Recombinante α-β - en γ-Synucleins stimuleren eiwit fosfatase 2A katalytische subeenheid activiteit in cel gratis testen

Recombinante alfa-, bèta- en gamma-synucleïnen stimuleren de activiteit van de katalytische subeenheid van proteïnefosfatase 2A in celvrije assays. Hallo, mijn naam is Sovanarak Lek. Ik ben een geneeskundestudent aan het Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L. Foster School of Medicine.

In deze video demonstreer ik een protein phosphatase twee-weg colorimetrische assay met behulp van recombinante synucleïne-eiwitten. Bereiding van buffers en reagentia. Bereiding van de p-nitrophenolfosfaatbuffer.

Om 50 ml pNPP-buffer te bereiden, lost u Trizma-basis op in 25 ml ultrapuur gedeïoniseerd water in een bekerglas. Voeg een schone roerstaaf toe en plaats het geheel op een magnetische roerder. Zodra de Trizma is opgelost, voegt u calciumchloride toe onder voortdurend roeren.

Stel de pH in op 7,0. Breng de oplossing over in een maatcilinder. Vul het uiteindelijke totale volume aan tot 50 ml met ultrapuur gedeïoniseerd water.

Het bereiden van malachietgroenoplossing. Voor de malachietgroenoplossing zijn drie oplossingen nodig, deel A, B en C. Oplossing A is vier molar zoutzuur. Oplossing B is een combinatie van ammoniummolybdaat plus oplossing A. Oplossing C is 0,045% malachietgroenoxalaatzout.

Om oplossing D te bereiden, mengt men één deel B met drie delen C, in een verhouding van één op drie. Roer één uur bij kamertemperatuur. Filter vervolgens oplossing D door een membraan van 22 micrums en bewaar deze bij vier graden Celsius.

Bescherm tegen licht. Bereiding van de activator. De activator is een één procent Tween 20-oplossing.

Pipetteer 10 µL Tween 20 in 990 µL ultrapuur gedeïoniseerd water. Vortex tot Tween 20 volledig is opgelost. Het bereiden van de werkoplossing van malachietgroen plus Tween 20.

Voeg activator toe aan oplossing D in een verhouding van één op 100. Voorbereiding van threonine-fosfopeptide. Om een 2 mM pT-stockoplossing te bereiden, voegt u 550 µL ultrapuur gedeïoniseerd water toe aan 1 mg pT.

Vortexen tot het fosfopeptide volledig is opgelost. Op ijs plaatsen voor onmiddellijk gebruik. Bewaar extra pT-aliquots bij -20 °C.

Voorbereiding van synucleïne. Resuspendeer één milligram synucleïne in ultrapuur gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke concentratie van één milligram per ml. Vortex voorzichtig om op te lossen.

Gebruik onmiddellijk en bewaar ongebruikte aliquoten bij min 80 graden Celsius. Het bereiden van fosfaatstandaarden. Fosfaatstandaarden stap één.

Om een 1 mM fosfaatstockoplossing te bereiden, lost u kaliumfosfaat op in ultrapuur gedeïoniseerd water in een bekerglas met een roerstaafje. Overbreng dit naar een maatcilinder en vul het uiteindelijke volume aan tot 100 ml. Dit is een 10 mM oplossing.

Filtreer de gehele oplossing door een 22 µm filter met behulp van een grote spuit. Verdun dit in een verhouding van 1 op 100 om een 1 mM fosfaatoplossing te maken voor gebruik als assaystandaarden. Fosfaatstandaarden stap twee.

Voeg de juiste hoeveelheid fosfaat en ultrapuur gedeïoniseerd water toe aan buisjes van 1,5 ml volgens de tabel. Dit levert buisjes op van 150, 300, 600, 1.200 en 2.400 pmol fosfaat. Bewaar de aliquoten bij -20 °C.

PP2A-activiteitsassay. Bereid de PP2A-assay voor in 1,5 ml buisjes op ijs. Voeg 43 µL pNPP-buffer toe.

Voeg één µL humaan recombinant PP2Ac toe. Voeg synucleïne toe en incubeer PP2A plus synucleïne 30 minuten op een Nutator bij vier °C. Voeg vervolgens 16 µL van 2mM pT toe.

Incubeer 10 minuten bij 30 °C in een waterbad. Voeg op een 96-wells plaat met een vlakke bodem 25 µL van elke fosfaatstandaard in dubbeltoets toe, van laag naar hoog. Pipetteer 24 µL van elke PP2A-assay in dubbeltoets op dezelfde 96-wells plaat bij de standaarden.

Pipetteer 75 µL van oplossing D met Tween 20 in elk monster en elke standaard. Na toevoeging van MGT zal er een kleurverandering in de putjes optreden wanneer er vrije fosfaten aanwezig zijn. Fotometrische analyse.

Analyse op een spectrofotometer ingesteld op 630 nanometer. Representatieve resultaten. Hier zien we een representatieve PP2A-assay en de grafiek die de standaardcurve weergeeft.

Links staan de fosfaatstandaarden. Hoe meer fosfaat de wells bevatten, hoe donkerder de groenige tint. Rechts hebben we PP2A dat is geïncubeerd met alfa-, bèta- of gamma-synucleïnen bij verschillende molaire concentraties.

Hogere concentraties waren effectiever in het stimuleren van de activiteit van de katalytische subeenheid van PP2A. Hier zien we de grafische weergave van de PP2A-activiteit als reactie op variërende concentraties van alpha synucleïne, beta synucleïne en gamma synucleïne. Alpha synucleïne, beta synucleïne en gamma synucleïne waren allemaal significante stimulatoren van de PP2A-activiteit bij een concentratie van één tot twee µM.

Alleen alfa-synucleïne en bèta-synucleïne waren significante stimulatoren van de PP2A-activiteit bij een concentratie van 0,5 micromolar. Figuur drie toont de interactie van PP2Ac met endogene synucleïnen in de muizenhersenen. In A worden recombinant alfa-, bèta- en gamma-synucleïne getoond als positieve controles.

In B werd co-immunoprecipitatie uitgevoerd met behulp van het PP2Ac-specifieke antilichaam 1D6, waarmee PP2Ac werd neergeslagen en dat tevens een aanzienlijke hoeveelheid interagerend alfa-synucleïne neersloeg, maar vrijwel geen bèta-synucleïne. Er werd geen gamma-synucleïne samen met PP2Ac neergeslagen in de co-immunoprecipitatie. Deze co-immunoprecipitatiegegevens suggereren dat alfa-synucleïne de endogene modulator van PP2Ac in vivo is.

We willen iedereen bedanken die ons heeft geholpen bij het maken van deze video. Tot slot zijn dit Ruth Perez en Sonavarak Lek.

Javier Vargas. Ik wens u veel succes. Tot ziens en veel succes.