Genereren van iPSC afgeleide Human Brain Organoids naar Early Neurodevelopmental Disorders Model

Het algemene doel van dit protocol voor het genereren van iPSC-afgeleide menselijke hersenorganoïden is het modelleren van vroege menselijke neuro-ontwikkelingsstoornissen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de menselijke hersenontwikkeling, zoals de rol van synthesomen en cilia bij nieuwe neurogenese en primaire microcefalie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een robuust en snel model is om reproduceerbare resultaten te verkrijgen uit iPSC-afgeleide hersenorganoïden van patiënten.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Elke Gabriel, een postdoc uit mijn laboratorium aan het Center for Molecular Medicine, Keulen. Om deze procedure te starten, verzamelt u de neurosferen met een 200 µL micropipet met een tip van twee millimeter die vooraf met steriele scharen is afgeknipt. Plaats de neurosferen vervolgens met een onderlinge afstand van ongeveer 5 mL op een paraffinefolie in een schaal van 100 mL.

Verwijder vervolgens voorzichtig zoveel mogelijk van het resterende medium. Voeg daarna een druppel EHS-matrix toe aan elke individuele neurosfeer. Incubeer de druppels EHS-matrix met de neurosferen gedurende 15 minuten bij 37 °C.

Was daarna de neurosferen voorzichtig van de paraffinefilm door ze te spoelen met neurosfeermedium. Incubeer de neurosferen vervolgens gedurende de volgende vier dagen en voeg op dag twee twee millimeter vers neurosfeermedium toe. Voeg bij deze procedure 100 milliliters hersen-organoïdmedium toe aan elke spinner-fles via de zijarmen.

Verwarm het medium vooraf in de incubator op 37 °C gedurende ten minste 20 minuten. Zorg vervolgens dat de neurosferen allemaal gescheiden zijn. Als twee of meer sferen met elkaar verbonden zijn via de EHS-matrix, scheid deze dan door de verbindende matrix met een scalpel door te snijden.

Stel een roerprogramma in op 25 RPM. Breng de in de EHS-matrix ingebedde neurosferen voorzichtig over naar de spinner-kolven die 100 milliliters organoïdenmedium bevatten. Plaats vervolgens de spinner-kolven op een magnetisch roerplatform in de incubator voor 14 dagen bij 37 degrees celsius.

Dit is dag nul van de organoïdenkweek. Verschoon het medium één keer per week door de helft van het medium te verwijderen en dezelfde hoeveelheid vers medium toe te voegen. Verzamel in deze stap op dag 14 de organoïden uit de kweek in de spinnerflask met een vooraf afgesneden micropipet van 1 mL.

Plaats ze allemaal in een schaal van 60 millimeter en was ze eenmaal met vijf milliliter warm DMEM F12 gedurende drie minuten. Bereid vervolgens een buisje van 1,5 milliliter voor met 500 microliters warme 4% PFA. Plaats elke organoïde afzonderlijk in een buisje en fixeer ze gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur.

Gebruik vervolgens een inoculatielus om de organoïden te verwijderen. Verwijder daarna de PFA en was de gefixeerde organoïden twee keer gedurende 10 minuten met één milliliter PBS. Bewaar de organoïden vervolgens in één milliliter PBS bij vier graden celsius gedurende maximaal 7 dagen voor verder gebruik.

Om de organoïden in te bedden voor cryosectie, verwijdert u de PBS en voegt u 1 milliliter 30% sucrose-oplossing toe aan elke buis om de organoïden te dehydrateren voordat ze worden cryogevroren. Na het toevoegen van de sucrose-oplossing moeten de organoïden aan het oppervlak drijven. Bewaar de organoïden overnacht in de sucrose-oplossing bij vier graden celsius.

Tegen de volgende dag zouden de organoïden naar de bodem van de buis gezakt moeten zijn. Vul daarna een vinyl monster-mal met 400 milliliters OCT-compound. Gebruik vervolgens een inoculatielus om een organoïde in het midden van de mal te plaatsen.

Label de rand van de mal met de naam van het monster. Vries de mal met de organoïde vervolgens in bij -80 °C tot het moment van cryosectie. Coat daarna de glazen cryoslides met 0,1% PLL en PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Laat de coupes vervolgens drie uur drogen. Bewaar de coupes bij vier graden celsius en laat ze voor gebruik opwarmen tot kamertemperatuur. Snijd daarna de cryogevroren organoïden in plakjes van 20 tot 50 micrometer dikte op de PLL-gecoate glazen cryocoupes.

Laat de coupes één uur drogen bij kamertemperatuur en bewaar de coupes bij -80 °C tot verdere verwerking. Immunofluorescentie-imaging van cryosecties van organoïden die een typische VZ en de primitieve corticale plaat vertonen. De VZ strekt zich uit van de apicale zijde tot de basale zijde.

Let op dat de cellen binnen de VZ een palisade-achtige kernstructuur vertonen, wat suggereert dat het radiale glia-cellen zijn. Het rechterpaneel toont de immunofluorescente kleuring van Nestine-positieve NPC's binnen de VZ en TUJ1-positieve neuronen in de primitieve corticale plaat. Hier worden twee voorbeelden getoond van VZ's gekleurd met PVIM en ARL 13B.

De gebieden die zijn gemarkeerd met witte vierkantjes zijn vergroot weergegeven. Apicale radiale gliale cellen die zich aan de apicale zijde van de VZ delen, zijn PVIM-positief. Het delingsvlak van een cel in de anafase is horizontaal ten opzichte van de lijn van het lumenoppervlak, die is gemarkeerd door ARL 13B-kleuring.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 23 dagen worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om periodiek kwaliteitscontroles en microplasmacontroles van de culturen uit te voeren. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van neurobiologische ontwikkeling om de mechanismen van neuro-ontwikkeling in menselijke hersenorganoïden te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe menselijke hersenorganoïden kunnen worden gegenereerd uit verschillende iPSC-cellijnen, inclusief patiëntencellijnen met aangetaste cellulaire functies.