Sequentiële zout extracties uit te voeren voor de analyse van Bulk chromatine bindende eigenschappen van chromatine complexen wijzigen
October 2nd, 2017
Sequentiële zout winning van chromatine gebonden eiwitten is een nuttig instrument voor het bepalen van de bindende eigenschappen van grote eiwitcomplexen. Deze methode kan worden gebruikt om te evalueren van de rol van individuele subeenheden of domeinen in de algehele affiniteit van een eiwit complex om te bulk chromatine.
Het algemene doel van de sequentiële zoutextractieprocedure is om de bindingsprofielen van eiwitten aan bulk-chromatine te karakteriseren en te evalueren hoe de binding verandert wanneer het eiwit of zijn omgeving wordt gemanipuleerd. Deze methode meet de relatieve affiniteit van epigenetische regulatoren voor chromatine en kan worden gebruikt om te evalueren hoe die interacties veranderen bij genetische, chemische en omgevingsmanipulatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een snelle en goedkope manier is om de bindingsprofielen van chromatine-bindende eiwitten te evalueren.
Personen die nieuw zijn in het chromatinegebied worstelen vaak met chromatine-immunoprecipitatie, of ChIP. Sequentiële zoutextractie is een oude techniek die zelfs onervaren wetenschappers kunnen gebruiken om veel van dezelfde vragen te beantwoorden. Om met de procedure te beginnen, verzamel 8.000.000 cellen van elke cellijn van belang.
Was elke celmonster twee keer met vijf milliliter ijskoud PBS. Resuspendeer elk monster en een milliliter van een hypotone buffer met proteaseremmers. Breng de celsuspensies over in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes.
Roteer de suspensies, bovenkant over onderkant, gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en centrifugeer vervolgens de suspensie gedurende vijf minuten bij dezelfde temperatuur bij 6.000 G's. Gooi de supernatant weg. Rust een micropipet uit met een punt van één milliliter.
Voeg 200 microliter zoutvrije gemodificeerde ripa-buffer met proteaseremmers toe aan het pellet. Tik met de punt van de pipet tegen de bodem van de microcentrifugebuis om het pellet in de punt te trekken. Pipetteer het pellet 15 keer op en neer.
Het monster zou dik en plakkerig moeten worden terwijl het pellet uit elkaar valt. Homogeniseer elk monster op deze manier en incubeer de monsters gedurende drie minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende drie minuten bij 6500 G's in vier graden Celsius.
Breng de supernatanten over naar schone 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Voeg aan elk pellet 200 milliliter gemodificeerde ripa-buffer toe met 100 millimolar natriumchloride en met proteaseremmers. Pipetteer het pellet 15 keer op en neer.
Als het pellet aanvankelijk moeilijk is om in de punt van de pipet te trekken, tik dan met de punt op de bodem van het buisje. Herhaal dit proces voor elk monster en incubeer de monsters gedurende drie minuten op ijs. Centrifugeer de monsters gedurende drie minuten bij 6500 G's in vier graden Celsius.
Breng de supernatanten over naar nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Ga door met het extraheren van monsters in gemodificeerde ripa-bufferoplossingen met toenemende natriumchlorideconcentraties. Wanneer het pellet niet langer op de bodem van het buisje blijft, plaats het pellet in de dop van het centrifugeerbuisje voordat je het supernatant decanteerd.
Na de seriële zoutextractie, voeg voor elk monster 70 milliliter viervoudig eiwitlaadbuffer toe aan elk van de vijf supernatantfracties. Laad 30 microliter van elke fractie op een SDS-acrylamidegel. Voer een standaard western blot uit door de eiwitten over te brengen naar een membraan en te kleuren met de juiste primaire antilichamen.
Incubeer de blot in secundaire antilichamen gelabeld met een infraroodkleurstof en beeld de blot af. Gebruik beeldanalysesoftware om de bandintensiteit van elke zoutconcentratie te berekenen. Plot de bandintensiteit tegen de zoutconcentratie om het elutiepatroon van het eiwit van belang te bepalen.
Sequentiële zoutextractie van de eiwitten ARID1a en Polybromo 1 vertoonde consistente elutie met zoutconcentraties van respectievelijk 200 en 300 millimolar. Niet-sequentiële zoutextractie van dezelfde eiwitten vertoonde minder consistente resultaten. De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd voor elk eiwit dat wordt onderzocht.
Zo werd SSE gebruikt om elutieprofielen te onderzoeken na verschillende incubatielengtes. Een transcriptionele activator, Polybromo 1, vertoonde vergelijkbare elutieprofielen wanneer gedurende drie minuten en tien minuten werd geïncubeerd. De transcriptionele repressor, Polycomb Repressieve Complex 1, geïndiceerd door BMI1, had meer dan drie minuten nodig om van chromatine te worden vrijgemaakt.
Eiwit-eiwitinteracties werden onderzocht door de verandering in elutieprofielen te onderzoeken. In aanwezigheid van een remmer, duidde bromodomein bevattend eiwit vier op lagere zoutconcentraties dan zonder de remmer. Verschillen in de histonpatronen werden waargenomen toen cellen werden behandeld met een histondeacetylaseremmer, waardoor het landschap van het chromatine veranderde.
Veranderingen in eiwitbinding wanneer cellen genomische stress ervaren, werden ook weerspiegeld in elutieprofielen. Hier suggereerde de toename van de zoutconcentratie die nodig was voor elutie, dat Polybromo 1 zich sterker aan chromatine bindt na DNA-schade met Doxorubicine. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee tot drie uur worden uitgevoerd als het op de juiste manier wordt uitgevoerd.
Denk er bij het uitvoeren van deze procedure aan om zo consistent mogelijk te zijn met uw behandeling van elk monster. Deze procedure kan worden gebruikt in de eerste stappen van een studie om het mechanisme en de regulatie van een chromatine-bindend eiwit te verduidelijken. Dit bespaart tijd en geld op onnodige genoombrede studies.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
De Sequential Salt Extraction procedure is ontworpen om eiwitbindingsprofielen naar bulk chromatin te karakteriseren en te beoordelen hoe deze bindingen worden gewijzigd door verschillende manipulaties. Deze methode is bijzonder nuttig voor het evalueren van de affiniteit van epigenetische regulatoren voor chromatin.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Chromatin biologie
- Eiwitinteracties
- Epigenetica
Achtergrond
- Sequential Salt Extraction is een techniek voor het bestuderen van chromatin-bindende eiwitten.
- Het biedt een snel en kosteneffectief alternatief voor chromatin immunoprecipitation (ChIP).
- Deze methode is toegankelijk, zelfs voor onervaren wetenschappers.
- Het maakt de evaluatie mogelijk van hoe eiwitinteracties veranderen met genetische, chemische en omgevingsfactoren.
Doel van de studie
- Om de bindingsprofielen van chromatin-bindende eiwitten te karakteriseren.
- Om de effecten van verschillende manipulaties op eiwitbinding te evalueren.
- Om een eenvoudige methode te bieden voor onderzoekers in het chromatineveld.
Gebruikte methoden
- Het oogsten van 8.000.000 cellen uit elke cellijn van belang.
- Sequentiële zoutextractie om chromatin-gebonden eiwitten te isoleren.
- Beoordeling van de bindingsaffiniteit van eiwitten aan chromatin.
- Evaluatie van veranderingen in bindingsprofielen onder verschillende omstandigheden.
Belangrijkste resultaten
- De methode karakteriseert effectief eiwitbindingsprofielen.
- Het laat zien hoe bindingsaffiniteiten kunnen worden gewijzigd door omgevingsfactoren.
- Resultaten wijzen op de bruikbaarheid van deze techniek voor zowel ervaren als beginnende onderzoekers.
- Biedt inzichten in de interacties van epigenetische regulatoren met chromatin.
Conclusies
- Sequential Salt Extraction is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van chromatininteracties.
- De methode is efficiënt en toegankelijk voor verschillende onderzoekstoepassingen.
- Het verbetert het begrip van eiwitbindingsdynamica in chromatinbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Sequential Salt Extraction (SSE) provides a rapid, cost-effective method to evaluate chromatin-binding protein affinity, enabling early-stage target validation in epigenetics-focused drug discovery. By quantifying how genetic, chemical, or environmental perturbations alter protein-chromatin interactions, SSE supports mechanistic de-risking of chromatin-modifying complexes before committing to resource-intensive assays. This approach improves predictive confidence in lead identification by distinguishing direct binding effects from indirect cellular responses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures relative binding affinity changes when complex subunits are lost or domains inactivated, clarifying functional contributions of individual proteins to chromatin engagement.
- Scientific Value: Profiles elution patterns under increasing salt concentrations to differentiate specific chromatin binding from nonspecific associations, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Enables non-experts to generate quantitative binding data without specialized ChIP expertise, accelerating early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible elution profiles that serve as quantitative readouts for screening compound effects on chromatin landscape alterations.
- Operational Value: Uses standard western blot infrastructure and image analysis, facilitating assay standardization across laboratories and reducing technical variability.
- Operational Value: Requires only basic centrifugation and electrophoresis equipment, lowering barriers to adoption in screening cascades for epigenetic modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links alterations in chromatin environment (e.g., via HDAC inhibitors) to changes in protein binding, supporting biomarker-aligned mechanistic studies in disease-relevant systems.
- Scientific Value: Evaluates binding shifts under genomic stress (e.g., doxorubicin-induced DNA damage), informing predictive models of target engagement under pathophysiological conditions.
- Operational Value: Complements cellular and biochemical assays by providing orthogonal validation of chromatin interaction continuity from discovery to preclinical stages.
Pipeline & Workflow Integration
SSE fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, offering a mechanistic bridge between biochemical binding assays and cellular phenotypic readouts in epigenetics programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how complex alterations affect chromatin binding, enabling pathway clarification and biological de-risking of epigenetic targets.
- Screening: Delivers salt-dependent elution profiles as quantitative outputs for comparing compound-induced chromatin state changes across screening campaigns.
- Analytics: Generates band intensity data plotted against salt concentration, providing calculable binding affinity shifts that inform structure-activity relationship discussions.
- Translational Research: Connects in vitro binding changes to cellular chromatin landscape modifications, supporting translational biomarker alignment when coupled with functional readouts.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, low-cost capability applicable across multiple chromatin targets, promoting platform reuse in epigenetic drug discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by distinguishing direct chromatin binding from indirect cellular effects through controlled salt elution.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative binding profiles using widely available laboratory equipment, enhancing cross-team standardization.
- Strategic Value: Reduces reliance on low-throughput ChIP for initial binding assessments, improving capital efficiency in early epigenetics projects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chromatin-modifying complex targets based on quantitative binding resilience to environmental perturbations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biochemistry and western blot quantification to ensure accurate elution profile interpretation.
- Depends on access to refrigerated centrifuges, microcentrifuge tubes, and standard SDS-PAGE/western blot instrumentation.
- Necessitates standardized cell harvesting and lysis protocols to minimize variability between samples and ensure comparable salt extraction results.
- Involves optimization of incubation times for each target protein, as binding release kinetics vary across chromatin-modifying complexes.
- Limited to relative affinity comparisons; absolute binding constants require orthogonal biophysical methods for validation.
