Sequentiële zout extracties uit te voeren voor de analyse van Bulk chromatine bindende eigenschappen van chromatine complexen wijzigen
2 oktober 2017
Sequentiële zout winning van chromatine gebonden eiwitten is een nuttig instrument voor het bepalen van de bindende eigenschappen van grote eiwitcomplexen. Deze methode kan worden gebruikt om te evalueren van de rol van individuele subeenheden of domeinen in de algehele affiniteit van een eiwit complex om te bulk chromatine.
Het algemene doel van de sequentiële zoutextractieprocedure is om de bindingsprofielen van eiwitten aan bulk-chromatine te karakteriseren en te evalueren hoe de binding verandert wanneer het eiwit of zijn omgeving wordt gemanipuleerd. Deze methode meet de relatieve affiniteit van epigenetische regulatoren voor chromatine en kan worden gebruikt om te evalueren hoe die interacties veranderen bij genetische, chemische en omgevingsmanipulatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een snelle en goedkope manier is om de bindingsprofielen van chromatine-bindende eiwitten te evalueren.
Personen die nieuw zijn in het chromatinegebied worstelen vaak met chromatine-immunoprecipitatie, of ChIP. Sequentiële zoutextractie is een oude techniek die zelfs onervaren wetenschappers kunnen gebruiken om veel van dezelfde vragen te beantwoorden. Om met de procedure te beginnen, verzamel 8.000.000 cellen van elke cellijn van belang.
Was elke celmonster twee keer met vijf milliliter ijskoud PBS. Resuspendeer elk monster en een milliliter van een hypotone buffer met proteaseremmers. Breng de celsuspensies over in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes.
Roteer de suspensies, bovenkant over onderkant, gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en centrifugeer vervolgens de suspensie gedurende vijf minuten bij dezelfde temperatuur bij 6.000 G's. Gooi de supernatant weg. Rust een micropipet uit met een punt van één milliliter.
Voeg 200 microliter zoutvrije gemodificeerde ripa-buffer met proteaseremmers toe aan het pellet. Tik met de punt van de pipet tegen de bodem van de microcentrifugebuis om het pellet in de punt te trekken. Pipetteer het pellet 15 keer op en neer.
Het monster zou dik en plakkerig moeten worden terwijl het pellet uit elkaar valt. Homogeniseer elk monster op deze manier en incubeer de monsters gedurende drie minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende drie minuten bij 6500 G's in vier graden Celsius.
Breng de supernatanten over naar schone 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Voeg aan elk pellet 200 milliliter gemodificeerde ripa-buffer toe met 100 millimolar natriumchloride en met proteaseremmers. Pipetteer het pellet 15 keer op en neer.
Als het pellet aanvankelijk moeilijk is om in de punt van de pipet te trekken, tik dan met de punt op de bodem van het buisje. Herhaal dit proces voor elk monster en incubeer de monsters gedurende drie minuten op ijs. Centrifugeer de monsters gedurende drie minuten bij 6500 G's in vier graden Celsius.
Breng de supernatanten over naar nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Ga door met het extraheren van monsters in gemodificeerde ripa-bufferoplossingen met toenemende natriumchlorideconcentraties. Wanneer het pellet niet langer op de bodem van het buisje blijft, plaats het pellet in de dop van het centrifugeerbuisje voordat je het supernatant decanteerd.
Na de seriële zoutextractie, voeg voor elk monster 70 milliliter viervoudig eiwitlaadbuffer toe aan elk van de vijf supernatantfracties. Laad 30 microliter van elke fractie op een SDS-acrylamidegel. Voer een standaard western blot uit door de eiwitten over te brengen naar een membraan en te kleuren met de juiste primaire antilichamen.
Incubeer de blot in secundaire antilichamen gelabeld met een infraroodkleurstof en beeld de blot af. Gebruik beeldanalysesoftware om de bandintensiteit van elke zoutconcentratie te berekenen. Plot de bandintensiteit tegen de zoutconcentratie om het elutiepatroon van het eiwit van belang te bepalen.
Sequentiële zoutextractie van de eiwitten ARID1a en Polybromo 1 vertoonde consistente elutie met zoutconcentraties van respectievelijk 200 en 300 millimolar. Niet-sequentiële zoutextractie van dezelfde eiwitten vertoonde minder consistente resultaten. De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd voor elk eiwit dat wordt onderzocht.
Zo werd SSE gebruikt om elutieprofielen te onderzoeken na verschillende incubatielengtes. Een transcriptionele activator, Polybromo 1, vertoonde vergelijkbare elutieprofielen wanneer gedurende drie minuten en tien minuten werd geïncubeerd. De transcriptionele repressor, Polycomb Repressieve Complex 1, geïndiceerd door BMI1, had meer dan drie minuten nodig om van chromatine te worden vrijgemaakt.
Eiwit-eiwitinteracties werden onderzocht door de verandering in elutieprofielen te onderzoeken. In aanwezigheid van een remmer, duidde bromodomein bevattend eiwit vier op lagere zoutconcentraties dan zonder de remmer. Verschillen in de histonpatronen werden waargenomen toen cellen werden behandeld met een histondeacetylaseremmer, waardoor het landschap van het chromatine veranderde.
Veranderingen in eiwitbinding wanneer cellen genomische stress ervaren, werden ook weerspiegeld in elutieprofielen. Hier suggereerde de toename van de zoutconcentratie die nodig was voor elutie, dat Polybromo 1 zich sterker aan chromatine bindt na DNA-schade met Doxorubicine. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee tot drie uur worden uitgevoerd als het op de juiste manier wordt uitgevoerd.
Denk er bij het uitvoeren van deze procedure aan om zo consistent mogelijk te zijn met uw behandeling van elk monster. Deze procedure kan worden gebruikt in de eerste stappen van een studie om het mechanisme en de regulatie van een chromatine-bindend eiwit te verduidelijken. Dit bespaart tijd en geld op onnodige genoombrede studies.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De procedure voor sequentiële zoutextractie is ontworpen om eiwitbindingsprofielen aan bulkchromatine te karakteriseren en te beoordelen hoe deze bindingen worden beïnvloed door verschillende manipulaties. Deze methode is bijzonder nuttig voor het evalueren van de affiniteit van epigenetische regulatoren voor chromatine.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Chromatinebiologie
- Proteïne-interacties
- Epigenetica
Achtergrond
- Sequentiële zoutextractie is een techniek voor het bestuderen van chromatine-bindende eiwitten.
- Het biedt een snel en kosteneffectief alternatief voor chromatine-immunoprecipitatie (ChIP).
- Deze methode is toegankelijk, zelfs voor onervaren wetenschappers.
- Het maakt het mogelijk om te evalueren hoe eiwitinteracties veranderen onder invloed van genetische, chemische en omgevingsfactoren.
Doel van de studie
- Om de bindingsprofielen van chromatinebindende eiwitten te karakteriseren.
- Om de effecten van diverse manipulaties op de eiwitbinding te evalueren.
- Om een eenvoudige methode te bieden voor onderzoekers in het chromatineveld.
Gebruikte methoden
- Oogsten van 8.000.000 cellen van elke relevante cellijn.
- Sequentiële zoutextractie om chromatinegebonden eiwitten te isoleren.
- Beoordeling van de bindingsaffiniteit van eiwitten aan chromatine.
- Evaluatie van veranderingen in bindingsprofielen onder verschillende condities.
Belangrijkste Resultaten
- De methode kenmerkt effectief eiwitbindingsprofielen.
- Het demonstreert hoe bindingsaffiniteiten kunnen worden beïnvloed door omgevingsfactoren.
- De resultaten wijzen op het nut van deze techniek voor zowel ervaren als beginnende onderzoekers.
- Biedt inzichten in de interacties van epigenetische regulatoren met chromatine.
Conclusies
- Sequentiële zoutextractie is een waardevol instrument voor het bestuderen van chromatin interacties.
- De methode is efficiënt en toegankelijk voor diverse onderzoeksapplicaties.
- Het vergroot het inzicht in de dynamiek van eiwitbinding in de chromatinbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Sequentiële zoutextractie (SSE) biedt een snelle, kostenefficiënte methode om de affiniteit van chromatinebindende eiwitten te evalueren, wat vroege validatie van targets mogelijk maakt bij drug discovery gericht op epigenetica. Door te kwantificeren hoe genetische, chemische of omgevingsperturbaties de eiwit-chromatine-interacties veranderen, ondersteunt SSE de mechanistische risicoreductie van chromatine-modificerende complexen voordat er wordt overgegaan tot resource-intensieve assays. Deze benadering verbetert het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen door directe bindingseffecten te onderscheiden van indirecte cellulaire responsen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Meet veranderingen in de relatieve bindingsaffiniteit wanneer complex-subunits verloren gaan of domeinen worden geïnactiveerd, wat de functionele bijdragen van individuele eiwitten aan de chromatinering verduidelijkt.
- Wetenschappelijke waarde: Profileert elutiepatronen bij toenemende zoutconcentraties om specifieke chromatinbinding te onderscheiden van aspecifieke associaties, waardoor het aantal fout-positieven bij targetvalidatie wordt verminderd.
- Operationele waarde: Stelt niet-experts in staat om kwantitatieve bindingsgegevens te genereren zonder gespecialiseerde ChIP-expertise, wat het testen van hypothesen in een vroeg stadium versnelt.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert reproduceerbare elutieprofielen die dienen als kwantitatieve read-outs voor het screenen van effecten van verbindingen op veranderingen in het chromatinelandschap.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van standaard western blot-infrastructuur en beeldanalyse, wat de standaardisatie van de assay tussen laboratoria vergemakkelijkt en technische variabiliteit vermindert.
- Operationele waarde: Vereist enkel basisapparatuur voor centrifugatie en elektroforese, waardoor de drempel voor implementatie in screeningcascades voor epigenetische modulatoren wordt verlaagd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppel wijzigingen in de chromatinomgeving (bijv. via HDAC-remmers) aan veranderingen in eiwitbinding, ter ondersteuning van mechanistische studies die zijn afgestemd op biomarkers in ziekterelevante systemen.
- Wetenschappelijke waarde: Evalueert verschuivingen in binding onder genomische stress (bijv. doxorubicine-geïnduceerde DNA-schade), wat bijdraagt aan voorspellende modellen van target-engagement onder pathofysiologische omstandigheden.
- Operationele waarde: Vult cellulaire en biochemische assays aan door orthogonale validatie van de continuïteit van chromatine-interacties te bieden, van de ontdekkingsfase tot de preklinische stadia.
Integratie van pipeline en workflow
SSE past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie en biedt een mechanistische brug tussen biochemische bindingsassays en cellulaire fenotypische read-outs in epigenetica-programma's.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door te kwantificeren hoe complexe wijzigingen de chromatinbinding beïnvloeden, waardoor pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie van epigenetische targets mogelijk worden.
- Screening: Levert zoutafhankelijke elutieprofielen als kwantitatieve output voor het vergelijken van door verbindingen geïnduceerde veranderingen in de chromatinstatus over verschillende screeningscampagnes.
- Analytics: Genereert bandintensiteitsgegevens uitgezet tegen de zoutconcentratie, wat leidt tot berekenbare verschuivingen in bindingsaffiniteit die discussies over structuur-activiteitsrelaties informeren.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro bindingsveranderingen aan modificaties van het cellulaire chromatinlandschap, wat de afstemming van translationele biomarkers ondersteunt wanneer dit wordt gekoppeld aan functionele read-outs.
- Enterprise hergebruik: Vertegenwoordigt een gestandaardiseerde, kosteneffectieve capaciteit die toepasbaar is op meerdere chromatin targets, wat platformhergebruik bevordert in pipelines voor epigenetische geneesmiddelenontwikkeling.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door directe chromatinebinding te onderscheiden van indirecte cellulaire effecten via gecontroleerde zoutelutie.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, kwantitatieve bindingsprofielen met behulp van veelvoorkomende laboratoriumapparatuur, waardoor de standaardisatie tussen teams wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Vermindert de afhankelijkheid van lage-throughput ChIP voor initiële bindingsbeoordelingen, wat de kapitaalefficiëntie in vroege epigenetica-projecten verbetert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets voor chromatine-modificerende complexen mogelijk op basis van kwantitatieve bindingsresistentie tegen omgevingsperturbaties.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in chromatinbiochemie en western blot-kwantificering om een nauwkeurige interpretatie van het elutieprofiel te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot gekoelde centrifuges, microcentrifugebuisjes en standaard SDS-PAGE/western blot-instrumentarium.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor het oogsten en lyseren van cellen om variabiliteit tussen monsters te minimaliseren en vergelijkbare resultaten bij zoutextractie te garanderen.
- Omvat optimalisatie van de incubatietijden voor elk doeleiwit, aangezien de kinetiek van de bindingsvrijgave varieert tussen chromatin-modificerende complexen.
- Beperkt tot relatieve affiniteitsvergelijkingen; absolute bindingsconstanten vereisen orthogonale biofysische methoden voor validatie.
