Name: Rijping van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten als Biowires gebruiken elektrische stimulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Leer hoe je menselijke stamcel-afgeleide cardiomyocyten rijpt met behulp van elektrische stimulatie in een biowire-platform. Deze methode verbetert de volwassenheid van cardiaal weefsel voor nauwkeuriger geneesmiddelenonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie-in-steun van de Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14-0.006.265), operationele subsidies van de Canadese Institutes of Health Research (137.352 en 143.066), en een JP Bickell stichting subsidie ​​(1.013.821 ) aan SSN.

1. Master ontwerp en de fabricage OPMERKING: Gebruik een zachte lithografie voor fabricage van de inrichting. Maak een tweelaags SU-8 meester voor polydimethylsiloxaan (PDMS) gieten. <ol><li> Ontwerp het apparaat met een ontwerp en conceptsoftware (Figuur 1A, links). Trekken elke laag van de master gescheiden. Druk het ontwerp apparaat twee fotomaskers bij 20.000 dpi, overeenkomen met de twee lagen van de master 15. Stel de inrichtingpatroon doorzichtig en de omgeving zo donker; de maskers zal dienen als de matrijs optisch op SU-8 overdragen inrichtingpatroon door lithografie (zoals beschreven door anderen 15). </li><li> Afzien ongeveer 4 ml SU-8 50 op het midden van een 4 inch siliciumwafel. Coat de SU-8 50 gelijkmatig over de wafer met gebruik van een spin coater door spinnen bij 2000 omwentelingen per minuut (rpm) gedurende 30 s. Bak de wafer op een kookplaat 95 ° C gedurende 10 minuten. Maak de wafer aan ultraviolette (UV) livechten bij 200 mJ / cm2. </li><li> Giet ongeveer 4 ml SU-8 2050 op het midden van de wafel en centrifugeren bij 2500 rpm gedurende 30 s. Bakken op 95 ° C hete plaat gedurende 15 min. Koel af tot kamertemperatuur (RT). </li><li> Herhaal stap 1.3 twee keer. </li><li> Bedek de beklede wafer met de eerste laagtransparantie fotomasker. Maak de wafel UV licht bij 270 mJ / cm2 aan de eerste laag te maken. Bakken op 95 ° C hete plaat gedurende 15 min. </li><li> Maak de tweede laag van SU-8 2050 door het herhalen van stap 1,3 maal. </li><li> Lijn de tweede laag masker om de functies op de eerste laag een masker aligner. Dan, bloot te stellen aan UV-licht bij 240 mJ / cm2. Bakken bij 95 ° C gedurende 15 minuten. OPMERKING: De belichtingstijd wordt bepaald door de vereiste totale UV-dosis en de UV lichtopbrengst intensiteit gemeten op de dag voorafgaand aan gebruik. </li><li> Ontwikkeling van de wafer door het onder te dompelen in propyleenglycol monomethylether acetaat (PGMEA) en geschud bij 200 rpm gedurende 30 minuten op een rondschudapparaat. </li><li> Plaatsde master in een petrischaal en giet het mengsel PDMS (base verknopingsmiddel in een verhouding van 10: 1 op gewichtsbasis) in het midden van de wafel. Bedek alle functies en vermijd luchtbellen. </li><li> Verhit in een oven bij 70 ° C gedurende 2 uur. Met een scherp mes rond de rand van de PDMS biowire template (Figuur 1A, rechts) te snijden. Schil de PDMS van de master. Trim de inrichting met het blad. Zet de PDMS biowire matrijs in een sterilisatie zakje en stoom autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> In een bioveiligheid kast (BSC), plaatst u de PDMS biowire template in een petrischaal. Met een pincet te houden en monteer een stuk steriel chirurgisch zijden hechtdraad (6-0) in het midden van het kanaal van de PDMS microputjes door plaatsing in de groeven aan beide uiteinden van het kanaal (Figuur 1B-I). </li></ol> 2. Het creëren van de elektrische stimulatie Chamber <ol><li> Voeg een paar rechthoekige stukken polycarbonaat (lengte x breedte x dikte: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) en gebruik ze als het frame van de elektrische stimulatie kamer (figuur 2). </li><li> Boor twee gaten 3 mm breed 2 cm uit elkaar langs de hartlijn van elk polycarbonaat kozijndeel. </li><li> Snij twee stukken van 1,5 cm koolstofstaven. Boor een 1 mm breed gat door de koolstaaf ongeveer 3 mm van het einde. Draad een platinadraad met het koolstofatoom staafgat en draai de draad door het wikkelen rond de koolstof staaf. Bevestig een clip aan het andere einde van de platinadraad later verbinding met de elektrische stimulator. </li><li> Plaats de koolstof staven in het polycarbonaat raambenen. Plaats de gemonteerde frame koolstof staven in een putje van een plaat met zes putjes. </li><li> Pour 2 mL PDMS in de put. Dompel de onderkant van het polycarbonaat frames in PDMS terwijl het PDMS maaiveld dichtbij, maar de bodem van de koolstofstaven niet bereiken. Verhit in een oven bij 70 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Neemt de elektrische stimulatie kamer van de zes-well bord en zet het in een sterilisatie zakje voor stoomsterilisatie bij 121 ° C gedurende 20 minuten. </li></ol> 3. Enzymatische dissociatie van HPSC-CM <ol><li> HPSC induceren te differentiëren tot hartspiercellen middels een vaststaand protocol 4. OPMERKING: kort genereren hartspiercellen via vastgesteld embryoiden lichaam (EB) voorschriften steel pro medium door de achtereenvolgende suppletie met bot morfogenetisch proteïne 4, basische fibroblast groeifactor, activine A, vasculaire endotheliale groeifactor, en Dickkopf homoloog 1 4. Gebruik EBS vanaf dag 20-34 van differentiatie te biowires te maken. </li><li> Verzamel de EBS van de lage plaat bevestiging met een P1,000 pipetpunt en overbrengen naar een conische buis. Pellet door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 125 x g en kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met voorverwarmd, 37 ° C collagenase type I met 1% desoxyribonuclease I (DNAse I). Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uurvoor de spijsvertering. </li><li> Voeg 5 ml voorverwarmd, 37 ° C wasmedium en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 125 x g en kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet met 2 ml trypsine ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) -oplossing / en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 1 ml stop medium met 3% (v / v) DNase I. </li><li> Bevestig een 20 G (0,9 mm) naald in een 5 ml spuit en laat de EB suspensie doorheen 3-5 keer. </li><li> 7 ml wasmedium en centrifugeer bij 280 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in Iscove&#39;s gemodificeerd Dulbecco&#39;s medium (IMDM) en bewaar op ijs. Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer. Neem 0,5 x 10 6 cellen en pellet door centrifugatie bij 280 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Pre-cool alle gelcomponenten op ijs alvorens ze te mengen in een steriele buis. Meng de volgende collageengel componenten (eindconcentratie): 2,1 mg / ml rattenstaart collageen type I, 24,9 mM glucose, 23,8 mM NaHCO 3, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES en 10% extracellulaire matrix 1x M199 medium. Voeg de collageen en extracellulaire matrix laatste. Meng door en neer te pipetteren. </li><li> Resuspendeer 0,5 x 10 6 cellen met 3,5 pl collageen gel en meng goed. </li><li> Gebruik een P10 pipettip 4 pi van de celsuspensie toe te voegen van 0,5 cm lang kanaal (Figuur 1B-II). Stel de positie van de hechtdraad met een steriel pincet indien nodig. </li><li> Bedek de bodem van de petrischaal met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en let niet aan de gel raken. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Vervang PBS met 12 ml kweekmedium (bijvoorbeeld stam pro of medium door de fabrikant cel), voldoende om de cellen (Figuur 1B-III) te dekken. Kweken in een incubator bij 37 ° C gedurende 1 week. Verander het medium om de andere dag. </li></ol> 4. Elektrische stimulatie voor Biowire Teelt <ol><li> Inde BSC, voeg 2 ml PBS aan elk putje van een plaat met zes putjes die een elektrische stimulator kamer zal huisvesten. Gebruik steriele pincet plaats voorzichtig het geautoclaveerde elektrische stimulatie-inrichting in de put. Gooi de PBS uit de put. </li><li> Bedek de koolstofstaven met 5 ml voorverwarmd kweekmedium. Gebruik steriele pincet om de biowires de elektrische stimulatie kamer monteren en richt ze loodrecht op de koolstof staven (figuur 2). </li><li> Plaats het deksel bovenop de plaat met zes putjes, maar laat voldoende platinadraden bereiken buiten de plaat te verbinden met de elektrische stimulator. Plaats de plaat met zes putjes in een cel incubator bij 37 ° C en sluit de platinadraad de elektrische stimulator. </li><li> Stimuleren biowires via een elektrische stimulator met de volgende instellingen: tweefasige herhalende puls 1 ms pulsduur, 3 V / cm en 1 puls per seconde (PPS). Breng de PPS elke 24 uur de volgende waarden: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15, en 6. Wijziging van het medium om de andere dag. </li><li> Let op de cardiomyocyt contractiliteit in reactie op elektrische stimulatie onder een microscoop bij 10x vergroting. NB: Na een week van de stimulatie, de biowires volwassen wordt (zie de resultaten sectie). </li></ol>

<ol><li>Sun, X., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+hydrogel-based+strategies+for+application+in+cardiac+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration.</a> Biomed Mater. 10 (3), 034005(2015).</li>
<li>Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+strategies+of+engineered+tissues+and+their+application+in+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration.</a> Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).</li>
<li>Hastings, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+and+cell+delivery+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug and cell delivery for cardiac regeneration.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiovascular+progenitor+cells+develop+from+a+KDR%2B+embryonic-stem-cell-derived+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population.</a> Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Snir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+ultrastructural+and+proliferative+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).</li>
<li>Dolnikov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+intracellular+Ca2%2B+handling+and+the+role+of+sarcoplasmic+reticulum+in+the+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction.</a> Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).</li>
<li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adolescence%3A+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).</li>
<li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+a+differentiated+cardiac+muscle+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct.</a> Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).</li>
<li>Radisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assembly+of+engineered+myocardium+by+electrical+stimulation+of+cardiac+myocytes+cultured+on+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).</li>
<li>Schaaf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+engineered+heart+tissue+as+a+versatile+tool+in+basic+research+and+preclinical+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology.</a> PLoS One. 6 (10), e26397(2011).</li>
<li>Tulloch, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+engineered+human+myocardium+with+mechanical+loading+and+vascular+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture.</a> Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).</li>
<li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biowire%3A+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li>
<li>Lake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/protocolexchange/protocols/4049">Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li>
<li>Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+applications+for+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Cardiac applications for human pluripotent stem cells.</a> Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+for+advanced+functional+maturation+of+human+ESC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes.</a> Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).</li>
<li>Radisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+correlate+with+cell+density+and+cell+viability+in+engineered+cardiac+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue.</a> Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dit manuscript beschrijft de opzet en uitvoering van de gemanipuleerde platform, biowire, om de rijping van HPSC-CM&#39;s te verbeteren. De inrichting kan worden vervaardigd in standaard microfabricage faciliteiten en biowires kunnen worden met gemeenschappelijke celkweek technieken en een elektrische stimulator. Voor zover wij weten, is er geen methode gerapporteerd vergelijkbaar met biowires. Deze strategie blijkt dat een betere rijping eigenschappen waren afhankelijk van de elektrische st...

Cel-gebaseerde therapie is een van de meest veelbelovende en onderzocht strategieën om cardiale reparatie / regeneratie te bereiken. Het is geholpen door hartweefsel engineering en co-afgifte van biomaterialen 1, 2. De meeste beschikbare bronnen van cellen zijn onderzocht in diermodellen voor hun mogelijk gunstige effecten op beschadigde, zieke of oude harten 3. In het bijzonder zijn aanzienlijke inspanningen gedaan om pluripotente stamcellen humaan gebruik (HPSC) afgeleide cardiomyocyten (HPSC-CM), een potentieel onbeperkte bron van autologe cellen voor cardiale tissue engineering. HPSC-CM&#39;s kunnen worden geproduceerd met behulp van verschillende vastgestelde protocollen 4, 5, 6. De verkregen cellen vertonen foetaal-achtige fenotypen met verschillende onvolwassen kenmerken in vergelijking met volwassen ventriculaire hartspiercellen 7, </sup&gt; 8. Dit kan een belemmering vormen voor de toepassing van HPSC-CM&#39;s als modellen van volwassen hartweefsel in drug discovery onderzoek en in de ontwikkeling van volwassen hartziekten modellen 9 zijn. Om deze beperking van de fenotypische onvolwassenheid te overwinnen, zijn nieuwe benaderingen actief onderzocht om cardiomyocyt rijping te promoten. Vroege studies toonden effectieve pro-rijping eigenschappen in neonatale cardiomyocyten van de rat via cyclische mechanische of elektrische 10 stimulatie 11. Gel verdichting en cyclische mechanische stimulatie werd ook aangetoond dat bepaalde aspecten van HPSC-CM maturatie 12, 13, met een minimale verhoging van de elektrofysiologische en calcium hanteringseigenschappen te verbeteren. Daarom is een platformsysteem genaamd &quot;biologische wire&quot; (biowire) werd ontwikkeld door zowel structurele signalen en elektrisch veld stimulatien de rijping van HPSC-CM 14 verbeteren. Dit systeem gebruikt een microfabricated platform gericht cardiaal weefsel dat geschikt is voor elektrisch veld stimulering te creëren. Dit kan worden gebruikt om de structurele en elektrofysiologische looptijd HPSC-CM verbeteren. Hier beschrijven we de details van het maken van dergelijke biowires.

```html
<table><tbody><tr><td>L-Ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>A-4544</td><td>hPSC-CM-kweekmediumcomponent</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk, Inc</td><td></td><td>Software om apparaat te ontwerpen</td></tr><tr><td>Carbon rods, &Oslash; 3 mm</td><td></td><td></td><td>Component elektrische stimulatorkamer</td></tr><tr><td>Collagen, type 1, rat tail</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>Collageengel: 2,1 mg/mL type I rattail collageen in 24,9 mM glucose, 23,8 mM NaHCO3, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199-medium met 10 % groeifactor-verminderd Matrigel.</td></tr><tr><td>Collagenase type I&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>0,2% collagenase type I (w/v) en 20% FBS (v/v) in PBS met Ca2+ en Mg2+. Steriliseer met 0,22 &mu;m-filter en maak 12 mL-aliquots. Bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNase I)</td><td>EMD Millipore</td><td>260913-25MU</td><td>Maak 1 mg/mL DNase I-stamplossing in water. Filter steriel en bewaar 0,5 mL-aliquots bij &minus;20 &deg;C</td></tr><tr><td>Boor &amp; boorbits (&Oslash; 1 mm en 2 mm)</td><td>Dremel</td><td></td><td>Boor gaten in polycarbonaat frames</td></tr><tr><td>Elektrische stimulator</td><td>Grass</td><td>s88x</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovien serum (FBS)</td><td>WISENT Inc.</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>Collageengel component</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>MilliQ</td><td></td><td>18,2 M&Omega;&middot;cm bij 25 &deg;C, ultrapuur, om alle oplossingen te maken</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Collageengel component</td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Torrey Pines</td><td>HS40</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>EVG&nbsp;</td><td>EVG 620</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, growth factor reduced&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Collageengel component</td></tr><tr><td>Medium 199 (M199)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11825015</td><td>Collageengel component</td></tr><tr><td>Monothioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M-6145</td><td>hPSC-CM-kweekmediumcomponent</td></tr><tr><td>Orbitale shaker</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (P/S)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met Ca2+ en Mg2+&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Plaat (6-well)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Plaat (6-well), lage binding</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Platinedraden, 0,2 mm</td><td></td><td></td><td>Component elektrische stimulatorkamer</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Propyleenglycolmonomethyletheracetaat (PGMEA)</td><td>Doe &amp; Ingalls Inc.</td><td></td><td>Om de wafer te ontwikkelen</td></tr><tr><td>Zak, peel-open</td><td>Convertors</td><td>92308</td><td>Voor stoomsterilisatie</td></tr><tr><td>Siliciumwafer, 4 inch</td><td>UniversityWafer Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat (NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Collageengel component</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Collageengel component</td></tr><tr><td>Sprin coater</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-34-kweekmedium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10639011</td><td>hPSC-CM-kweekmedium. Om 50 mL te maken, voeg 1,3 mL supplement toe, 500 &mu;L van 100&times; L-Glutamine, 250 &mu;L van 30 mg/mL transferrine, 500 &mu;l van 5 mg/mL ascorbinezuur, 150 &mu;L van 26 &mu;l /2 mL monothioglycerol (MTG), en 500 &mu;L (1 %) penicilline/streptomycine.</td></tr><tr><td>Stop media</td><td></td><td></td><td>Wasmedium: FBS (1:1)</td></tr><tr><td>SU-8 50&nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>fotoresist, master component</td></tr><tr><td>SU-8 2050&nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>fotoresist, master component</td></tr><tr><td>Transferrine</td><td>Roche</td><td>10-652-202</td><td>hPSC-CM-kweekmediumcomponent</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA, 0,25%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>hPSC-CM-kweekmediumcomponent</td></tr><tr><td>Wasmedium</td><td></td><td></td><td>IMDM met 1% Penicilline/Streptomycine</td></tr></tbody></table>
```

rijping van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten als biowires gebruiken elektrische stimulatie

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Human pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (HPSC-CMS) hebben een veelbelovende bron van cellen geweest en hebben dus moedigde het onderzoek naar hun potentiële toepassingen in cardiale onderzoek, met inbegrip van de ontdekking van geneesmiddelen, de ziekte van modellering, tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Cellen die door bestaande protocollen geven een reeks onrijpheid vergeleken met natief volwassen ventriculaire hartspiercellen. Vele pogingen zijn gedaan om te rijpen HPSC-CM&#39;s, met slechts een matige rijping tot nu toe bereikt. Daarom is een ontworpen systeem, genaamd biowire is bedacht door zowel fysische en elektrische signalen leiden HPSC-CM naar volwassen toestand vitro. Het systeem gebruikt een microfabricated platform HPSC-CM zaad collageen type I gel langs een stijve matrijs hechtdraad assembleren tot uitgelijnde hartweefsel (biowire), die wordt onderworpen aan elektrisch veld stimulering met een progressief toenemende frequentie. Vergeleken met niet gestimuleerde controlesbiowired gestimuleerde cardiomyocyten vertonen een verhoogde mate van structurele en elektrofysiologische rijping. Dergelijke veranderingen zijn afhankelijk van de stimulatiefrequentie. Dit manuscript beschrijft in detail de ontwerpen en maken van biowires.

De rationeel gebruik van een hechting in de biowires moet dienen als een matrijs voor het vormen van 3D-constructen die aansluiten op één as en bootsen de vorm van cardiale vezels. We tonen aan dat na zeven dagen van de cultuur in de biowire, cellen gerenoveerd de gel rond de hechtdraad (Figuur 3A). De cellen samengevoegd langs de as van de hechtdraad vormen uitgelijnde hartweefsel (figuur 3). Na 7 dagen voorkweek werden de biowires onderworpen aan 7 dag...

De cardiale biowire platform is een in vitro werkwijze toegepast om menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (HPSC-CM) rijpen combineert driedimensionale celkweek elektrische stimulatie. Dit handschrift bevat de gedetailleerde opzet van de cardiale biowire platform.

Rijping van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten als Biowires gebruiken elektrische stimulatie

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Het algemene doel van deze procedure is om gecontroleerde driedimensionale celkweekmethoden in combinatie met elektrische stimulatie te gebruiken om de rijping van cardiomyocyten te bevorderen die zijn afgeleid van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van cardiac tissue engineering, waaronder hoe verschillende parameters van elektrische stimulatie of de tijdsduur de functie en de rijpingsstaat van hartcellen beïnvloeden. De uiteindelijke resultaten zijn kunstmatig geproduceerde menselijke hartweefsels met een verbeterde rijping.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot diagnostische toepassingen, zoals het testen van de veiligheid en werkzaamheid van nieuwe geneesmiddelen, omdat cardiomyocyten met mature kenmerken, zoals elektrische geleiding, waarschijnlijk nauwkeurigere modellen vormen van menselijke hartcellen in studies naar drugscreening. Combineer de PDMS-monomeer en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 en meng dit goed. Laat het mengsel vijf minuten rusten om te ontgassen.Vul vervolgens een Petrischaal met de master voor het biowire-sjabloon met het PDMS

maturation-human-stem-cell-derived-cardiomyocytes-biowires-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Hier presenteren we een robuust, snel en schaalbaar protocol voor cardiomyocytedifferentiatie voor humane pluripotente stamcellen (hPSC's). Cardiomyocyten die met deze grootschalige methode worden verkregen, kunnen voldoende celgetallen leveren voor hun effectieve gebruik in modellering van menselijke hart- en vaatziekten, high-throughput geneesmiddelenonderzoek en mogelijk klinische toepassingen.

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Elektrofysiologische karakterisering van cardiomyocyten afgeleid van humane Pluripotente Stamcellen (hPSC-CM's) is van cruciaal belang voor cardiovasculaire modellering en voor het bepalen van geneesmiddelreacties. Dit protocol geeft de nodige informatie om hPSC-CM's op multi-elektrode arrays te scheiden en te platen, hun veldpotentiaal te meten en een methode voor het analyseren van QT- en RR-intervallen.

Elektrofysiologische analyse van humane Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM&#39;s) met behulp van multi-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Hier presenteren we een protocol voor de opleiding van de bevolking van een cel met behulp van elektrische en mechanische stimuli emuleren cardiale fysiologie. Deze elektromechanische stimulatie verbetert het cardiomyogenic potentieel van de behandelde cellen en is een veelbelovende strategie voor verdere celtherapie, ziekte modellering en drug screening.

Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

Dit artikel bevat een set van protocollen voor de ontwikkeling van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hartspier (hipsc-cm) netwerken gekweekt op multi well mea platen om reversibel elektroporate de celmembraan voor actie potentiële metingen. Opnamen met hoge doorvoer worden via dezelfde cellocaties herhaaldelijk over dagen verkregen.

Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyte netwerken op multi well micro-elektrode arrays voor terugkerende actie potentiële opnames

Dit protocol beschrijft de procedure voor het doorsnijden en kweken van menselijke cardiale plakjes voor preklinische geneesmiddelentesten en beschrijft het gebruik van optische mapping voor het opnemen van transmembranespanning en intracellulaire calciumsignalen gelijktijdig van deze plakjes.

Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) bieden een alternatief voor het gebruik van dieren voor preklinische cardiotoxiciteitsscreening. Een beperking voor de wijdverbreide toepassing van hiPSC-CMs in preklinische toxiciteitsscreening is het onrijpe, foetale fenotype van de cellen. Hier worden protocollen gepresenteerd voor robuuste en snelle rijping van hiPSC-CMs.

High-throughput cardiotoxiciteitsscreening met behulp van volwassen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenmonolagen

Hier demonstreren we een niet-invasieve contractiliteitsevaluatiemethode voor cardiale medische hulpmiddelen met behulp van 2D-door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM) monolagen, verguld op een flexibel substraat, gekoppeld aan videogebaseerde microscopie. Deze tool zal nuttig zijn voor de in vitro evaluatie van de contractiele eigenschappen van cardiale elektrofysiologische apparaten.

Evaluatie van cardiale contractiliteitsmodulatietherapie in 2D-van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Hier wordt een gevestigde methode beschreven om contractiliteits- en calciummetingen uit te voeren in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met behulp van een op optica gebaseerd platform. Dit platform stelt onderzoekers in staat om het effect van mutaties en de reactie op verschillende stimuli op een snelle en reproduceerbare manier te bestuderen.

Real-time metingen van calcium- en contractiliteitsparameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

Er wordt een reproduceerbare methode gepresenteerd om 3D-myocardiale weefsels te genereren die smelt-elektrospinnende schrijf- (MEW), polycaprolacton (PCL)-steigers en fibrinehydrogels combineren met hiPSC-afgeleide cardiomyocyten en fibroblasten. Deze techniek biedt nauwkeurige controle over de steigerarchitectuur en kan worden toegepast bij preklinische geneesmiddelentests en modellering van hartaandoeningen.

3D generatie van menselijk myocardweefsel met behulp van smeltelektrospinning schrijven van polycaprolactonsteigers en hiPSC-afgeleide hartcellen

Leer hoe je menselijke stamcel-afgeleide cardiomyocyten rijpt met behulp van elektrische stimulatie in een biowire-platform. Deze methode verbetert de volwassenheid van cardiaal weefsel voor nauwkeuriger geneesmiddelenonderzoek.

Rijping van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten als Biowires gebruiken elektrische stimulatie

Meer video's verkennen