Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

Het algemene doel van de magnetische isolatie van CD11b-microglia is om in een relatief korte tijd een hoogzuivere eindopbrengst van postnatale microglia te verkrijgen voor diverse in vitro experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen de neurowetenschappen, zoals de signaleringsmechanismen die relevant zijn voor neurale ontsteking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van momenteel beschikbare methoden is dat de isolatie ongeveer 30 minuten duurt, zonder concessies te doen aan de zuiverheid, opbrengst of levensvatbaarheid.

Begin met het overbrengen van vers gedecapiteerde koppen van één tot twee dagen oude muizenpups naar een laminaire flowkast. Gebruik vervolgens een rechte micro-dissectieschaar van 4,5 inch om een kleine incisie in de schedel en de meninges te maken door de punten in de opening te plaatsen die door de decapitatie is ontstaan en van caudaal naar rostraal te knippen. Pel na het maken van de incisie één van de hemisferen naar de zijkant.

Gebruik vervolgens een paar gebogen of gehaakte pincetten om de gehele hersenen te verwijderen. Breng de hersenen over naar een buis van 50 milliliter met twee milliliter 0,25% trypsine EDTA en incubeer deze gedurende 15 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius. Was de hersenen met vers groeimedium door het medium toe te voegen en weer te verwijderen.

Voeg na voltooiing van de wasstappen twee milliliters groeimedium per brein toe en homogeniseer door het brein te tritureren. Wanneer het breinweefsel niet verder verkleint, stap over op een pipet met een kleinere opening. Aan het einde van de trituratie, wanneer de suspensie helder is zonder zichtbare klonters, wordt de suspensie door een cellzeef van 70 micron geleid om een enkelcelcultuur te creëren.

Pipetteer vervolgens acht tot negen milliliter groeimedium in T75-kolven, twee kolven per brein, en voeg één milliliter breinhomogenaat toe aan elke kolf. Kweek de cellen tot aan de isolatie op de zestiende dag. Na zestien dagen wordt het groeimedium vanuit de kolf overgebracht naar een nieuwe 50-milliliter buis.

Voeg drie milliliters 0,25% trypsin EDTA toe aan elke T75-fles. Schud de flessen vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudmachine. Centrifugeer het groeimedium bij 0,4 ×g gedurende vijf minuten.

Voeg na vijf minuten schudden minimaal vier milliliter van het gecentrifugeerde kweekmedium toe om de trypsin-EDTA-reactie te stoppen en tritureer om er zeker van te zijn dat alle cellen zijn losgekoppeld. Leid de cellen vervolgens door een 70-micromolaire cellstrainer om een enkelcellige cultuur te creëren. Voer een celtelling uit en centrifugeer daarna bij 0,4 ×g gedurende vijf minuten.

Neem vervolgens een polystyreenbuis van vijf milliliter, voeg één milliliter van het aanbevolen medium toe en markeer de meniscus. Voeg het aanbevolen medium toe tot 2,5 milliliter en markeer ook deze meniscus. Verwijder daarna het medium en resuspendeer het pellet in 500 microliters van het aanbevolen medium.

Overbreng dit mengsel naar een polystyreenbuisje van vijf milliliter en verdun het vervolgens tot de markering van één milliliter. Voeg daarna 50 µL ratenserum toe voor elke milliliter gesuspendeerde cellen en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. Bereid tijdens de incubatie de selectiecocktail voor door 25 µL component A en 25 µL component B te mengen. Zodra de vijf minuten zijn verstreken, voegt u 50 µL van de selectiecocktail toe aan de cellen en incubeert u deze nog eens vijf minuten bij kamertemperatuur.

Vortex de microsferen gedurende 45 seconden. Voeg vervolgens 80 µL microsferen per 1 mL monster toe en incubeer drie minuten bij kamertemperatuur. Voeg daarna het aanbevolen medium toe tot het 2,5 mL-merk op de polystyreenbuis.

Plaats de buis drie minuten bij kamertemperatuur in de magnetische houder. Giet na de incubatie het medium langzaam over in een polystyreen buis van 15 milliliter die nog in de magneet staat. Herhaal de magnetische scheiding nog drie keer, waarbij elke keer het aanbevolen medium wordt toegevoegd tot het streepje van 2,5 milliliter.

Voeg na de laatste magnetische scheiding drie milliliter groeimedium toe en tel het aantal cellen met een celteller. Zaai de cellen uit in met poly-D-lysine gecoate platen voor de behandelingen. Zaai de negatieve fractie uit de buis van 15 milliliter, die hoofdzakelijk astrocyten bevat, uit in T75-flesjes.

Na ten minste zes uur incubatie in een incubator van 37 °C, vervangt u al het groeimedium in de kolven met de negatieve fractie voordat u deze terugplaatst in de incubator. Deze afbeelding toont immunocytochemie van een geïsoleerde microgliacultuur, aangetoond voor IBA, een marker voor microglia in het groene kanaal, en GFAP, een marker voor astrocyten, in het rode kanaal. Hoechst-kleuring onthult de aanwezigheid van celkernen.

De afwezigheid van GFAP-positieve cellen aantoont dat ook microglia die zijn geïsoleerd met de CD11b-positieve selectiekit een hoge zuiverheid hebben. Deze via immunoblot gedetecteerde eiwitten uit een geïsoleerde microgliacultuur werden gescreend op GFAP, dat verschijnt als een band van ongeveer 51 kilodalton, en IBA1, dat verschijnt als een band van ongeveer 15 kilodalton. Beta-actine werd gebruikt als ladingscontrole en verschijnt bij ongeveer 42 kilodalton.

Een probleem met de oude isolatiekit was dat PE-fluorescentie kon worden waargenomen in het rode kanaal, zoals hier te zien is. De aangepaste procedure veroorzaakt geen autofluorescentie van de magnetische kraaltjes, zoals hier in het rode kanaal te zien is. De microglia die met deze procedure zijn geïsoleerd, kunnen worden gebruikt voor signaleringsstudies.

Western blot-analyse laat zien dat Fyn en gefosforyleerd-src tyrosine Y416 kunnen worden gedetecteerd uit microglia die zijn geïsoleerd met onze nieuw verfijnde methode. De negatieve fractie van de microgliaseparatie bevat astrocyten die kunnen worden gebruikt voor signaleringsstudies. Western blotting laat zien dat de negatieve fractie GFAP-positieve cellen bevat.

Western blot-analyse laat zien dat Fyn en phospho-src tyrosine Y416 kunnen worden aangetroffen in de GFAP-positieve cellen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals multi-channel fluorescentiemicroscopie, western blotting en kwantitatieve PCR, worden uitgevoerd om vragen over genexpressie en eiwitsignalering te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe deze snelle isolatietechniek kan worden ingezet voor microglia-experimenten.