Name: Recombinante α-β - en γ-Synucleins stimuleren eiwit fosfatase 2A katalytische subeenheid activiteit in cel gratis testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Leer hoe recombinante α-, β- en γ-synucleinen de PP2Ac-activiteit stimuleren in celvrije assays met een colorimetrische methode. α-synucleine toont de hoogste specificiteit voor PP2Ac in muizenhersenen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs waarderen de inspanningen van de leden van de voorafgaande laboratorium Kendra Mackett, Sandra Slusher en Jie Chen die gewerkt aan het optimaliseren van de methode. De auteurs bedanken ook de National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso wetenschappelijke activiteit onderzoek Project (SARP), Lizanell en Colbert Coldwell Foundation, meerdere systeem atrofie coalitie, Hoy familie onderzoek, en Anna Mae Doyle Gift fondsen voor financiële ondersteuning van dit onderzoek.

1. bereiding van Buffers en reagentia
<ol><li>
Voorbereiding van p-nitrofenyl fosfaatbuffer (pNPP)
	<ol>
<li>50 mL pNPP buffer als volgt voorbereiden.</li>
		<li>Weeg 0.30285 g Tris base (Zie de Tabel van materialen) en los het op in 25 mL ultrazuiver gedeïoniseerd water.<ol>
<li>Voeg 41.6 µL van 120 mM CaCl2. Aanpassen op pH 7,0 met 1 M HCl en breng het volume van de definitieve oplossing aan met ultrazuiver gedeïoniseerd water 50 mL.</li>
			<li>Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl2, pH 7.0.</li>
			<li>PNPP buffer bij 4 oC. opslaan</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Malachiet groen oplossingen, de volgende opstellen.
	<ol>
<li>Oplossing A voorbereiden door 32.8 mL geconcentreerde HCl toe te voegen aan 67.2 mL ultrazuiver gedeïoniseerd water om een 4 M HCl oplossing te maken. Opmerking: Malachiet oplossing is bereid in een zuurkast gebruik van wegwerphandschoenen, gezichtsmasker en veiligheidsbril.</li>
		<li>Bereiden van oplossing B door weging van 4,2 g ammoniummolybdaat en toe te voegen aan 95,8 mL oplossing A.</li>
		<li>Bereid de oplossing C door weging uit 0.045 g Malachiet groen oxalaat zout en het toevoegen van ultrazuiver gedeïoniseerd water om het totale eindvolume tot 100 mL.</li>
		<li>Bereid de oplossing D door het mengen van oplossingen B en C bij (v/v)-breedteverhouding van 1:3, roer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>D van de oplossing wordt gefiltreerd door een 0,22 µm porie grootte nitrocellulose membraan filter eenheid met een 50 mL injectiespuit.</li>
		<li>Bewaren bereid Malachiet oplossing bij 4 oC beschermd tegen licht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van activator
	<ol>
<li>Ter voorbereiding van een 1% Tween-20 oplossing, Pipetteer 10 µL van tween-20 in 990 µL van ultrazuiver gedeïoniseerd water (v/v) en vervolgens tot de tween 20 vortex volledig lost.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van de werkoplossing voor Malachiet groen tween-20 (MGT).
	<ol>
<li>Meng de activator (stap 1.3) met de Malachiet groen-oplossing (oplossing D, stap 1.2.5) in een verhouding van 1:100 (b.v. 1 µL activator tot 99 µL Malachiet groen oplossing).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van threonine phosphopeptide (KRpTIRR) (pT) substraat.
	<ol>
<li>Voeg ter voorbereiding van een 2 mM voorraad, plaats een flesje phosphopeptide 1 mg op ijs, 550 µL van ultrazuiver gedeïoniseerd water en vortex zachtjes te ontbinden.<ol>
<li>~ 10 aliquots maken en opslaan van pT bij-20oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Synuclein voorbereiding
	<ol>
<li>Synucleins in een zuurkast gebruik van wegwerphandschoenen, gezichtsmasker en veiligheidsbril voor te bereiden.</li>
		<li>Resuspendeer 1 mg van recombinante synuclein in 1 mL ultrazuiver gedeïoniseerd water voor een eindconcentratie van 1 mg/mL.</li>
		<li>Vortex zachtjes te ontbinden en ijs opleggen.</li>
		<li>50 µL aliquots bereiden en bewaren bij-80 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opstelling van fosfaat normen
	<ol>
<li>De stockoplossing van 0.1 mM fosfaat als volgt voorbereiden.<ol>
<li>Weeg 0.1361 g KH2PO4 en breng in een bekerglas met 80 mL ultrazuiver gedeïoniseerd water. Voeg een roer bar en een mix te ontbinden. Alle van de oplossing overbrengen in een gegradueerde cilinder en brengen het uiteindelijke totale volume met ultrazuiver gedeïoniseerd water tot 100 mL.</li>
			<li>Filtreer de volledige oplossing door een 0,22 µm porie grootte nitrocellulose membraan filter eenheid met een 50 mL injectiespuit; de eindconcentratie is 10 mM.</li>
			<li>Verdun de 1:100 oplossing (10 mM); de eindconcentratie is 0.1 mM fosfaat (PO4) moet worden gebruikt voor assay normen.</li>
			<li>Opslaan van de stockoplossing van fosfaat op 4 oC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zie tabel 1 voor het beperken van verdunningen gebruikt om PO4 normen met een totale eindvolume van 1250 µL, elke. Voeg de juiste hoeveelheid fosfaat en ultrapure gedeïoniseerd water 1,5 mL buizen volgens tabel 1.<ol>
<li>Winkel bereid PO4 normen bij-20 oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="7">Fosfaat normen</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1 mM PO4 oplossing (mL)</td>
			<td>0</td>
			<td>75</td>
			<td>150</td>
			<td>300</td>
			<td>600</td>
			<td>1.200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ultrazuiver gedeïoniseerd water (mL)</td>
			<td>1.250</td>
			<td>1,175</td>
			<td>1100</td>
			<td>950</td>
			<td>650</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eindconcentratie van PO4 [pmol]</td>
			<td>0</td>
			<td>150</td>
			<td>300</td>
			<td>600</td>
			<td>1.200</td>
			<td>2400</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Fosfaat normen.
2. PP2A Assay in reactie op de recombinante Synucleins
Opmerking: Het totale eindvolume voor elke reactie wordt 60 µL, zodat de experimentator moet op passende wijze aangepast aan de omvang van de synucleins gebruikt voor elk monster de aanvankelijke omvang van de buffer van de pNPP aanpassen. In de meeste gevallen zullen de omvang van de buffer van de pNPP tussen 40 en 44 µL.
<ol><li>
Elke PP2Ac reactie als volgt voorbereiden.
	<ol>
<li>In een buis 1,5 mL, voeg 39 µL van pNPP buffer en plaats op het ijs.</li>
		<li>Voeg 1 µL (105 ng/µL of 0.0007 U/µL) van menselijke recombinante PP2Ac (rPP2Ac).</li>
		<li>Voeg 4 µL van 0, 1.5, 7.5, 15 of 30 µM synucleins te rPP2Ac in de buffer van de pNPP voor de eindconcentraties van 0, 0.1, 0.5, 1.0 en 2,0 µM en Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten op een roterende eenheid; het eindvolume zullen 60 µL.</li>
		<li>Na 30 min, verhuizen monsters naar ijs en voeg 16 µL van 2 mM pT substraat.</li>
		<li>Incubeer ieder PP2A assay mengsel gedurende 10 minuten staan bij 30 ° C in een waterbad met intermitterende schudden.</li>
		<li>Een 96-wells-plaat van platte bodem, toevoegt 25 µL van elk PO4 standaard (0, 150, 300, 600, 1200 en 2400 pmol) in dubbele putten van laag naar hoog.</li>
		<li>Vervolgens voegt 25 µL van elk experimentele monster (PP2A assay ± synuclein), bereid in stappen 2.1.1 tot en met 2.1.6, te dupliceren putjes op de dezelfde 96-wells-plaat.</li>
		<li>Voeg vervolgens 75 µL van MGT werkoplossing aan elk putje met normen en monsters.</li>
		<li>Laat de plaat bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Observeer een kleur wijzigen in monsters met meetbare verschillen in fosfaat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fotometrische analyse
<ol><li>De 96-wells-plaat met normen en een spectrofotometrische afleesapparaat met de golflengte ingesteld op 630 nm29monsters analyseren.</li>
	<li>Uitzetten van de curve van de extinctie geproduceerd (monsters lezen op 630 nm) en merk op dat het lineair tot 2.400 pmol concentratie van PO4blijft.</li>
</ol>

<ol><li>Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+alpha-%2C+beta-+and+gamma-synucleins+in+the+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS.</a> Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).</li>
<li>Iwai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+precursor+protein+of+non-A+beta+component+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+is+a+presynaptic+protein+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system.</a> Neuron. 14 (2), 467-475 (1995).</li>
<li>Irizarry, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+precursor+protein+of+the+non-A+beta+component+of+senile+plaques+%28NACP%29+in+the+human+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central nervous system.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 55 (8), 889-895 (1996).</li>
<li>Shibayama-Imazu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+distribution+and+developmental+change+of+neuron+specific+14+kDa+protein+%28phosphoneuroprotein+14%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue distribution and developmental change of neuron specific 14 kDa protein (phosphoneuroprotein 14).</a> Brain Res. 622 (1-2), 17-25 (1993).</li>
<li>Nakajo, S., Shioda, S., Nakai, Y., Nakaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphoneuroprotein+14+%28PNP+14%29+and+its+mRNA+expression+in+rat+brain+determined+by+immunocytochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphoneuroprotein 14 (PNP 14) and its mRNA expression in rat brain determined by immunocytochemistry and in situ hybridization.</a> Brain Res Mol Brain Res. 27 (1), 81-86 (1994).</li>
<li>Buchman, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persyn%2C+a+member+of+the+synuclein+family%2C+has+a+distinct+pattern+of+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system.</a> J Neurosci. 18 (22), 9335-9341 (1998).</li>
<li>George, J. M., Jin, H., Woods, W. S., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+protein+regulated+during+the+critical+period+for+song+learning+in+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the zebra finch.</a> Neuron. 15 (2), 361-372 (1995).</li>
<li>Withers, G. S., George, J. M., Banker, G. A., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+localization+of+synelfin+%28synuclein%2C+NACP%29+to+presynaptic+terminals+in+cultured+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Delayed localization of synelfin (synuclein, NACP) to presynaptic terminals in cultured rat hippocampal neurons.</a> Brain Res Dev Brain Res. 99 (1), 87-94 (1997).</li>
<li>Greten-Harrison, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphabetagamma-Synuclein+triple+knockout+mice+reveal+age-dependent+neuronal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">alphabetagamma-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19573-19578 (2010).</li>
<li>Benskey, M. J., Perez, R. G., Manfredsson, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+alpha+synuclein+to+neuronal+survival+and+function+-+Implications+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The contribution of alpha synuclein to neuronal survival and function - Implications for Parkinson's Disease.</a> J Neurochem. , (2016).</li>
<li>Perez, R. G., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Could+a+loss+of+alpha-synuclein+function+put+dopaminergic+neurons+at+risk%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk?</a> J Neurochem. 89 (6), 1318-1324 (2004).</li>
<li>Lou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+129+phosphorylation+reduces+the+ability+of+alpha-synuclein+to+regulate+tyrosine+hydroxylase+and+protein+phosphatase+2A+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 285 (23), 17648-17661 (2010).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Synucleins+in+the+Mammalian+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22JARO%22%5BJournal%5D)">Localization of Synucleins in the Mammalian Cochlea.</a> JARO. 9 (4), 452-463 (2008).</li>
<li>Guardia-Laguarta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+Is+Localized+to+Mitochondria-Associated+ER+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein Is Localized to Mitochondria-Associated ER Membranes.</a> J Neurosci. 34 (1), 249-259 (2014).</li>
<li>Shibayama-Imazu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+PNP+14+%28beta-synuclein%29+in+neuroendocrine+tissues%3A+localization+in+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Distribution of PNP 14 (beta-synuclein) in neuroendocrine tissues: localization in Sertoli cells.</a> Mol Reprod Dev. 50 (2), 163-169 (1998).</li>
<li>Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (7), 492-501 (2001).</li>
<li>Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Lewy+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">100 years of Lewy pathology.</a> Nat Rev Neurol. 9 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Alerte, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+aggregation+alters+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+and+immunoreactivity%3A+lessons+from+viral+transduction+of+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein aggregation alters tyrosine hydroxylase phosphorylation and immunoreactivity: lessons from viral transduction of knockout mice.</a> Neurosci Lett. 435 (1), 24-29 (2008).</li>
<li>Peng, X., Tehranian, R., Dietrich, P., Stefanis, L., Perez, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+activation+of+protein+phosphatase+2A+reduces+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+dopaminergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3523-3530 (2005).</li>
<li>Perez, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha-synuclein+in+the+regulation+of+dopamine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis.</a> J Neurosci. 22 (8), 3090-3099 (2002).</li>
<li>Porras, J. L., Perez, R. G. Ch. III. <a target="_blank" href="http://www.academia.edu/28970880/POTENTIAL_CONTRIBUTION_OF_%CE%91LPHA-SYNUCLEIN_DYSREGULATION_TO_PARKINSONS_DISEASE_PATHOLOGY">Nova Publishers - Alpha-Synuclein</a>. Kanowitz, H. C., Polizzi, M. , NOVA Science Publishers. 51-70 (2014).</li>
<li>Tehranian, R., Montoya, S. E., Van Laar, A. D., Hastings, T. G., Perez, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+inhibits+aromatic+amino+acid+decarboxylase+activity+in+dopaminergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein inhibits aromatic amino acid decarboxylase activity in dopaminergic cells.</a> J Neurochem. 99 (4), 1188-1196 (2006).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy-like+aggregation+of+alpha-synuclein+reduces+protein+phosphatase+2A+activity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lewy-like aggregation of alpha-synuclein reduces protein phosphatase 2A activity in vitro and in vivo.</a> Neuroscience. 207, 288-297 (2012).</li>
<li>Geng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+binds+the+K%28ATP%29+channel+at+insulin-secretory+granules+and+inhibits+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein binds the K(ATP) channel at insulin-secretory granules and inhibits insulin secretion.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 300 (2), E276-E286 (2011).</li>
<li>Farrell, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-motor+parkinsonian+pathology+in+aging+A53T+alpha-synuclein+mice+is+associated+with+progressive+synucleinopathy+and+altered+enzymatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Non-motor parkinsonian pathology in aging A53T alpha-synuclein mice is associated with progressive synucleinopathy and altered enzymatic function.</a> J Neurochem. 128 (4), 536-546 (2014).</li>
<li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A%3A+a+highly+regulated+family+of+serine%2Fthreonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochem J. 353 (Pt 3), 417-439 (2001).</li>
<li>Wlodarchak, N., Xing, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP2A+as+a+master+regulator+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+reviews+in+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PP2A as a master regulator of the cell cycle.</a> Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 51 (3), 162-184 (2016).</li>
<li>George, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synucleins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The synucleins.</a> Genome Biol. 3 (1), (2002).</li>
<li>Fathi, A. R., Krautheim, A., Lucke, S., Becker, K., Juergen Steinfelder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonradioactive+technique+to+measure+protein+phosphatase+2A-like+activity+and+its+inhibition+by+drugs+in+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nonradioactive technique to measure protein phosphatase 2A-like activity and its inhibition by drugs in cell extracts.</a> Anal Biochem. 310 (2), 208-214 (2002).</li>
<li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antiaggregation+gene+therapy+strategy+for+Lewy+body+disease+utilizing+beta-synuclein+lentivirus+in+a+transgenic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">An antiaggregation gene therapy strategy for Lewy body disease utilizing beta-synuclein lentivirus in a transgenic model.</a> Gene Ther. 11 (23), 1713-1723 (2004).</li>
<li>Hashimoto, M., Rockenstein, E., Mante, M., Mallory, M., Masliah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Synuclein+inhibits+alpha-synuclein+aggregation%3A+a+possible+role+as+an+anti-parkinsonian+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">beta-Synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation: a possible role as an anti-parkinsonian factor.</a> Neuron. 32 (2), 213-223 (2001).</li>
<li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine%2Fthreonine+protein+phosphatase+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 18, (2010).</li>
<li>Anwar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+alterations+to+the+nigrostriatal+system+in+mice+lacking+all+three+members+of+the+synuclein+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family.</a> J Neurosci. 31 (20), 7264-7274 (2011).</li>
<li>Vargas-Medrano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+FTY720-based+compounds+stimulate+neurotrophin+expression+and+phosphatase+activity+in+dopaminergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel FTY720-based compounds stimulate neurotrophin expression and phosphatase activity in dopaminergic cells.</a> ACS Med Chem Lett. 5 (7), 782-786 (2014).</li>
<li>Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwingle%2C+M+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).</li>
</ol>

Dr. Perez was een lid van de faculteit in de afdeling Neurologie aan de Universiteit van Pittsburgh School of Medicine vanaf 1999 – 2011.

Deze Malachiet groen-assay met pT werd gebruikt voor het meten van PP2Ac activiteit, omdat het eenvoudiger uit te voeren dan de klassieke methode die gebruikmaakt van 32P-gelabelde substraten. Een ander voordeel van deze bepaling over radioactieve testen is dat radio-isotopen sommige risico en kunnen duur, met name 32P-gelabelde moleculen dat korte halfwaardetijd, die beperkt het aantal tests een uitvoeren kunt voordat reagentia verlopen. Met behulp van Malachiet groen in plaats van radioactiviteit elimineert de noodzaak om te beschikken over 32afval P. Malachiet groen tests zijn ook erg gevoelig bij het meten van de activiteit van serine/threonine phosphatases in vergelijking met een andere colorimetrische bepaling die gebruikmaakt van het substraat p-nitrophenylphosphate (pNPP), die is niet-selectieve als het kan worden gedefosforyleerd door een breed aantal enzymen32.
Commerciële Malachiet groen kits voor het meten van de PP2A activiteit hebben al enige tijd beschikbaar en voorheen werden gebruikt in het laboratorium. Bij het doen van veel Malachiet groen testen, werd deze kits echter onbetaalbaar. Bovendien, commerciële kits voor PP2A activiteit zijn stabiel slechts voor één jaar, terwijl de vorm hebben van reagentia beschikbaar in poedervorm en met correcte opslag, over beschikbaar assay-onderdelen die voor langere tijd structureel stabiel zijn.
Voor het testen van bSyn en gSyn, werd aSyn gebruikt als positieve controle ter stimulering van PP2Ac activiteiten en om te bepalen van de hoeveelheid PP2Ac die nodig zijn voor het testen, en ook om te bevestigen dat de resulterende gegevens op de schaal met de standaard curve (150-2400 pmol van PO4 blijven ). Het is opmerkelijk dat als aSyn PP2Ac stimuleert te sterk, al is de reactie meestal lineaire, gegevens zal afgaan op schaal en chemicaliën in de oplossing MGT neerslaan, waardoor het onmogelijk om te meten van de juiste bedragen van vrijgegeven gratis-PO4 met een plaat lezer.
Gezien het feit dat aSyn draagt bij aan PP2Ac activiteit in vivo en in vitro12,19,21,23,25, en dat alle synucleins hebben aanzienlijke homologie, het was geweest veronderstelde dat alle familieleden van de synuclein mei zitten kundig voor stimuleren van PP2Ac in cel gratis testen. Met behulp van de colorimetrische bepaling beschreven hier, bleek het dat inderdaad, alle drie recombinant synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) gestimuleerd PP2Ac activiteit, verhogen van de mogelijkheid dat alle drie synucleins soortgelijke functies in het zenuwstelsel vervullen kan. Echter, brain van Parkinson of dementie met Lewy Body gevallen hebben minder PP2Ac activiteit in weefsels met sterk geaggregeerde aSyn23. Muis weefsels herbergen Lewy body-achtige pathologie vertonen ook verminderd PP2Ac activiteit25. Dit, en nieuwe gegevens in Figuur 3 alsmede voorafgaande gegevens van aSyn knock-out muizen12, raden dat noch bSyn, noch gSyn meestal kan compenseren voor het verlies van oplosbare aSyn in de hersenen, of anders dat deze synuclein homologen kunnen niet koppelen met PP2Ac zo sterk als aSyn zoals aangegeven (Figuur 3). De Atlas van de hersenen Allen toont colocalization van alle drie synuclein mRNAs in vele hersengebieden, en hoewel triple synuclein knock-out muizen gegenereerde9,33, PP2Ac activiteit niet is beoordeeld in dat model zijn geweest. Interessant, aSyn die op Ser129 is phosphorylated door Polo-achtig kinase 2, is minder goed in staat om te activeren PP2Ac12, maar bewijs hieronder voor bSyn suggereren dat bSyn fosforylering is onwaarschijnlijk om de impact van de PP2Ac activiteit, zoals zeer weinig bSyn kwam met PP2Ac in de hersenen van de muis (Figuur 3). Samen genomen, blijkt uit de gegevens dat de endogene PP2Ac activiteit modulatoren, zoals aSyn, waarschijnlijk aan wellness- en ziekte bijdragen.
Het protocol hier geschetst is een eenvoudige maar toch krachtige techniek om te bepalen van het vermogen van PP2Ac om de dephosphorylate van een phosphopeptide substraat in reactie op de verschillende behandelingen. Deze zelfde methodologie kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te testen van de andere PP2Ac-activators, zoals Ceramiden, alsmede mogelijke nieuwe therapeutics34, of om de impact van PP2Ac remmers in vitro. Het is ook belangrijk erop te wijzen dat soortgelijke testen kunnen het meten van de activiteit van PP2Ac dat heeft op zodanige wijze geïsoleerd door 1 d 6 immunoprecipitation van cel extracten of lichaamsweefsel, zoals hiervoor is beschreven door de auteurs12,19, 25. toekomst toepassingen voor de Malachiet groen assay bestaan buiten het meten van de PP2Ac activiteit, zoals ATP activiteit kan ook worden bepaald met behulp van een dergelijke bepaling.
Opmerking, een standaard curve moet worden gegenereerd elke keer voor elke onafhankelijke PP2Ac assay. Het is verplicht om ervoor te zorgen dat alle gebruikte reagentia fosfaat gratis, zoals gratis fosfaten kunstmatig verhogen van achtergrond signaal en foutieve resultaten opleveren. Op de dag van de test is het essentieel te bereiden genoeg verse MGT oplossing voor alle monsters worden bepaald. Ook is MGT alleen goed de dag dat het is gemaakt en heeft de neiging te precipiteren na een paar uur. PP2Ac gekocht bij een leverancier moet worden aliquotted en opgeslagen bevroren spoedig nadat het is ontvangen ter voorkoming van bevriezing dooi cycli die haar activiteiten te verminderen. Zoals andere phosphatases kunnen de pT substraat (bv PP1 en PP535), dephosphorylate bij het analyseren van extracten van de cel of het weefsel in die PP2Ac heeft niet op zodanige wijze geïsoleerd door immunoprecipitation, monsters via kolommen te verwijderen gratis fosfaten worden doorgegeven en specifieke remmers van phosphatases moeten worden gebruikt ter bevestiging fosfatase specificiteit, als eerder beschreven18.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55361/recombinant-synucleins-stimulate-protein-phosphatase-2a-catalytic">Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays</a>
One of the authors&#39; names was corrected from:
Brian Marcus
to:
Brian S. Marcus

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55361/recombinant-synucleins-stimulate-protein-phosphatase-2a-catalytic">Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays</a>

Erratum: Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

Studies die vaststelling van de verdeling van de synucleins in hersenen en ruggenmerg Toon dat alle drie synucleins zijn verrijkt in zenuwweefsel, hoewel verschillende patronen van lokalisatie geweest gerapporteerd1. Bijvoorbeeld, aSyn is meest overvloedig op presynaptische sites in de hersenschors en basale ganglia2,3, bSyn heeft een meer uniforme verdeling in hersenen en ruggenmerg4,5, en gSyn is meer overvloedig in het ruggenmerg en perifere ganglia6. Hoewel sommige embryonale expressie van alle synucleins optreden kan, worden de drie homologen overvloediger gedurende de neonatale periode4,5,6,7,8. Opmerkelijk, gegevens van synuclein triple knock-out muizen, blijkt dat het verlies van alle drie synucleins veroorzaakt leeftijd begin neuronale dysfunctie9, ondersteunende functies van de belangrijke synuclein in het centrale zenuwstelsel (CNS)10, 11. het is nog niet bekend als de synuclein triple knock-out muizen wijzigingen in PP2Ac distributie of activiteit weergeven. Gegevens uit één synuclein knock-out muizen blijkt dat verlies van aSyn alleen kunnen aanzienlijk verminderen PP2Ac activiteit in de hersenen12is. Naast de CNS lokaliseren alle synucleins aan andere weefsels in het lichaam13,14,15.
Vanwege haar gevestigde genetische linksnaar neurodegeneratie16,17, is aSyn tot de beste studeerde van de drie synucleins. Het laboratorium Perez heeft lang gewerkt om te definiëren van normale functionele activiteiten van aSyn, vooral in de CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 en meer recentelijk in perifere weefsels24,25. Daaronder was de ontdekking dat aSyn speelt een belangrijke regelgevende rol in stimulerende PP2Ac activiteit19. PP2A activiteit draagt sterk bij tot normale hersenfunctie, waaronder voor de regulering van dopamine productie26. De holoenzyme van de PP2A bestaat uit drie onafhankelijke subeenheden, de katalytische C subeenheid, PP2Ac, een steiger A-subunit en van verscheidene verschillende regelgevende/targeting B subeenheden die lokaliseren van PP2A aan specifieke subcellular microdomains helpen, waardoor PP2A functionele diversiteit27. Wijst erop dat aSyn interacties met PP2Ac tot haar fosfatase activiteit in vitro en in vivo12,19,21,23bijdragen, 25. Wanneer aSyn hoopt zich op in de eiwit-aggregaten, net zoals wanneer Lewy vorm binnen neuronen van de ziekte van Parkinson en dementie met Lewy organen (DLB) organen, weefsels met geaggregeerde aSyn23,25van de activiteit van de PP2Ac zijn afgenomen, wanneer niveaus van oplosbare aSyn afnemen. Gezien het feit dat alle drie synucleins significante homologie28 hebben (aSyn deelt 66% identiteit met bSyn en 56% met gSyn) en die aSyn draagt bij aan de activering van de PP2Ac, het was veronderstelde dat alle leden van de familie synuclein eiwit mei zitten kundig verhogen PP2Ac activiteit, ten minste in vitro. Om te beoordelen dit, werd PP2Ac activiteit in reactie op de recombinante aSyn, bSyn en gSyn met behulp van een eenvoudige colorimetrische bepaling, gemodelleerd naar de methode van Fathi et al. gemeten 29. deze methode en de nieuwe bevindingen zijn hierin gedetailleerd.

<table><tbody><tr><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T15003</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (calciumchloride)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Concentrated HCl&nbsp;&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>9535-33</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniummolybdaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1343</td><td></td></tr><tr><td>Malachietgroenoxalaat zout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6880</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Threoninefosfopeptide (KRpTIRR)</td><td>New England peptide LLC</td><td>BP12-011</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (kaliumfosfaat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan PP2A C-subunit</td><td>Cayman Chemical&nbsp;</td><td>10011237</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan &alpha;-synucleïne</td><td>rPeptide</td><td>S-1001-2</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan &beta;-synucleïne</td><td>rPeptide</td><td>S-1003-2</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan &gamma;-synucleïne</td><td>rPeptide</td><td>S-1007-2</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac 1D6 antilichaam</td><td>Millipore</td><td>05-421</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac antilichaam</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-92217</td><td></td></tr><tr><td>aSyn antilichaam C-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>bSyn antilichaam EP1537Y</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-79903</td><td></td></tr><tr><td>gSyn antilichaam E-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10698</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur/Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiskan Spectrum Plate Reader</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>51118650</td><td></td></tr><tr><td>pH Meter&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-636-AB15P</td><td></td></tr></tbody></table>

recombinante α-β - en γ-synucleins stimuleren eiwit fosfatase 2a katalytische subeenheid activiteit in cel gratis testen

Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) en γ-Synuclein (gSyn) zijn een geconserveerde gezinsleden van de Chaperon-achtige eiwitten die zeer op gewervelde neuronale weefsels worden uitgedrukt. Van de drie synucleins, is alleen aSyn sterk betrokken bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, dementie met Lewy organen en voor de verschillende systeem atrofie. Bij het bestuderen van normale aSyn functie, blijkt gegevens dat aSyn stimuleert de activiteit van de katalytische subeenheid van een overvloedig uitgedrukt dephosphorylating enzym, PP2Ac in vitro en in vivo. Voorafgaande gegevens blijkt dat aSyn aggregatie in menselijke hersenen PP2Ac activiteit in regio's met Lewy body pathologie vermindert, waar de oplosbare aSyn onoplosbaar is geworden. Echter, omdat alle drie synucleins aanzienlijke homologie in de sequenties van aminozuur hebben, experimenten werden ontworpen om te testen of alle PP2Ac activiteit kan moduleren. Met behulp van recombinant synucleins en recombinant PP2Ac eiwit, werd activiteit beoordeeld door Malachiet groen colorimetrische bepaling. Gegevens bleek dat alle drie recombinante synucleins PP2Ac activiteit in cel-gratis testen, verhogen van de mogelijkheid dat de geconserveerde homologie tussen synucleins alle drie homologen met de mogelijkheid om te binden begiftigen kan aan en activeer de PP2Ac gestimuleerd. Co-immunoprecipitation gegevens, suggereren echter dat PP2Ac modulatie waarschijnlijk door middel van endogene interacties tussen aSyn en PP2Ac in vivo plaatsvindt.

Eiwitfunctie en activiteit kunnen worden gewijzigd door post-vertalende wijzigingen, zoals fosforylering. Veel eiwitten kunnen worden door een kinase phosphorylated of gedefosforyleerd door een fosfatase. In het geval van eiwit fosfatase 2A (PP2A), deze multisubunit fosfatase vergemakkelijkt de defosforylerings van serine en threonine residuen op een breed aantal phosphoproteins. Abnormale PP2A activiteit kan leiden tot disregulatie van eiwitfunctie die optreedt in vele ziekten, met inbegrip van waar aSyn hyperphosphorylated worden kunnen, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer waar tau-eiwit hyperphosphorylated kan worden. Dit leverde de rechtvaardiging voor het optimaliseren van een interne procedure om snel PP2Ac activiteit evalueren en bepalen als abnormale PP2Ac activiteit tot cellulaire dysfunction leiden kan.
Met behulp van deze cel-vrije colorimetrische assay, PP2Ac activiteit werd gemeten door het kwantificeren van het bedrag van gratis PO4 gekloofd van de pT substraat (figuur 1A) en vergeleken met bekende picomolar bedragen voor PO4 in de standaard curve (figuur 1B ). PP2Ac activiteit was ook in reactie op 0.0, 0.1, 0.5, 1.0, en 2.0 µM synucleins (figuur 1A), gemeten ten opzichte van de basislijn PP2Ac activiteit in de afwezigheid van toegevoegde synuclein (bij de grote pijl in figuur 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig1.jpg"> Figuur 1 : PP2A activering door recombinant synucleins, wordt gemeten ten opzichte van bekende niveaus van fosfaat in de normen. In()aSyn, bSyn en gSyn werden geëvalueerd in een bereik van 0 - 2 µM eiwit concentraties, te vergelijken met 0 - 2400 pmol PO4 normen. (B) een standaard curve voor de Malachiet groen PP2Ac assay werd gegenereerd om bekende hoeveelheid fosfaat waartegen in experimentele omstandigheden verkregen waarden kunnen worden berekend. In alle gevallen, wanneer de PP2Ac activiteit toeneemt, de hoeveelheid vrije PO4 gekloofd van de pT-substraat verhoogt en produceert een donkerder groene kleur. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Uit de resultaten blijkt dat toevoeging van synucleins aan PP2Ac in de eerste incubatie stap de hoeveelheid gratis PO4 gemeten, waardoor het aantonen van verhoogde PP2Ac activiteit zou kunnen toenemen. De statistische analyse na vele herhalingen show dat alle drie recombinant synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) aanzienlijk PP2Ac activiteit (Figuur 2 verhogen). Deze resultaten suggereren dat wijzigingen in de hoeveelheid oplosbare cellulaire synucleins PP2Ac activiteit veranderen kunnen; en aldus invloed kunnen cellulaire homeostase. Het is niet bekend, echter, als alle drie synucleins aan de activering van het PP2Ac in vivo bijdragen, hoewel de gegevens in Figuur 3 blijkt dat waarschijnlijk aSyn draagt bij aan PP2Ac activiteit in vivo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig2.jpg"> Figuur 2 : PP2Ac activiteit wordt gestimuleerd door alle drie synucleins. Grafische weergave van de activering van het PP2Ac in reactie op uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar van recombinante aSyn, bSyn of gSyn wordt weergegeven. Alle drie recombinante synucleins gestimuleerd PP2Ac activiteit. aSyn in de meeste experimenten bleek iets krachtiger, al ANOVAs uitgevoerd met behulp van statistische software over het algemeen opvallend vergelijkbaar waren. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van 4-9 onafhankelijke experimenten. ns, niet significant; p < 0,05; p < 0,01; p < 0,0001. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Om te beoordelen welke synuclein(s) interactie met PP2Ac in de hersenen, werden co-immunoprecipitation (Co-IP) tests uitgevoerd met behulp van wild type muis hersenen en het PP2Ac-specifieke-antilichaam, 1 d 6. Eiwitten vervolgens werden gescheiden door SDS-PAGE en vlekken waren gesondeerd voor PP2Ac, aSyn, bSyn en gSyn met behulp van gevestigde methoden19. Recombinant synuclein besturingselementen tonen antilichamenspecificiteit van aSyn, bSyn en gSyn (figuur 3A). Co-IP-gegevens blijkt dat de grote synuclein die zijn gekoppeld aan de PP2Ac in de hersenen aSyn, was zoals veel minder bSyn kwam neer in de co-IP (figuur 3B), en geen gSyn kwam neer in de Co-IP (gegevens niet worden weergegeven). Dit suggereert een onderscheidende rol voor endogene aSyn in de regulatie van PP2Ac in de hersenen. Het werpt ook de mogelijkheid dat modulatie van de PP2Ac met bSyn-gebaseerd-therapieën kon potentieel om te herstellen van PP2A activiteit in die met synucleinopathy, zoals bSyn bekend als nonamyloidogenic nog zoals hier kan stimuleren PP2Ac30, 31.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2.jpg"> Figuur 3: Interactie van PP2Ac met endogene synucleins in muis hersenen. (A) Recombinant aSyn, bSyn en gSyn werden gesondeerd met specifieke antilichamen van de synuclein, zoals hieronder beschreven. (B) gebruiken muis hersenen homogenaat Co-IP werd uitgevoerd met antilichaam 1 d 6, dan monsters werden geanalyseerd op immunoblots. Gegevens worden weergegeven voor PP2Ac, aSyn en bSyn, maar niet voor gSyn die deed niet Co-IP met PP2Ac. Start monsters tonen relatieve niveaus van PP2Ac lane (1), aSyn (lane 4), en bSyn (lane 7) in de eerste homogenates. Einde monsters blijkt de resterende niveaus van PP2Ac lane (2), aSyn (lane 5), en bSyn (lane 8) in homogenates na de 1 d-6 PP2Ac Co-IP. Aanzienlijke niveaus van PP2Ac waren immunoprecipitated met behulp van 1 d 6 antilichaam lane (3), waarbij ook afgezet ruime hoeveelheid aSyn (lane 6, op pijl) maar zeer weinig bSyn (lane 9, sterk overbelicht zodat vage bSyn signaal, op pijl). * Sterretjes en haakjes van mark de niet-specifieke signalen op blots. Zie de Tabel van materialen voor meer informatie over antilichamen gebruikt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Deze publicatie presenteert een protocol waarin wordt beschreven hoe voor het meten van de activiteit van recombinante eiwitten fosfatase 2A katalytische subeenheid (PP2Ac) in reactie op recombinante α-synuclein, β-synuclein, of γ-synuclein eiwitten met behulp van een eenvoudige colorimetrische bepaling. Bevindingen met betrekking tot de specificiteit van de α-synuclein naar PP2Ac laten we zien in de hersenen van de muis.

Recombinante α-β - en γ-Synucleins stimuleren eiwit fosfatase 2A katalytische subeenheid activiteit in cel gratis testen

&#945;-Synuclein (aSyn), &#946;-Synuclein (bSyn), and &#947;-Synuclein (gSyn) are members of a conserved family of chaperone-like proteins that are highly ...

Recombinante alfa-, bèta- en gamma-synucleïnen stimuleren de activiteit van de katalytische subeenheid van proteïnefosfatase 2A in celvrije assays. Hallo, mijn naam is Sovanarak Lek. Ik ben een geneeskundestudent aan het Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L. Foster School of Medicine.In deze video demonstreer ik een protein phosphatase twee-weg colorimetrische assay met behulp van recombinante synucleïne-eiwitten. Bereiding van buffers en reagentia. Bereiding van de p-nitrophenolfosfaatbuffer.Om 50 ml pNPP-buffer te bereiden, lost u Trizma-basis op in 25 ml ultrapuur gedeïoniseerd water in een bekerglas. Voeg een schone roerstaaf toe en plaats het geheel op een magnetische roerder. Zodra de Trizma is opgelost, voegt u calciumchloride toe onder voortdurend roeren.Stel de pH in op 7,0. Breng de oplossing over in een maatcilinder. Vul het uiteindelijke totale volume aan tot 50 ml met ultrapuur gedeïoniseerd water.Het bereiden van malachietgroenoplossing. Voor de malachietgroenoplossing zijn drie oplossingen nodig, deel A, B en C. Oplossing A is vier molar zoutzuur. Oplossing B is een combinatie van ammoniummolybdaat plus oplossing A. Oplossing C is 0,045% malachietgroenoxalaatzout.Om oplossing D te bereiden, mengt men één deel B met drie delen C, in een verhouding van één op drie. Roer één uur bij kamertemperatuur. Filter vervolgens oplossing D door een membraan van 22 micrums en bewaar deze bij vier graden Celsius.Bescherm tegen licht. Bereiding van de activator. De activator is een één procent Tween 20-oplossing.Pipetteer 10 µL Tween 20 in 990 µL ultrapuur gedeïoniseerd water. Vortex tot Tween 20 volledig is opgelost. Het bereiden van de werkoplossing van malachietgroen plus Tween 20.Voeg activator toe aan oplossing D in een verhouding van één op 100. Voorbereiding van threonine-fosfopeptide. Om een 2 mM pT-stockoplossing te bereiden, voegt u 550 µL ultrapuur gedeïoniseerd water toe aan 1 mg pT.Vortexen tot het fosfopeptide volledig is opgelost. Op ijs plaatsen voor onmiddellijk gebruik. Bewaar extra pT-aliquots bij -20 °C.Voorbereiding van synucleïne. Resuspendeer één milligram synucleïne in ultrapuur gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke concentratie van één milligram per ml. Vortex voorzichtig om op te lossen.Gebruik onmiddellijk en bewaar ongebruikte aliquoten bij min 80 graden Celsius. Het bereiden van fosfaatstandaarden. Fosfaatstandaarden stap één.Om een 1 mM fosfaatstockoplossing te bereiden, lost u kaliumfosfaat op in ultrapuur gedeïoniseerd water in een bekerglas met een roerstaafje. Overbreng dit naar een maatcilinder en vul het uiteindelijke volume aan tot 100 ml. Dit is een 10 mM oplossing.Filtreer de gehele oplossing door een 22 µm filter met behulp van een grote spuit. Verdun dit in een verhouding van 1 op 100 om een 1 mM fosfaatoplossing te maken voor gebruik als assaystandaarden. Fosfaatstandaarden stap twee.Voeg de juiste hoeveelheid fosfaat en ultrapuur gedeïoniseerd water toe aan buisjes van 1,5 ml volgens de tabel. Dit levert buisjes op van 150, 300, 600, 1.200 en 2.400 pmol fosfaat. Bewaar de aliquoten bij -20 °C.PP2A-activiteitsassay. Bereid de PP2A-assay voor in 1,5 ml buisjes op ijs. Voeg 43 µL pNPP-buffer toe.Voeg één µL humaan recombinant PP2Ac toe. Voeg synucleïne toe en incubeer PP2A plus synucleïne 30 minuten op een Nutator bij vier °C. Voeg vervolgens 16 µL van 2mM pT toe.Incubeer 10 minuten bij 30 °C in een waterbad. Voeg op een 96-wells plaat met een vlakke bodem 25 µL van elke fosfaatstandaard in dubbeltoets toe, van laag naar hoog. Pipetteer 24 µL van elke PP2A-assay in dubbeltoets op dezelfde 96-wells plaat bij de standaarden.Pipetteer 75 µL van oplossing D met Tween 20 in elk monster en elke standaard. Na toevoeging van MGT zal er een kleurverandering in de putjes optreden wanneer er vrije fosfaten aanwezig zijn. Fotometrische analyse.Analyse op een spectrofotometer ingesteld op 630 nanometer. Representatieve resultaten. Hier zien we een representatieve PP2A-assay en de grafiek die de standaardcurve weergeeft.Links staan de fosfaatstandaarden. Hoe meer fosfaat de wells bevatten, hoe donkerder de groenige tint. Rechts hebben we PP2A dat is geïncubeerd met alfa-, bèta- of gamma-synucleïnen bij verschillende molaire concentraties.Hogere concentraties waren effectiever in het stimuleren van de activiteit van de katalytische subeenheid van PP2A. Hier zien we de grafische weergave van de PP2A-activiteit als reactie op variërende concentraties van alpha synucleïne, beta synucleïne en gamma synucleïne. Alpha synucleïne, beta synucleïne en gamma synucleïne waren allemaal significante stimulatoren van de PP2A-activiteit bij een concentratie van één tot twee µM.Alleen alfa-synucleïne en bèta-synucleïne waren significante stimulatoren van de PP2A-activiteit bij een concentratie van 0,5 micromolar. Figuur drie toont de interactie van PP2Ac met endogene synucleïnen in de muizenhersenen. In A worden recombinant alfa-, bèta- en gamma-synucleïne getoond als positieve controles.In B werd co-immunoprecipitatie uitgevoerd met behulp van het PP2Ac-specifieke antilichaam 1D6, waarmee PP2Ac werd neergeslagen en dat tevens een aanzienlijke hoeveelheid interagerend alfa-synucleïne neersloeg, maar vrijwel geen bèta-synucleïne. Er werd geen gamma-synucleïne samen met PP2Ac neergeslagen in de co-immunoprecipitatie. Deze co-immunoprecipitatiegegevens suggereren dat alfa-synucleïne de endogene modulator van PP2Ac in vivo is.We willen iedereen bedanken die ons heeft geholpen bij het maken van deze video. Tot slot zijn dit Ruth Perez en Sonavarak Lek.Javier Vargas. Ik wens u veel succes. Tot ziens en veel succes.

recombinant-synucleins-stimulate-protein-phosphatase-2a-catalytic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Leucine Rich Herhaal Kinase 2 is een grote multidomein kinase, mutaties in die de meest voorkomende genetische oorzaak van de ziekte van Parkinson. Analyse van de kinase-activiteit van dit eiwit heeft zich bewezen als een essentieel instrument in het begrijpen van de biologie en de disfunctie van dit eiwit te zijn. In dit...

Het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 In vitro</em

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomain eiwitten die zowel GTPase en kinase domeinen coderen en die gefosforyleerd zijn in cellen. Hier presenteren we een protocol om LRRK1 en LRRK2 label in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om hun algemene cellulaire fosforylering te meten.

Metabole Labeling van leucine rich repeat Kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat

Een ELISA die een nieuwe kwantitatieve aanpak biedt, wordt beschreven. Het detecteert specifiek ziekte-geassocieerd α-synucleïne (αSD) in een transgenisch muismodel (M83) van synucleïnopathie door gebruik te maken van verschillende antilichamen tegen ofwel de Ser129 gefosforyleerde αS-vorm of het C-terminale deel van het eiwit.

Opsporing van de ziekte-geassocieerde α-synucleïne door Enhanced ELISA in de hersenen van transgene muizen door overexpressie van Human A53T Gemuteerde α-synucleïne

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van steeds onoplosbaarder/geaggregeerd alfa-synucleïne (α-syn) uit post-mortem menselijk hersenweefsel. Door het gebruik van buffers met toenemende detergentsterkte en hoogsnelheids ultracentrifugeringstechnieken, kunnen de variabele eigenschappen van α-syn-aggregatie in zieke en niet-zieke weefsel worden onderzocht.

Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains

Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

Dit protocol is ontworpen om de activiteit van ubiquitin-proteasome System (UPS) in verschillende cellulaire compartimenten van de knaagdieren hersenen efficiënt te kwantificeren. Gebruikers zijn in staat om de werking van UPS in nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties in hetzelfde dier te onderzoeken, waardoor de hoeveelheid tijd en het aantal dieren dat nodig is om deze complexe analyses uit te voeren, wordt verminderd.

Kwantificerende Subcellulaire Ubiquitin-proteasome activiteit in het knaagdier hersenen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neuronale α-synucleinaccumulatie in primaire muis dopamine neuronen te bestuderen. Fosforyleerde α-synuclein aggregaten in neuronen worden geïnduceerd met voorgevormde α-synucleinfibrils. Geautomatiseerde beeldvorming van immunofluorescently gelabelde cellen en onbevooroordeelde beeldanalyse maken dit robuuste protocol geschikt voor medium-to-high doorvoerscreening van geneesmiddelen die α-synucleinaccumulatie remmen.

Het bestuderen van voorgevormde Fibril Geïnduceerde α-Synuclein Accumulatie in primaire embryonale muis Midbrain Dopamine Neuronen

Een in vivo fysiologisch model van α-synucleïne is nodig om de pathogenese van de ziekte van Parkinson te bestuderen en te begrijpen. We beschrijven een methode om de cytotoxiciteit en geaggregeerde vorming van α-synucleïne te monitoren met behulp van een gehumaniseerd gistmodel.

Een methode om α-synucleïnetoxiciteit en -aggregatie te bestuderen met behulp van een gehumaniseerd gistmodel

Leishmania Translational Extract (LTE) is een eukaryotisch celvrij eiwitexpressiesysteem dat is afgeleid van de eencellige parasiet Leishmania tarentolae. Dit geoptimaliseerde protocol maakt LTE eenvoudig en kosteneffectief te produceren. Het is geschikt voor verschillende toepassingen die gericht zijn op de multiparallelle expressie en studie van complexe eukaryote eiwitten en hun interacties.

Productie en optimalisatie van LTE, een van Leishmania tarentolae-afgeleid celvrij eiwitexpressiesysteem voor recombinante eiwitproductie

Hier beschrijven we een gistsysteem dat menselijke γ-secretase reconstrueert. Dit systeem maakt het mogelijk om mutaties die de activiteit beïnvloeden te identificeren en te bestuderen en om γ-secretaseremmers (GSI's) te screenen. Door gebruik te maken van het functieverlies van familiale mutanten voor de ziekte van Alzheimer, is het mogelijk om te screenen op γ-secretasemodulatoren (GSM's).

Saccharomyces cerevisiae Modellen van de ziekte van Alzheimer om genen, mutaties en chemicaliën te screenen die de productie van amyloïde bèta beïnvloeden door γ-secretase

Leer hoe recombinante α-, β- en γ-synucleinen de PP2Ac-activiteit stimuleren in celvrije assays met een colorimetrische methode. α-synucleine toont de hoogste specificiteit voor PP2Ac in muizenhersenen.

Recombinante α-β - en γ-Synucleins stimuleren eiwit fosfatase 2A katalytische subeenheid activiteit in cel gratis testen

Meer video's verkennen