Rijping van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten als Biowires gebruiken elektrische stimulatie

Het algemene doel van deze procedure is om gecontroleerde driedimensionale celkweekmethoden in elektrische stimulatie te gebruiken om de rijping van humane embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten te bevorderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van cardiale weefselengineering, inclusief hoe verschillende elektrische stimulatieparameters of tijdsduur de functie van cardiale cellen en de rijpingstoestand beïnvloeden. De eindresultaten zijn geëngend menselijk hartweefsel met verbeterde maturiteit.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar diagnostische toepassingen zoals het testen van de veiligheid en werkzaamheid van nieuwe geneesmiddelen omdat cardiomyocyten met volwassen kenmerken zoals elektrische voortgang waarschijnlijk dienen als nauwkeuriger modellen van menselijke hartcellen in geneesmiddelscreeningsstudies. Combineer de PDMS-monomeer en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 en meng goed. Laat het vijf minuten staan om te degasseren.

Laad vervolgens een petrischaal met de master voor de biowire-sjabloon met het PDMS-mengsel. Probeer de vorming van luchtbellen te minimaliseren. Cureer vervolgens het PDMS gedurende twee uur bij 70 graden Celsius.

Herstel vervolgens de gesolidificeerde mal door eerst een scherp mes rond de randen te gebruiken en het vervolgens weg te pellen. Trim vervolgens het overtollige PDMS en verzamel alle sjablonen in een sterilisatiezak. Stoomautoclaveer de sjablonen gedurende 20 minuten bij 121 graden Celsius.

Laad vervolgens elke sjabloon onder de ventilatie van een bioveiligheidskabinet in een steriele petrischaal. Gebruik nu voor elke sjabloon pincetten om een ​​stuk steriele 6.0 zijdedraad in de groef te plaatsen die de hele kanaal overspant. De sjablonen zijn nu klaar voor celzaaien.

De draad zal dienen als sjabloon voor de vorming van 3D-constructies die zich langs de draadassen uitlijnen en de vorm van hartvezels nabootsen. Maak voor elke kamer een paar rechthoekige polycarbonaat stukken om als frame voor de elektrische stimulatiekamer te dienen. Boor langs de middellijn van elk stuk twee drie millimeter brede gaten, twee centimeter uit elkaar.

Bereid voor elke kamer twee 1,5 centimeter lange koolstofstaven voor. Boor ongeveer 3 millimeter van het uiteinde van elke staaf een 1 millimeter breed gat. Draai vervolgens elke draad door een gat met een platinadraad en wikkel een uiteinde van de draad om de staaf.

Voor elke kamer plaats je twee staven tussen twee polycarbonaat stukken om een ​​frame te maken. Giet vervolgens ongeveer twee milliliter PDMS in een put van een zes-putplaat en plaats het frame in de put met PDMS, waarbij de bodem van de frames ondergedompeld wordt. Cureer het PDMS gedurende twee uur bij 70 graden Celsius zodat het PDMS het frame zeker houdt.

Verwijder vervolgens de voltooide kamer van de plaat met het PDMS eraan. Om de functie van een geassembleerde kamer te testen, verbind de platina draden met een batterij en gebruik een voltmeter om te controleren of er elektriciteit door de staven wordt geleid. Breng nu de functionele kamers over in een sterilisatiezak en gebruik 20 minuten stoomsterilisatie bij 121 graden Celsius om ze voor celkweek klaar te maken.

Om het gel voor te bereiden, koel alle gelcomponenten voor op ijs voordat je ze in een steriele buis mengt. Zorg ervoor dat je het collageen en de extracellulaire matrix als laatste toevoegt en meng de componenten met behulp van pipetteren. Voor de cellen heb je cardiomyocyten die gedifferentieerd zijn uit menselijke pluripotente stamcellen.

Verzamel de cellen en bereid voor elke biowire-voorbereiding 3,5 microliter collageengel met een half miljoen cellen. Gebruik nu een P10-pipettip om ongeveer vier milliliter suspensie in de 0,5 centimeter lange kanaalsjabloon in elke schaal te laden. Pas de positie van de draad aan met steriele pincetten zodat deze volledig is uitgerekt.

Zorg ervoor dat je het gelcelmengsel altijd opnieuw suspendeert voordat je autoclaveert om consistente resultaten te krijgen. Bedek na het laden van de kanalen de bodem van de schaal met steriele PBS en zorg ervoor dat je het gel niet raakt. Dit zorgt ervoor dat de biowires tijdens de polymerisatie niet uitdrogen.

Na incubatie van de biowires gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, vervang de PBS door voldoende kweekmedium om de cellen te bedekken. 12 milliliter is meestal voldoende. Kweek vervolgens de schaal een week lang en ververs het medium om de dag.

Voeg in een bioveiligheidskabinet twee milliliter PBS toe aan elke put van een zes-putplaat die een elektrische stimulatorkamer zal huisvesten. Gebruik vervolgens steriele pincetten om de autoclaafapparaten voorzichtig in de putten te plaatsen. Eenmaal op hun plaats, gooi de PBS weg en vervang het door vijf milliliter warm medium dat de koolstofstaven volledig moet bedekken.

Voordat je de cellen gedurende 24 uur kweekt, observeer je de contractiliteit van de cardiomyocyten als reactie op elektrische stimulatie om er zeker van te zijn dat de cellen het elektrische stimulus opvangen en reageren met contracties. Plaats vervolgens de biowires in de elektrische stimulatorkamer en richt de kanalen loodrecht op de koolstofstaven. Steek de platina draden weg van de plaat en bedek vervolgens de platen.

Verbind de draden met een elektrische stimulator. Stel de stimulator in om bifasische pulsjes van één milliseconde te leveren bij één hertz en bij drie volt per centimeter. Breng vervolgens de preparaten in de elektrische stimulator over naar een incubator bij 37 graden Celsius.

Verhoog de stimulatiefrequentie elke 24 uur incrementeel van één hertz op dag nul tot zes hertz op dag zes. Gedurende deze week van kweek, ververs het medium om de dag. En observeer de contractiliteit van de cardiomyocyten dagelijks.

Na zeven dagen precultuur in de biowire hebben de cellen het gel rond de draad omgevormd. De cellen zijn geassembleerd langs de as van de draad om uitgelijnde hartweefsel te vormen. De cellen hebben hartcontractiele eiwitten geëxpresseerd, vertoonden sarcomere banding in het contractiele apparaat en hun myofibrillen waren