Name: Bepaling van de relatieve sterkte van een Anti-TNF monoklonaal antilichaam (mAb) door Neutralizing TNF met behulp van een In Vitro Bioanalytical methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 7 s
Description: Leer hoe u de relatieve sterkte van anti-TNF monoklonale antilichamen bepaalt met WEHI 164-cellen. Deze bioanalytische methode vergelijkt neutralisatie-efficiëntie voor therapeutische ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de nationale Raad voor wetenschap en technologie (CONACYT), Mexico verlenen PEI CONACYT 2015 220333, zonder deelname van het ontwerp van de studie.

1. bereiding van de Media en de oplossingen <ol><li>bereiden het kweekmedium: RPMI-1640 met 10% FBS, pH 7.4.</li>
	<li>Voorbereiden assay kweekmedium: RPMI-1640 zonder fenol rood maar met 1% FBS, pH 7.4.</li>
	<li>Bereiden cell wassen oplossing: DPBS Mg - en Ca-vrije oplossing met 0,02% EDTA, pH 7.4.</li>
	<li>Bereid mobiele-detachement oplossing: 0,125% trypsine met 1 mM EDTA.
	<ol><li>Ontdooien 100 mL van een 0,25% oplossing van trypsine-EDTA en overdracht aan een steriele kolf van 500 mL.</li>
		<li>Mix met 100 mL van cel wassen oplossing en afzien van 15 mL aliquots in 15 mL steriele buizen. Winkel op-70 tot-80 ° C tot gebruik.</li>
		<li>Filteren van deze oplossingen door middel van een membraan van 0.22-µm en warm tot 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan het gebruiken.</li>
	</ol></li> <li>Bereiden apoptosis-inductie stockoplossing TNFα oplossing bij 3.3 µg/mL.
	<ol><li>Los 20 µg TNFα met 500 ÂµL van filter-gesteriliseerd water in de primaire verpakking en meng tot volledige ontbinding.</li>
		<li>Breng kwantitatief over in een steriele tube van 15 mL en voeg 5,5 mL DPBS Mg - en Ca-vrije oplossing tot deze buis. Meng voorzichtig met behulp van een vortex-mixer.</li>
		<li>Aliquot de oplossing in 70 µL porties. Afzien van elk aliquot in 0,5 mL slangen en winkel op -80 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Bereid apoptose inductie-oplossing: TNFα oplossing bij 40 ng/mL.
	<ol><li>Een aliquoot gedeelte van de apoptose inductie stockoplossing, broeden in een waterbad op 25 ˚C voor 10 min. ontdooien</li>
		<li>De apoptose inductie-stockoplossing tot 40 ng/mL verdund door 61 µL van 3.3 µg/mL TNFα oplossing toe te voegen aan 4.939 mL assay voedingsbodem in een steriele tube van 15 mL.</li>
		<li>Mix door vortex-mixer voor 10 s; deze oplossing moet vóór gebruik vers worden bereid.</li>
		<li>De oplossing tot 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan gebruik in th eneutralization assay opwarmen.</li>
	</ol></li> <li>Bereid de substraat oplossing: caspase-3/7 Glo oplossing 7 , 8.
	<ol><li>Ontdooien de caspase-bufferoplossing (caspase-3/7 Glo buffer) 12 h vóór gebruik.</li>
		<li>Laat de caspase-bufferoplossing en het substraat (caspase-3/7 Glo substraat) afzonderlijk op 25 ± 5 ° C gedurende 30 minuten vóór het mengen zitten.</li>
		<li>Overbrengen in 10 mL van de bufferoplossing caspase de substraat flacon en meng door inversie.</li>
		<li>Houden bij 25 ± 5 ° C, licht-beschermd tot gebruik. 
		Opmerking: De oplossing stabiel gedurende 6 uur op kamertemperatuur is.</li>
	</ol></li></ol> 2. Cel Culturing en Counting <ol><li>cel ontdooien en de eerste subcultuur.
	<ol><li>Één flacon met WEHI 164 cellen 9 verwijderen uit een diepvriezer op-80 ˚C en hen overbrengen in een ijsbad.</li>
		<li>Pipetteer omhoog en omlaag met 1 mL voorverwarmde kweekmedium totdat de bevroren cellen volledig ontdooien.</li>
		<li>Afzien van 9 mL voorverwarmde kweekmedium op een steriele tube van 15 mL.</li>
		<li>Breng de celsuspensie in de 15 mL steriele buis en meng voorzichtig vijfmaal door inversie.</li>
		<li>Centrifugeren van de celsuspensie bij 125 x g gedurende 3 min. negeren het supernatant en gedesag van de cel-pellet.</li>
		<li>Voeg 5 mL gestolde voedingsbodem aan de buis. Meng totdat de cellen zijn volledig geresuspendeerde.</li>
		<li>Voor het tellen van de cel, overbrengen 50 µL van de celsuspensie een 500 µL microtube en meng met 50 µL van 0,4% trypan blauw. Cellen tellen en aan te passen aan 0,5 x 10 6 cellen/mL. Stap 2.2, zie hieronder.</li>
		<li>13 mL voorverwarmde kweekmedium aan een 75 mL maatkolf voor de cultuur van de cel toevoegen.</li>
		<li>Genoeg volume schorsing cel uit stap 2.1.6 na een nacht bebroeden bij 37 ° C en 5% CO 2 te bereiken van 0,5 x 10 6 cellen/mL in de cel cultuur kolf afzien.</li>
	</ol></li> <li>Cel tellen. 
	Opmerking: Zie referentie 10.
	<ol><li>Met behulp van de oplossing van stap 2.1.6, 0,05 mL naar een hemocytometer en bepalen van de celdichtheid onder een microscoop met trypan blauwe uitsluiting.</li>
		<li>Kwantificeren van het totale aantal cellen en levensvatbare cellen.</li>
		<li>Aanpassen de schorsingen van de cel naar 0,5 x 10 6 cellen/mL. 
		Vergelijking 1 
		V kweekmedium (mL) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55376/55376eq1.jpg" /> V kweekmedium (mL) = (5 mL - V celsuspensie) V kweekmedium (mL) = de gecorrigeerde hoeveelheid WEHI 164 cel schorsing NVC = aantal levensvatbare WEHI 164 cellen/mL V kweekmedium (mL) = Assay kweekmedium volume toegevoegd aan de celsuspensie tot 0,5 x 10 6 cellen/mL 0,5 x 10 6 = dichtheid van de cel van de Target</li>
	</ol></li> <li>Cel detachement en de tweede en derde subcultuur. 
	Opmerking: Een vacuümsysteem kan worden gebruikt om de oplossingen van de kolven. Wegwerp of glas steriele pipetten kunnen worden gebruikt. Als de pipet een klomp katoen heeft aan de top, het moet worden verwijderd voordat gebruik.
	<ol><li>Het kweekmedium verwijderen uit de celcultuur T-kolf met behulp van een steriele 1 mL-pipet en een vacuüm.</li>
		<li>Afzien 5 mL van cel wash oplossing in de cultuur T-kolf, meng zachtjes, en negeren de oplossing. Herhaal deze stap tweemaal. 
		Opmerking: De volledige verwijdering van de voedingsbodem is van cruciaal belang is voor efficiënte mobiele-detachement.</li>
		<li>Voeg toe 15 mL cell detachement oplossing aan de T-kolf en laat het staan voor 3 min in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.</li>
		<li>Controleert u of het ontbreken van de gekoppelde cellen in de binnenwand van de kolf onder de Microscoop. De cellen verwijderen uit de cultuur T-kolf met behulp van steriele Pipetteer 20 mL en breng ze in een steriele buis van 50 mL.</li>
		<li>Centrifugeren van de celsuspensie bij 125 x g gedurende 3 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet met een andere 5 mL gestolde voedingsbodem.</li>
		<li>Cellen tellen en voeg voldoende kweekmedium te bereiken van de gewenste cel concentratie volgens vergelijking 1.</li>
		<li>Toevoegen van deze suspensie aan een 72 cm 2 T-kolf en na een nacht bebroeden bij 37 ° C en 5% CO 2.</li>
		<li>Subcultuur assay de cellen minstens twee keer voordat u ze gebruikt in de neutralisatie. Herhaal de stappen 2.3.1-2.3.8 voor de komende twee dagen.</li>
	</ol></li> <li>Assay celsuspensie.
	<ol><li>Selecteer een WEHI 164 subcultuur die heeft van ten minste drie passen. Zie stap 2.1.</li>
		<li>Loskoppelen en de cellen volgens stap 2.2 en 2.3 van dit protocol tellen.</li>
		<li>De celsuspensie volgens vergelijking 1 naar 0,5 x 10 6 cellen/mL verdund.</li>
		<li>Gebruiken deze cellulaire schorsing voor de neutralisatie assay. Meng alle cel schorsingen door vortex mixer vóór gebruik.</li>
	</ol></li></ol> 3. Antilichaam voorbereiding en verdunningen <ol><li>kwantificatie van de mAbs.
	<ol><li>Bepalen de concentratie van de referentiestof controlemonster en analytische monster door UV-absorptie bij 280 nm met behulp van hun massale extinctie coëfficiënt (1.39) 11. 
		Opmerking: Oorspronkelijke concentraties kon drug productetiketten worden onttrokken. Echter, dit moet worden geverifieerd door UV-absorptie.</li>
	</ol></li> <li>mAb verdunningen.
	<ol><li>Dilute alle monsters onafhankelijk in drievoud, met DPBS Mg - en Ca-vrije oplossing in 2 mL slangen, tot 2 mg/mL. Bevestig deze concentratie door UV-absorptie in drievoud, met behulp van DPBS Mg - en Ca-vrije oplossing als de blanco.</li>
		<li>Vermeng de voorraad eiwitten oplossingen voor 5 s met behulp van een vortex-mixer.</li>
		<li>Verdund 100 µL van elke 2 mg/mL mAb oplossing met 0,9 mL gestolde voedingsbodem assay.</li>
		<li>Mix voor 5 s door vortex-mixer. 
		Opmerking: Deze oplossingen hebben een concentratie van 200 µg/mL. Verdunningen moeten worden uitgevoerd voor elke drievoud.</li>
		<li>Verdun 10 & #181; L van elke 200 µg/mL mAb oplossing met 0.99 mL gestolde voedingsbodem assay. Mix voor 5 s met behulp van een vortex-mixer. Deze oplossingen hebben een concentratie van 2 µg/mL. Seriële verdunningen voor elk drievoud uitvoeren voordat u ze gebruikt in de neutralisatie assay.</li>
		<li>Maken van anti-TNFα mAb verdunningen in drie onafhankelijke microplates. Maak een kopie van elke onafhankelijke drievoud en afzien hen in één microplate, zoals aangegeven in tabel 1. Verwijst naar stof < tabel fo:keep-together.within-pagina = "1" fo:keep-met-next.within-pagina = "always" fo:text-align = "center" > <tbody><tr><td colspan="2"> plaat 1</td> <td colspan="2"> plaat 2</td>
					<td colspan="2"> plaat 3</td></tr>
				<tr><td>Wells</td> <td>monster</td> <td>Wells</td> <td>monster</td> <td>Wells</td> <td>monster</td></tr>
				<tr><td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> referentiestof</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> controlemonster</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> analysemonster</td></tr>
				<tr><td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td></tr>
				<tr><td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> analysemonster</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> referentiestof</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> controlemonster</td></tr>
				<tr><td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td></tr>
				<tr><td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> controlemonster</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> analysemonster</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> referentiestof</td></tr>
				<tr><td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td></tr></tbody>
		</table> Tabel 1: Microplate monster arrays. Een volledige neutralisatie test moet worden uitgevoerd in drie microplates binnen coördinaten B2 naar G11. Willekeurige verstrekking van referentie, analytische, en controlemonsters toestaan onderzoekers om te controleren of vooringenomenheid in de assay.</li>
		<li>Uitvoeren mAb verdunningen van elke referentie, proef, of controle, zoals weergegeven in tabel 2. 
		Opmerking: De anti-TNFα mAb concentraties in deze tabel worden beschreven zijn niet de eindconcentraties in de bepaling van de neutralisatie.
		<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>Plaat kolom</td> <td>Volume van Assay kweekmedium (μL)</td> <td>Volume van referentiestof, analytische monster of besturingselement Monster (uL)</td> <td>concentratie in de Assay plaat (ng/mL)</td></tr> <tr><td>2</td> <td>0</td> <td>230</td> <td>2000</td></tr> <tr><td>3</td> <td>150</td> <td>150 van lijn 2</td> <td>1000</td></tr>
				<tr><td>4</td> <td>75</td> <td>75 van lijn 3</td> <td>500</td></tr> <tr><td>5</td> <td>100</td> <td>50 van lijn 3</td> <td>333</td></tr> <tr><td>6</td> <td>75</td> <td>75 van lijn 4</td> < td > 250</td></tr> <tr><td>7</td> <td>75</td> <td>75 van lijn 5</td> <td>166</td></tr> <tr><td>8</td> <td>75</td> <td>75 van lijn 6</td> <td>125</td></tr> <tr><td>9</td> <td>75</td> <td>75 fro m line 7</td> <td>83</td></tr> <tr><td>10</td> <td>75</td> <td>75 van lijn 9</td> <td>41</td></tr> <tr><td>11</td> <td>150</td> <td>75 van lijn 10</td> <td>13</td></tr></tbody></table> T kunnen 2: Anti-TNFα mAb verdunningen. Seriële verdunningen van het anti-TNFα mAbs zijn aangetoond in deze tabel. Eindconcentraties beschreven in deze tabel zijn niet de concentraties in de assay, waar anti-TNFα mAbs waren verdund met een factor 3 (mAb verdunning + kweekmedium cellen schorsing). Lijnen vetgedrukt vertegenwoordigen verdunningen uit lijnen 3, 5, 7, 9 en 10; niet-vette lijnen geven de verdunning van de lijnen 3, 4 en 6. Deze seriële verdunningen worden gedaan net voor het uitvoeren van de bepaling van de neutralisatie. Moet worden gezorgd om te mengen door pipetteren op en neer drie keer vóór de verstrekking van de verdunningen.</li>
		<li>Houden van de platen op 25 ± 5 ° C tot gebruik.</li>
	</ol></li></ol> 4. Neutralisatie Assay met WEHI 164 cellen <ol><li>Mix door alle celopmaak schorsingen (0.5 x 10 6 cellen/mL) vóór de verstrekking bij elke stap van dit protocol vortexing. 
	Opmerking: In deze sectie, warm elke oplossing van 37 ° C gedurende 30 minuten vóór gebruik.</li>
	<li>Breng 50 µL van de celsuspensie aan elk van de 60 putten van de microplates, de overgang van kolom 2 tot en met 11 en lijn B naar G.</li>
	<li>Breng 50 µL van mAb verwijzing, monster en controle verdunningen in microplates. Volg het patroon afgebeeld in Figuur 1.</li>
	<li>Toevoegen 50 µL van de apoptose inductie oplossing aan elk putje.</li>
	De cellen van de <li>de cellulaire besturingselementen gebruiken van 50 µL van WEHI 164, afgeleverd in drie putten. Elk putje brengen een eindvolume van 150 µL met assay kweekmedium.</li>
	<li>Gebruiken een besturingselement van de cytotoxiciteit van een mengsel van 50 µL van WEHI 164 cellen plus 50 µL van apoptose inductie oplossing. Elk putje brengen een eindvolume van 150 µL met assay kweekmedium.</li>
	<li>Voor de TNFα controle, gebruik van 50 µL van de apoptose inductie oplossing en breng het naar 150 µL met het kweekmedium assay.</li>
	<li>Gebruikt bij de blancobepaling, 150 µL van het kweekmedium assay alleen.</li>
	<li>Vul de resterende putten met 150 µL cultuurmedium plaat verdamping effecten te vermijden.</li>
	Herhaal stap <li>4.1.1-4.1.9 twee keer in de twee andere microplates. 
	Opmerking: De eindconcentraties van mAb in de microplate zijn: 0.666, 0.333, 0.167 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 en 0,004 µg/mL.</li>
	<li>Laden de monsters in microplates, zoals aangegeven in Figuur 1. 
	<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig1.jpg" /> Figuur 1: vervreemding van monsters in de platen assay. B1 naar G11 zijn goed coördinaten in de microplates en beschrijven van de posities waar de steekproef verdunningen worden geplaatst. Ontbrekende coördinaten zijn putten gevuld met besturingselementen en assay kweekmedium (A1-A12 en H1-H12). Deze willekeurige distributie van monsters (forward en reverse verdunningen in de microplates) helpt bij het elimineren van vertekening in de resultaten als gevolg van de verdamping van medium of andere variabelen. Het is best dat elke microplate wordt gedaan door een analist op een moment. R:, S: referentiemonster, CS: controlemonster, Dil: verdunning. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig1large.jpg" target="_blank"> Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a></li>
	<li>Incubeer de drie platen bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 16 ± 2 h.</li>
	<li>Laat het caspase-3/7 Glo reagens staan op 25 ± 5 ° C gedurende 30 minuten vóór gebruik.</li>
	<li>Voeg 100 µL van dit reagens aan alle putjes, met inbegrip van de monsters en besturingselementen.</li>
	<li>Schudden van de platen met behulp van een microplate vortex-mixer voor 3 min op 25 ± 5 ° C onmiddellijk na de verstrekking in de putjes.</li>
	<li>Incubeer de platen voor 2,5 ± 0.5 h op 25 ± 5 ° C, beschermd tegen licht.</li>
	<li>Invoegen de microplates in de luminometer het volgende gedeelte en vul.</li>
</ol> 5. Analyse van de resultaten <ol><li>met behulp van een software voor de detectie van luminescentie, selecteer de luminescentie modus en eindpunt functie.</li>
	<li>Selecteer een 96-Wells duidelijk-bodem plaat en zijn 80 interne wells, met uitzondering van de kolommen 1 en 12.</li>
	<li>Selecteer een tijd van de integratie van 1.250 ms en 10 s voor het mengen van de microplate vóór lezing.</li>
	<li>Selecteer de putjes waar referentiestof, analytische stof en controlemonster zal worden geplaatst en identificeren met hun bijbehorende concentraties.</li>
	<li>Lees de monsters geplaatst in de microplates met de luminometer.</li>
	<li>Gebruiken een vierde parameter vergelijking voor de analyses van resultaten. Grafiek van een dosis-responscurve, zoals afgebeeld in Figuur 2. 
	<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig2.jpg" /> Figuur 2: dosis-responscurve. Anti-TNFα mAb concentratie versus luminescentie (de levensvatbaarheid van de cellen) is afgebeeld. Een vierde parameter vergelijking met een beschrijving van de anti-TNFα-bescherming van mAbs werd gebruikt als een model. EC50 is de concentratie van mAb die de hoeveelheid TNFα waardoor de dood van de cel van de 50% in elke assay neutraliseren kunt, wordt geïllustreerd in de grafiek als de verandering in de helling. Bars beschrijven de standaarddeviatie van luminescentie voor elke concentratie mAb. x staat voor anti-TNFα Ab concentratie en wordt afgebeeld als een logaritmische functie in ng/mL, terwijl y vertegenwoordigt de luminescentie reactie in willekeurige luminescentie eenheden. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig2large.jpg" target="_blank"> Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
	Opmerking: In de vierde parameter vergelijking, C is de effectieve concentratie (EC50) 50. Deze waarde wordt gebruikt voor het vergelijken van de referentiestof, analytische monster en controlemonster met behulp van de functie effector.</li>
	<li>Voor de berekening van de relatieve potencies, repareren van de ijkstof tot 100% en berekenen van de potencies van het monster en dienovereenkomstig controleren. 
	Opmerking: Deze waarden zijn afgebeeld in Figuur 3. 
	<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig3.jpg" /> Figuur 3: wiskundige vergelijking gebruikt voor de berekening van de EC50s en de bijbehorende waarden. EC50-waarden, of C de parameters, hebben hun onzekerheid afgebeeld als de standaardfout. Een vergelijking van EC50s tussen de resultaten van het monster en de referentie van relatieve sterkte wordt ook afgebeeld. Het betrouwbaarheidsinterval wordt berekend met een α = 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig3large.jpg" target="_blank"> Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a></li>
</ol>

<ol><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+A+Review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Patho%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: A Review of programmed cell death.</a> Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Darwish, R. S. <a target="_blank" href="https://www.dovepress.com/regulatory-mechanisms-of-apoptosis-in-regularly-dividing-cells-peer-reviewed-article-CHC">Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells.</a> Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).</li>
<li>Tracey, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18155297">Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review.</a> Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).</li>
<li>Körner, H., Sedgwick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+necrosis+factor+and+lymphotoxin%3A+Molecular+aspects+and+role+in+tissue-specific+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity.</a> Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).</li>
<li>Wong, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17916444">TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions.</a> Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).</li>
<li>Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+antagonists%3A+different+kinetics+and%2For+mechanisms+of+action+may+explain+differences+in+the+risk+for+developing+granulomatous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection.</a> Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).</li>
<li>Karvinen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+time-resolved+fluorescence+quenching+assay+%28LANCE%29+for+caspase-3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3.</a> J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).</li>
<li>Ren, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+TRAIL+death+receptors+DR4+and+DR5+by+the+signal+recognition+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle.</a> Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).</li>
<li>Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+CD8%2B+T+cells+to+control+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3(2001).</li>
<li>Ramasubramanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamasubramanyan%2C+N+%22Low+acidic+species+compositions+and+methods+for+producing+and+using+the+same%22">Low acidic species compositions and methods for producing and using the same</a>. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).</li>
<li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+medium+and+passaging+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li>
<li>Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WEHI+164+subclone+13+assay+for+TNF%3A+sensitivity%2C+specificity%2C+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability.</a> Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).</li>
<li>Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+formulations+of+recombinant+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor.</a> Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).</li>
<li>Ponnappan, S., Ponnappan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+immune+function%3A+molecular+mechanisms+to+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Antiox+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions.</a> Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).</li>
<li>Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+sensitization+to+TNF-induced+apoptosis+by+acute+glutathione+depletion+in+murine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes.</a> Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).</li>
<li>Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+TNF+cytokine+neutralization+with+a+vNAR+from+Heterodontus+francisci+shark%3A+a+potential+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use.</a> mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).</li>
<li>Männel, D. N., Falk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+induction+of+tumor+necrosis+factor+production+in+human+monocytes+requires+complete+S-form+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide.</a> Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).</li>
<li>Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+inhibitors-state+of+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge.</a> Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Deze karakterisering helpt te bepalen een priori het biologisch gedrag van een molecuul onder ontwikkeling voordat dure en tijdrovende klinische proeven zijn uitgevoerd. Het is ook nuttig voor de-charges-release van het product van een goedgekeurde drug. Het is vermeldenswaard dat deze testen nuttig zijn om te bepalen of een molecule een voldoende biologisch effect met betrekking tot het werkingsmechanisme heeft. De bio-analytische methode gepresenteerd in deze tutorial is uitermate belangrijk om de vergelijking...

Biologische potentie is de kwantitatieve meting van biologische activiteit, gebaseerd op de getest productkenmerken die zijn gekoppeld aan de relevante biologische eigenschappen, terwijl de hoeveelheid (uitgedrukt in de massa) is een fysisch-chemische maatregel van het eiwitgehalte. Potentie vermoeidheidstests zorgen samen met andere analytische methodologieën, worden uitgevoerd als onderdeel van de conformiteit van het product, stabiliteit en vergelijkbaarheid studies. In deze zin, worden potentie metingen gebruikt om aan te tonen dat product partijen voldoen aan de kritische kwaliteitsattributen (CQAs) of aanvaardingscriteria tijdens alle fasen van de klinische proeven en na goedkeuring van de markt.
Apoptosis is geprogrammeerde celdood, natuurlijk voorkomende wanneer cellen zijn besmet met een virus, of wanneer de cellen worden benadrukt door een milieu factor dat compromissen cellulaire levensvatbaarheid en functie1,2. O.a. behoort apoptosis remming, of biologische neutralisatie, tot de hoofdzakelijk bekende therapeutische mechanismen van mAbs, met name bij de behandeling van chronische ziekten, zoals immuun-gemedieerde inflammatoire aandoeningen. Anti-TNFα moleculen oefenen hun therapeutische eigenschappen door het blokkeren van de interactie van Tumornecrosefactor alfa (TNFα) met de p55 en p75 cel oppervlakte receptoren3, waardoor signaal trajecten die uiteindelijk zal tot cellulaire apoptosis leiden.
TNFα kunnen produceren ontsteking in sommige chronische ziekten4. TNFα is het onecht uitgescheiden in de extracellulaire milieu door macrofagen, die schildwachten van het aangeboren immuunsysteem en de voornaamste actoren in dit soort ziekte5. Als een gemeenschappelijke weg wordt TNFα deregulering geassocieerd met de pathogenese van deze ziekten. Zonder controle en onder constante inductie en cel stress induceert TNFα cel dood en weefsel degeneratie, uiteindelijk leidde tot reumatoïde artritis, ziekte van Crohn en andere pathologische profielen6.
TNF-antagonisten die blokkeren van de interactie tussen TNF en haar receptoren zijn steeds gebruikt als een effectieve therapie te verminderen symptomatology en belemmeren de voortgang van deze ziekten. Tegenwoordig, worden anti-TNFα geneesmiddelen veel gebruikt om te controleren de systemische concentratie van deze cytokine, waardoor verdere ontaarding van betrokken weefsels. In dit opzicht is het noodzakelijk die bieden een reproduceerbaar en robuuste bioassay om te beschrijven het specifiek vermogen van een drug om haar biologische effect te bereiken.
In dit protocol, kritische stappen-vastgesteld tijdens de ontwikkeling van een neutralisatie assay-voor het succesvol meten van de biologische werkzaamheid worden gemarkeerd, met een bijzondere nadruk op de vaardigheden die nodig zijn voor het uitvoeren van de bio-analysemethode. Deze bio-analytische methode informatie nuttig vergelijkbaarheid tussen de verschillende batches instellen of anti-TNFα geneesmiddelen in vergelijking met een klinisch geteste referentiestof.

<table><tbody><tr><td>WEHI 164</td><td>ATCC</td><td>CRL-1751</td><td>Fibrosarcoma cellen van Mus musculus</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td>Bewaar medium bij 2 &deg;C tot 8 &deg;C</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, geen fenol rood</td><td>GIBCO</td><td>11835-030</td><td>Bewaar medium bij 2 &deg;C tot 8 &deg;C</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA(0,25%), fenol rood</td><td>GIBCO</td><td>25200-056</td><td>Bewaar medium bij -10 &deg;C tot -20 &deg;C</td></tr><tr><td>DPBS, geen calcium, geen magnesium</td><td>GIBCO</td><td>14190-136</td><td>Bewaar medium bij 2 &deg;C tot 8 &deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human TNF-alpha Proteïne</td><td>R&amp;D Systems</td><td>210-TA-020</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C tot -70 &deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG</td><td>HyClone</td><td>SH3089803</td><td>Bewaar bij -10 &deg;C tot -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (U.S.), Gekarakteriseerd</td><td>HyClone</td><td>SH3007103</td><td>Bewaar bij -10 &deg;C tot -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay kit</td><td>Promega</td><td>G8093</td><td>Bewaar de Caspase-Glo. 3/7 Substraat en Caspase-Glo. 3/7 Buffer bij &ndash;20 &ordm;C beschermd tegen licht</td></tr><tr><td>EDTA, Ddinatriumzout, Dihydraat, Kristal, A.C.S. Reagens</td><td>J.T.Baker</td><td>8993-01</td><td>--</td></tr><tr><td>Sample mAb Adalimumab</td><td>Probiomed</td><td>NA</td><td>Eindconcentraties in de microplaat zijn:&nbsp; 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 en 0,004 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Reference en Control mAb Adalimumab</td><td>Abbvie</td><td>NA</td><td>Eindconcentraties in de microplaat zijn:&nbsp; 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 en 0,004 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>89429-536</td><td>SpectraMax M3 Multi-Mode</td></tr><tr><td>Microplate reader Software&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>--</td><td>SoftMax Pro 6.3 GxP</td></tr><tr><td>Incubator&nbsp;</td><td>Revco&nbsp;</td><td>30482</td><td>Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2</td></tr><tr><td>Laminair Flow Hood&nbsp;</td><td>The Baker Company&nbsp;&nbsp;</td><td>200256</td><td>Baker SG603A-HE | Hoge Efficiëntie, Klasse II Type A2&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr></tbody></table>

bepaling van de relatieve sterkte van een anti-tnf monoklonaal antilichaam (mab) door neutralizing tnf met behulp van een in vitro bioanalytical methode

Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

Dit protocol geeft de meting van de apoptotic activiteit neutralisatie van TNFα in een fibroblast mobiele muismodel (WEHI 164) met behulp van een anti-TNFα mAb. Bovendien, kan dit protocol worden gebruikt om te evalueren van de andere anti-TNFα-moleculen, zoals fusie-eiwitten. De cellulaire model hier werkzaam is gevoelig voor TNFα-gemedieerde apoptosis wanneer een extra stress-factor wordt geïnduceerd in cel kweekomstandigheden (bijvoorbeeld serum ontbering). Deze procedure is een voorbeeld van hoe uit te voeren van deze analytische assay, markeren de belangrijkste verrichtingen in verband met de bereiding van de monsters, cel verdunning apoptose inductie en spectrofotometrische metingen die essentieel zijn voor het waarborgen van de succesvolle resultaten. Dit protocol blijkt de best presterende voorwaarden met betrekking tot apoptose inductie en efficiënte signaal opnemen, leidt tot lage onzekerheid waarden.

Grafiek van de dosis-respons (met besturingselementen) 
Figuur 1 vertegenwoordigt het antwoord van de luminescentie versus mAb concentratie. Deze sigmoïdale functie illustreert caspase-3 en 7 release in het kweekmedium assay als gevolg van lysis van de cel. Celdood wordt versterkt door serum honger plus TNFα signalering van inductie. Daarom is het anti-TNFα molecuul (mAb) communiceert met de cytokine, remmen (door sterische hinder) de inte...

Een protocol voor de bepaling van de relatieve anti-apoptotic activiteit van een anti-TNFα mAb een neutralisatie-mechanisme met WEHI 164 cellen wordt hier gepresenteerd. Dit protocol is handig voor het vergelijken van de sterkte van de neutralisatie van verschillende moleculen met dezelfde biologische functionaliteit.

Bepaling van de relatieve sterkte van een Anti-TNF monoklonaal antilichaam (mAb) door Neutralizing TNF met behulp van een In Vitro Bioanalytical methode

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de relatieve potentie van anti-TNF-alpha-moleculen. In dit voorbeeld vergelijken we twee anti-TNF-alpha monoklonale antilichamen om de neutralisatie-efficiëntie van één referentie-mAb te bepalen ten opzichte van een onderzochte monster-mAb. Deze handleiding bevat gedetailleerde stappen voor de bepaling van de TNF-alpha neutralisatiepotentie, die niet in de literatuur zijn opgenomen.Cellen kunnen worden blootgesteld aan stress door verschillende omgevingsfactoren, zoals uithongering. Elke cel heeft verschillende eiwitten op het oppervlak, genaamd receptoren. Sommige hiervan zijn specifiek voor het cytokine TNF-alpha.Wanneer dit molecuul interacteert met zijn receptor en er een specifiek signaal wordt gegenereerd, leidt deze signalering in combinatie met een omgevingsstressfactor tot een geprogrammeerde celdood die apoptose wordt genoemd. Echter, in de aanwezigheid van een anti-TNF-alpha molecuul, wat een monoklonaal antilichaam kan zijn, kan het cytokine worden getitreerd door het mAb, waarbij een neutralisatieproces plaatsvindt dat de cellen helpt te overleven. Bij toepassing van een gestandaardiseerde methodiek kan zo de neutra

determination-relative-potency-an-anti-tnf-monoclonal-antibody-mab

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een ELISA kan gemakkelijk worden omgezet Luminex xMAP assay en door de voordelen van multiplexing verschillende antilichamen tegelijkertijd worden gescreend voor een optimale antilichaam paar identificeren resulteert in een verhoogde gevoeligheid en dynamisch bereik, met minder kosten assay.

Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode

This video demonstrates Microneutralization assays to measure neutralizing antibodies using Madin-Darby Canine Kidney cells overexpressing α2,6-linked sialic acid in human sera. This assay is often used for influenza human...

A Microneutralization Assay to Measure Neutralizing Antibody Titers in Human Serum

This video demonstrates a technique for assessing the efficacy of antibodies against tumor necrosis factor-alpha (TNFα), an inflammatory cytokine, through an in vitro bioanalytical approach. TNFα, when introduced to stressed cells, triggers apoptosis. However, binding to the antibodies confines TNFα, averting apoptosis. The degree of apoptosis is quantified using a bioluminescence assay.

An In Vitro Method to Determine the Anti-Apoptotic Activity of Antibodies against TNF&alpha;

Neutrofielaanhechting aan de geactiveerde endotheel op plaatsen van infectie is een integraal onderdeel van de gastheer ontstekingsreactie. Beschreven in dit rapport is een neutrofiel binding assay die het mogelijk maakt voor...

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

Hier presenteren we een uitgebreid capillaire zone-elektroforeseprotocol voor de beoordeling van intrinsieke fysisch-chemische heterogeniteit van monoklonale antilichamen als een kwaliteitskenmerk.

Capillaire Elektroforese Scheiding van monoklonaal antilichaam isovormen gebruiken een neutrale capillair

Dit protocol beschrijft de in vitro vergelijking van twee belangrijke functionele kenmerken van rituximab: target binding en complement-dependent cytotoxicity (CDC) inductie. De methoden werden gebruikt voor een vergelijking tussen referentie rituximab en een rituximab biosimilar. Deze analyses kunnen worden gebruikt bij biosimilar ontwikkeling of als kwaliteitscontrole in hun productie.

In Vitro Methoden voor het vergelijken van Target Binding en CDC Inductie Tussen Therapeutische Antilichamen: Toepassingen in Biosimilarity Analysis

Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van Fc-gemedieerde effector functies door antilichamen die gericht het influenza virus hemagglutinine. Deze test kan ook worden aangepast voor de beoordeling van het vermogen van monoclonal antilichamen of polyclonal sera gericht op andere virale oppervlakte glycoproteïnen ertoe Fc-gemedieerde immuniteit.

Een methode om te beoordelen van Fc-gemedieerde Effector functies geïnduceerd door Influenza hemagglutinine specifieke antilichamen

Hier presenteren we een cel-gebaseerde stroom cytometry methode voor het detecteren van neutraliserende antilichamen of andere factoren die met de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën in een menselijke matrix, zoals cerebrale spinal fluid (CSF) of menselijk serum interfereren.

Opsporing van antilichamen die de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën met een test van cel-gebaseerde neutraliseren

In deze paper beschrijven we een protocol karakteriseren T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobulin (Ig) isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Deze methode gebruikt alleen of in combinatie met stroom cytometry onderzoekers te identificeren van verschillen in de B-cel-gemedieerde Ig isotype reacties in muizen na T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigeen immunisatie zal toestaan.

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

MALT1 regelt aangeboren immuniteit, maar hoe dit gebeurt blijft vaag. We gebruikten de selectieve MALT1 paracaspase remmer MLT-827 te ontrafelen van de bijdrage van MALT1 aan het aangeboren signalering stroomafwaarts van Toll-like of C-type lectine-achtige receptoren, aan te tonen dat MALT1 de productie van myeloïde cytokines regelt, en "downstream" C-type lectine-achtige receptoren, selectief.

Myeloïde aangeboren signalering Pathway regelgeving door MALT1 Paracaspase activiteit

Leer hoe u de relatieve sterkte van anti-TNF monoklonale antilichamen bepaalt met WEHI 164-cellen. Deze bioanalytische methode vergelijkt neutralisatie-efficiëntie voor therapeutische ontwikkeling.

Bepaling van de relatieve sterkte van een Anti-TNF monoklonaal antilichaam (mAb) door Neutralizing TNF met behulp van een In Vitro Bioanalytical methode (Video) | JoVE Journal

Bepaling van de relatieve sterkte van een Anti-TNF monoklonaal antilichaam (mAb) door Neutralizing TNF met behulp van een In Vitro Bioanalytical methode

Meer video's verkennen