Gestroomlijnd eencellige TCR isolatie en generatie van retrovirale vectoren voor In Vitro en In Vivo expressie van menselijke TCRs
10 september 2017
De huidige protocol combineert eencellige gekoppeld menselijke TCR alpha en beta keten sequencing met gestroomlijnd generatie van retrovirale vectoren compatibel met in vitro en in vivo TCR expressie.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van immunologie, zoals het TCR-alfa en bèta-repertoire van een specifieke populatie van een antigeen, evenals de in vivo functionaliteit van humane TCR's. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de relatief hoge efficiëntie van de PCR-reactie en de compatibiliteit met daaropvolgende TCR-klonen. Dit protocol gebruikt een twee-staps PCR om de TCR-alfa- en bèta-ketens uit een enkele cel te versterken zonder voorafgaande kennis van de TCR-sequentie.
De eerste PCR is een multiplex-reactie met behulp van een pool van alfa- of bèta-variabele-regio-specifieke primers in combinatie met een primer specifiek voor de constante regio. De tweede PCR is een nested-reactie die primeert vanaf de adaptersequentie die in de vijf prime-einden van het PCR-product is opgenomen, evenals een interne constante regio-sequentie. Deze primers bevatten ook unieke restrictieplaatsen in de vijf prime- en drie prime-einden van het PCR-product om de daaropvolgende klonen te vergemakkelijken.
Eenmaal gekloond in de sjabloonvector, is de gecodeerde TCR-sequentie chimerisch, bestaande uit humane variabele regio's met spiegelende constante regio's. De chimerische TCR-constructie zorgt voor interactie tussen de TCR en het spiegelende CD3-signaleringscomplex, waardoor dit TCR-kloonprotocol compatibel is met daaropvolgende functionele studies in spiegelende cellijnen en in gehumaniseerde muismodellen. Zorg voor de eencellige sorteer door de omgekeerde transcriptiereagentia voor te bereiden in een schone, sjabloonvrije ruimte.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in de eencellige PCR-methode worstelen vanwege de lage niveaus van sjabloon. Aan de andere kant is de gevoeligheid van de multiplex nested PCR gevoelig voor lage niveaus van sjabloonbesmetting. Daarom is het noodzakelijk om de gebieden grondig schoon te maken waarin u de PCR-reacties gaat instellen.
Een mengsel van drie omgekeerde primers specifiek voor de constante regio van de alfa- en bètaketens worden gebruikt in deze reactie. Bereid het omgekeerde transcriptie mastermix voor door reagentia in een pipetteerreservoir te combineren. Om rekening te houden met pipetteerfout, maak genoeg reactiemengsel voor tien extra putjes.
Gebruik een multikanaalspipet om zes microliter per putje in een 96-wells PCR-plaat te pipetteren. Bedek de plaat losjes met een afdichting en houd de plaat op ijs. Bereid T-cellen voor eencellige sorteer door de cellen te kleuren met antilichamen tegen celoppervlaktemarkers.
Sorteer T-cellen een keer per putje terwijl u de twaalf rijen leeg laat, wat als negatieve controle zal dienen. Verzegeld de plaat met kleeffolie en draai gedurende vijf minuten bij 1000g bij vier graden Celsius. Voer onmiddellijk de omgekeerde transcriptiereactie uit.
Als het mogelijk is, voer de eerste PCR-reactie dezelfde dag uit. Om de multiplex-reactie uit te voeren, meng apart de V-alfa en V-bèta PCR mastermixes in pipetteerreservoirs. Houd de plaat met cDNA op ijs of op een koude blok.
Breng 22,5 microliter van de TCR-bèta-reactie over in een nieuwe 96-wells PCR-plaat. Gebruik vervolgens een multikanaalspipet om 2,5 microliter cDNA over te brengen naar de PCR-plaat. Gebruik een multikanaalspipet om 22,5 microliter van de TCR-alfa-reactie direct in de plaat met de rest van het cDNA te pipetteren.
Verzegeld de platen met kleefstof, voorzichtig gevortext en kort gecentrifugeerd. Voer de eerste PCR-reactie uit. Platen kunnen worden bewaard bij 20 graden Celsius.
De volgende dag bereidt u de tweede nested PCR-reacties voor. Gebruik een multikanaalspipet om de mastermixes voor de TCR-alfa en TCR-bèta-reacties bij 22,5 microliter per putje in twee nieuwe 96-wells PCR-platen te pipetteren. Voeg het multiplex PCR-reactie-sjabloon toe bij 2,5 microliter per putje.
Verzegeld de platen, voorzichtig gevortext en kort gecentrifugeerd. De resterende eerste PCR-reactie moet worden verzegeld en bewaard bij 20 graden Celsius om als bron van back-upsjabloon te dienen. Voer de tweede PCR-reactie uit.
Nadat de tweede nested PCR-reactie voltooid is, draai vijf microliter van de reactie uit op een 1% agarosegel. Voeg de positieve en negatieve controleputjes toe. De verwachte band zou rond de 500 basenparen groot moeten zijn.
Zuiver de rest van de tweede reactie, twintig microliter, met behulp van een 96-wells formaat PCR-zuiveringskit en voer Sanger-sequencing uit. De verkregen TCR-sequenties kunnen worden geanalyseerd met behulp van online beschikbare immunogenetische software. De sequentie-informatie kan worden gebruikt om het repertoire en de klonalititeit van de T-celpopulatie te beoordelen.
Gepaarde TCR-alfa- en bèta-sequenties kunnen worden gebruikt in verdere functionele analyse. Voer opeenvolgende ligaties uit van TCR-bèta en TCR-alfa in de sjabloonvector. De sjabloon TCR-bèta en TCR-alfa worden vervangen door de PCR-versterkte ketens.
Bij de eerste ligatie wordt de sjabloon TCR-bèta vervangen door de PCR-versterkte bètaketen. Nadat de succesvolle insertie van TCR-bèta is geverifieerd door test-digest insequencing, vervangt u de sjabloon TCR-alfa met de PCR-versterkte alfaketen. HEK293T-cellen worden gebruikt om succesvolle TCR-ketenparing en celoppervlakte-expressie te testen.
HEK293T-cellen worden geco-getransfecteerd met de TCR-vector gemarkeerd door de ametrine fluorescente reporter en een vector die het CD3-complex codeert, gemarkeerd door GFP. De celoppervlakte-expressie van de chimerische TCR wordt geverifieerd door flowcytometrie door de cellen te kleuren met anti-muis CD3-antilichaam. Het niveau van celoppervlakte CD3-expressie in cellen getransfecteerd met de chimerische TCR-constructie zou vergelijkbaar moeten zijn met die getransfecteerd met de volledig spiegelende controle-sjabloonvector.
Kortom, we hebben een efficiënt PCR-gebaseerd protocol beschreven voor de identificatie en kloon van gepaarde TCR-ketens uit enkele cellen. We verwachten dat dit een waardevol hulpmiddel zal zijn om humane T-celreacties te bestuderen bij auto-immunite
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol combineert single-cell paired sequencing van menselijke TCR-alfa- en bètaketens met de gestroomlijnde generatie van retrovirale vectoren voor TCR-expressie. Het beantwoordt cruciale vragen in de immunologie met betrekking tot het TCR-repertoire en de functionaliteit.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Het begrijpen van TCR-alfa- en betaketens is cruciaal voor immunologisch onderzoek.
- Single-cell sequencing maakt gedetailleerde analyse van TCR-repertoires mogelijk.
- Retrovirale vectoren zijn essentieel voor TCR-expressiestudies.
- Deze methode verhoogt de efficiëntie van PCR-reacties.
Doel van de studie
- Om het TCR-repertoire van specifieke antigeenpopulaties te analyseren.
- Om de in vivo functionaliteit van menselijke TCR's te beoordelen.
- Om het proces van TCR-klonering te stroomlijnen.
Gebruikte methoden
- Tweestaps PCR-amplificatie van TCR alfa- en bètaketens.
- Multiplexreactie met gebruik van primers specifiek voor de variabele regio.
- Nested PCR voor verbeterde specificiteit en efficiëntie.
- Inbouw van unieke restrictieplaatsen voor klonering.
Belangrijkste resultaten
- Hoge efficiëntie bij het amplificeren van TCR-ketens uit individuele cellen.
- Compatibiliteit met daaropvolgende TCR-kloningsprocessen.
- Vermogen om TCR-repertoires te analyseren zonder voorafgaande kennis van de sequentie.
- Succesvolle in vivo expressie van humane TCR's.
Conclusies
- Deze methode biedt een robuuste aanpak voor het bestuderen van TCR's.
- Het vergemakkelijkt het begrip van immuunresponsen.
- Het protocol is aanpasbaar voor diverse immunologische toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol stelt biofarmaceutische R&D in staat om gepaarde menselijke TCR-sequenties uit individuele cellen te isoleren en snel functionele retrovirale vectoren te genereren voor in vitro en in vivo studies. Het overbrugt de kloof tussen TCR-repertoireanalyse en functionele validatie, wat bijdraagt aan het verminderen van risico's bij de selectie van targets in de ontwikkeling van immunotherapie. De gestroomlijnde workflow verkort de tijdlijnen voor de evaluatie van TCR-gebaseerde kandidaten, waardoor de besluitvorming over de portfolio in de vroege ontdekkingsfase wordt verbeterd.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door TCR-klonaliteit te koppelen aan antigeenspecifieke T-celpopulaties.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode voor de identificatie van gepaarde TCR-alpha/beta-ketens zonder voorafgaande kennis van de sequentie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door directe beoordeling van de TCR-functionaliteit in chimere constructen.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert TCR-sequenties die compatibel zijn met subklonering in retrovirale vectoren voor gestandaardiseerde expressiesystemen.
- Operationele waarde: Produceert PCR-producten met geïncorporeerde restrictiesites, wat gestroomlijnde klonering mogelijk maakt en technische variabiliteit vermindert.
- Klaar voor assay: Levert gevalideerde TCR-constructen die geschikt zijn voor screening van oppervlakte-expressie via flowcytometrie in HEK293T-cellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Produceert chimerische TCR's met muis-intracellulaire domeinen die functioneel zijn in muiscellen en in vivo-modellen.
- Preklinische modellering: Ondersteunt de evaluatie van de werkzaamheid en veiligheid van TCR's in gehumaniseerde muissystemen voorafgaand aan IND-ondersteunende studies.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van de compatibiliteit van TCR-signalering met CD3-complexen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van de identificatie van TCR's op enkelcelniveau tot de identificatie van lead-kandidaten via functionele TCR-expressie, ter ondersteuning van iteratieve cycli van targetvalidatie en preklinisch testen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesting door TCR-repertoires in antigeenspecifieke populaties te onthullen zonder dat voorafgaande sequentie-informatie vereist is.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk door de generatie van TCR-coderende retrovirale vectoren die compatibel zijn met functionele read-outs in spiegelende cellijnen.
- Analytics: Levert kwantitatieve TCR-sequentiedata die geschikt zijn voor immunogenetische softwareanalyse voor de beoordeling van clonaliteit en het repertoire.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt ontdekking met preklinische validatie via chimerische TCR-constructen die interageren met murine CD3-signaleringscomplexen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor TCR-klonering dat toepasbaar is binnen programma's voor auto-immuunziekten, oncologie en infectieziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door functionele testen van menselijke TCR's in relevante modelsystemen mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Standardiseert TCR-klonering via de incorporatie van restrictieplaatsen, waardoor de variabiliteit tussen batches wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de tijdlijn van single-cell sorting naar TCR-expressie te verkorten tot ongeveer twee weken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering van TCR-kandidaten op basis van aangetoonde in vitro en in vivo functionaliteit.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in single-cell sorting, multiplex nested PCR en retrovirale vectorcloning.
- Vraagt om contaminatiegecontroleerde omgevingen vanwege de gevoeligheid voor lage template-niveaus en risico's op PCR-contaminatie.
- Afhankelijk van toegang tot 96-well PCR-platforms, zuiveringskits en Sanger-sequencing voor validatie van de TCR-sequentie.
- Vereist aanpassing van kleuringspanels voor de isolatie van T-cel-subsets op basis van de doelziekte-indicaties.
- Praktische beperking: De efficiëntie is afhankelijk van de RNA-kwaliteit en het aantal startcellen, wat optimalisatie voor zeldzame T-celpopulaties noodzakelijk maakt.
