Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

Het algemene doel van CD11b magnetische microglia-isolatie is om in relatief korte tijd een hoog zuiverheidsrendement van postnatale microglia te bereiken voor het doel van veelzijdige in vitro-experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurowetenschappen, zoals de signaleringsmechanismen die relevant zijn voor neurale ontsteking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van momenteel beschikbare methoden is dat de isolatie ongeveer 30 minuten duurt, zonder inboeten in zuiverheid, opbrengst of levensvatbaarheid.

Begin met het overbrengen van vers onthoofde hoofden van een- tot tweedaagse muispups naar een laminaire luchtstroomkap. Gebruik vervolgens 4,5-inch rechte micro-dissectie-schaar om een kleine incisie in de schedel en het hersenvlies te maken door de punten in de opening te plaatsen die door de onthoofding is gevormd en snijden van caudaal naar rostrale. Na het maken van de incisie, pel een van de hemisferen naar de zijkant.

Gebruik vervolgens een paar gebogen of haakvormige pincetten om de hele hersenen te verwijderen. Breng de hersenen over in een 50-milliliter buisje met twee milliliter 0,25% trypsine EDTA en incubeer gedurende 15 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius. Was de hersenen met vers groeimedium door het medium toe te voegen en te verwijderen.

Na voltooiing van de wasbeurten, voegt u twee milliliter groeimedium per hersenen toe en homogeniseert u door de hersenen te tritureren. Wanneer het hersenweefsel niet kleiner wordt, gaat u over naar een pipet met een kleinere opening. Aan het einde van de trituratie, wanneer de suspensie helder is en er geen zichtbare brokken zijn, passeert u de suspensie door een 70-micron celzeef om een enkele celcultuur te creëren.

Pipet vervolgens acht tot negen milliliter groeimedium in T75 kolven, twee kolven per hersenen, en voegt u een milliliter hersenhomogenaat toe aan elke kolf. Laat de cellen groeien tot isolatie op de zestiende dag. Na zestien dagen, brengt u het groeimedium van de kolf over naar een verse 50-milliliter buis.

Voeg drie milliliter 0,25% trypsine EDTA toe aan elke T75 kolf. Schud vervolgens de kolven gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op een orbitale shaker. Centrifugeer het groeimedium gedurende vijf minuten bij 0,4 keer g.

Na vijf minuten schudden, voegt u minimaal vier milliliter van het gecentrifugeerde kweekmedium toe om de trypsine EDTA-reactie te stoppen en tritureert u om ervoor te zorgen dat alle cellen losgekoppeld zijn. Vervolgens passeert u de cellen door een 70-micromolaire celzeef om een enkele celcultuur te creëren. Voer een celtelling uit en centrifugeer vervolgens bij 0,4 keer g gedurende vijf minuten.

Neem vervolgens een vijf-milliliter polystyreen buis, voeg een milliliter aanbevolen medium toe en markeer de meniscus. Voeg aanbevolen medium toe tot 2,5 milliliter en markeer ook deze meniscus. Vervolgens, verwijder het medium en hersuspendeer het pellet in 500 microliter aanbevolen medium.

Breng deze mix over in een vijf-milliliter polystyreen buis en verdun vervolgens tot de een milliliter markering. Voeg vervolgens 50 microliter rattenserum toe voor elke een milliliter gesuspendeerde cellen en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Tijdens de incubatie, bereidt u het selectiecocktail voor door 25 microliter component A en 25 microliter component B te mengen. Nadat de vijf minuten zijn verstreken, voegt u 50 microliter van het selectiecocktail toe aan de cellen en incubeert u gedurende nog eens vijf minuten bij kamertemperatuur.

Vortex de microsferen gedurende 45 seconden. Voeg vervolgens 80 microliter microsferen toe per een milliliter monster en incubeer gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens aanbevolen medium toe tot de 2,5 milliliter markering op de polystyreenbuis.

Plaats de buis gedurende drie minuten bij kamertemperatuur in de magnetische houder. Na de incubatie, giet u het medium langzaam uit in een 15-milliliter polystyreen buis die nog in de magneet staat. Herhaal de magnetische scheiding nog drie keer, elke keer met aanbevolen medium tot de 2,5 milliliter markering.

Na de laatste magnetische scheiding, voegt u drie milliliter groeimedium toe en telt u het aantal cellen met behulp van een celteller. Plaat de cellen in poly-D-lysine gecoate platen voor behandelingen. Plaat de negatieve fractie van de 15-milliliter buis, die voornamelijk astrocyten bevat, in T75 kolven.

Na ten minste zes uur incubatie in een 37-graad Celsius incubator, vervangt u al het groeimedium in de kolven met de negatieve fractie voordat u terugkeert naar de incubator. Deze afbeelding toont immunocytochemie van een geïsoleerde microgliale cultuur die is onderzocht op IBA, een marker van microglia in het groene kanaal, en GFAP, een marker van astrocyten, in het rode kanaal. Hoechst-kleuring toont de aanwezigheid van celkernen.

De afwezigheid van GFAP-positieve cellen toont aan dat microglia die geïsoleerd zijn met behulp van de CD11b positieve selectiekit ook een hoge zuiverheid hebben. Deze immunogeblotteerde eiwitten uit een geïsoleerde microgliale cultuur zijn onderzocht op GFAP, dat verschijnt als een band van ongeveer 51-kilodalton, en IBA1, dat verschijnt als een band van ongeveer 15-kilodalton. Beta-actine werd gebruikt als ladingscontrole en verschijnt op ongeveer 42-kilodaltons.

Een probleem met de oude isolatiekit was dat PE-fluorescentie kon worden waargenomen in het rode kanaal zoals hier te zien is. De gewijzigde procedure produceert geen enige autofluorescentie van de magnetische kralen, zoals hier in het rode kanaal te zien is. De microglia geïsoleerd met behulp van deze procedure kunnen worden gebruikt voor signaalstudies.

Western blot-analyse toont aan dat Fyn en fosfo-src tyrosine Y416 kunnen worden gedetecteerd vanuit microglia geïsoleerd met onze nieuw verfijnde methode. De negatieve fractie van de microgliale scheiding bevat astrocyten die kunnen worden gebruikt voor signaalstudies. Western blotting toont aan