video's verkennen