Name: Gestroomlijnd eencellige TCR isolatie en generatie van retrovirale vectoren voor In Vitro en In Vivo expressie van menselijke TCRs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Leer een gestroomlijnde methode voor TCR-isolatie uit enkele cellen en retrovirale vectorgeneratie voor immunologisch onderzoek. Deze techniek analyseert TCR-repertoire en functionele expressie in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gefinancierd door JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ, en de Robert en Janice McNair Foundation.
Wij danken Sandra Pena en Andrene McDonald patiënt aanwerving, Samuel Blum voor technische bijstand, Dr. George Makedonas voor de gave van antilichamen en controle DNA gebruikt voor PCR Optimalisering.

1. identificeren van de T-celpopulatie belangenverstrengeling.
 Opmerking: antigeen specifieke proliferatie in combinatie met celdeling kleurstof (zoals Carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE) kan worden gebruikt voor het isoleren van T-cellen op basis van hun verspreiding in reactie op antigene stimulatie. Als vanaf PBMCs, een 7-daagse in vitro uitbreiding moet voldoende zijn om te identificeren van een antigeen specifieke CFSE dunbevolkte 12.
<ol><li>Mix PBMCs 1:1 met MHC-matched feeder cellen, en label met 5 µM CFSE celdeling kleurstof.</li>
	<li>Plaat 2-2.5 x 10 5 cellen per putje in een 96-Wells ronde-bodem plaat in 200 µL 10% FCS volledige RPMI media cultuur. 
	Opmerking: Complete RPMI bevat 2 mM l-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 100 µM MEM niet-essentiële aminozuren, 5 mM HEPES, 5.5 × 10 &#8722; 5 eenheden van 2-mercaptoethanol, 100 U mL &#8722; 1 penicilline en 100 µg mL &#8722; 1 streptomycine.</li>
	<li>Cellen met 25 µM peptide-antigeen stimuleren.</li>
	<li>Op de vierde dag van cultuur, zorgvuldig verwijderen en vervangen van 100 µL van media. 
	Opmerking: Een meer optimale aanpak voor antigeen-specifieke T cel identificatie is het gebruik van peptide-HLA tetramers 13. Tetrameer kleuring zorgt voor de gelijktijdige evaluatie van antigeen specificiteit, evenals HLA-beperking.</li>
</ol> 2. De soort eencellige.
<ol><li>Voer alle procedures in een kap of een daarvoor aangewezen gedeelte gratis van versterkte sjabloon. Aliquot de reagentia te voorkomen, schoon alle oppervlakken van het werk en, indien mogelijk, apparatuur met 10% bleekwater voorafgaand aan PCR setup. Gebruik filter tips, RNAse en DNAse gratis reagentia en kunststoffen in alle PCR en vector stappen klonen. Belangrijkste reagentia kunnen worden gevonden in de Tabel of Materials. 
	Opmerking: De multiplex PCR reactie is hoogst-gevoelig, en lage niveaus van besmetting kunnen leiden tot versterkte product.</li>
	<li>Genereren de master mix van omgekeerde transcriptie door het combineren van 10 x RT reactie buffer, 25 X DNTPs, 9 U RT enzym, 0,01% Triton-X, 0.7 U RNAse remmer, en 383 nM voor elke primer van de RT-TCR (vermeld in tabel 1) in een steriele pipetting reservoir. Voor elke 96-wells-plaat, make-up genoeg master mix voor 10 extra Reacties (totaal 106), om verlies te compenseren van vloeistof tijdens pipetteren. Zie tabel 2 voor reactie componenten en bedragen per putje.</li>
	<li>Voorbereiden een 96-Wells PCR collectie plaat voor cel Sorteren op pipetting 6 µL van de omgekeerde transcriptie master mix per putje met een meerkanaalspipet. Houd de plaat op het ijs of in een koud blok.</li>
	<li>Label cellen met antilichamen tegen cel oppervlakte gegevensmarkeringen (bijvoorbeeld in CD4 en CD3, of CD8 en CD3, elk op 2 µg/mL, in combinatie met celdeling kleurstof of tetrameer kleuring).</li>
	<li>Sorteren T cellen in één cel per putje, de twaalfde rij, die als een negatieve besturingselement dienen zal skipping. 
	Opmerking: De efficiëntie van de soort zal afhangen van nauwkeurige collectie uitlijning van de plaat in de houder plaat, evenals het behoud van de cellen en de platen bij een lage temperatuur voorafgaand aan cDNA reactie. Collectie platen moeten worden gehouden op het ijs te allen tijde, behalve bij het sorteren, wanneer ze worden opgelost binnen de koeling plaat. Niet alle sorteerders zijn uitgerust met een temperatuur gereglementeerde plaat houder; echter is het gebruik van een sterk aanbevolen. Aangezien de soort in het algemeen ongeveer 10-15 min per plaat duurt, is er een toegenomen potentieel voor aantasting van het RNA als de plaat niet wordt gehandhaafd op een lage temperatuur.</li>
	<li>Als positieve controle, een groter aantal cellen (100 cellen) handmatig met een pipet op een van de putten in dit stadium toevoegt. U kunt ook eerder geïsoleerde RNA van gegroepeerde cellen kan worden gebruikt als positieve controle op 10 ng per putje. 
	Opmerking: Pipetteer gezuiverde controle RNA met precisie en zorg om kruisbesmetting van andere wells en vals-positieve resultaten voorkomen.</li>
	<li>Zegel van de plaat met kleeffilm, en spin down bij 1000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Onmiddellijk transcriberen RNA aan cDNA door het broeden van de plaat bij 25 ° C gedurende 10 min, 45 min, 37 ° C en 85 ° C gedurende 10 minuten 
	Opmerking: Om ervoor te zorgen efficiënte PCR reactie, is het aanbevolen dat de eerste PCR reactie dezelfde dag worden uitgevoerd. U kunt ook de getranscribeerde platen kunnen worden bewaard in-80 ° C voor maximaal 2 maanden.</li>
</ol> 3. Uitvoeren van multiplex-genest PCR Opmerking: bereiden van alle master mixen in een schone sjabloon-vrije zone om verontreiniging te voorkomen.
<ol><li>Reconstrueren elke variabele regio primer aan 100 µM met DNAse en RNAse gratis H 2 O. Vervolgens combineren 20 µL van elk van de 44 inleidingen voor het genereren van het V-alpha primer zwembad. Voor het genereren van de V-beta primer zwembad combineren 20 µL van elk van de 40 V-beta inleidingen plus 80 µL van DNAse en RNAse gratis H 2 O. Primer sequenties zijn vermeld in tabel 1. Zodra gebundeld, de concentratie van elke primer in de mix is 2.3 µM.</li>
	<li>Reconstrueren de constante regio inleidingen tot 100 µM-stockoplossing met DNAse en RNAse gratis H 2 O. Dilute de constante regio inleidingen te 10 µM werkoplossing aliquot voor gebruik.</li>
	<li>Bereiden twee aparte master mixen voor TCR-Alfa en TCR-beta versterking. Genereren van de master mixen door de combinatie van 5 X buffer, 80 µM dNTPs, 3% DMSO, 2 µM primer zwembad (eindconcentratie van 46 nM voor elke primer), 200 nM TCR-constante regio omgekeerde primer, 1 U DNA-polymerase, en DNAse en RNAse gratis H 2 O (tabel 2 ). Voor elke 96-wells-plaat, make-up genoeg master mix voor 10 extra Reacties (totaal 106), ter compensatie voor het verlies van vloeistof tijdens pipetteren. 
	Opmerking: De berekeningen zijn gebaseerd op het uiteindelijke volume van de PCR van 25 µL per putje, waar 22.5 µL master PCR mix wordt gecombineerd met 2,5 µL cDNA sjabloon.</li>
	<li>Houden de plaat met cDNA op ijs of in een koud blok. Hiermee kunt u dat een multichannel Pipetteer 22.5 µL van TCR-beta reactie in een nieuwe 96-Wells PCR plaat. Gebruik vervolgens een meerkanaals 2.5 µL van cDNA overbrengen naar de plaat PCR.</li>
	<li>Een meerkanaals kunt Pipetteer 22.5 µL van TCR-alpha reactie rechtstreeks in de plaat met de rest van de cDNA.</li>
	<li>Zegel van de platen met lijm, zachtjes vortex, en spin naar beneden bij 1000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>De multiplex PCR reactie worden uitgevoerd met de volgende cycli: 5 min bij 95 ° C gevolgd door 34 cycli van 20 bij 95 ° C, 30 s s op 54 ° C en 1 min bij 72 ° C, gevolgd door 7 minuten op 72 ° C.</li>
	<li>Carry uit de geneste PCR-reactie in een eindvolume van 25 µL, 2.5 µL van het multiplex PCR mengsel als sjabloon gebruiken.
	<ol><li>Reconstrueren van de interne en adapter inleidingen tot 100 µM met DNAse en RNAse gratis H 2 O. maken 10 µM aliquots voor de werkende voorraad.</li>
		<li>Voorbereiden TCR-Alfa en TCR-beta ampl twee aparte master mixenification. Mix 5 X buffer, 25 X DNTP, 3% DMSO, 200 nM voorwaartse adapter primer, 200 nM omgekeerde geneste primer, 1 U DNA-polymerase, en DNA-polymerase en nuclease-vrije H 2 O voor een eindvolume van 22,5 µL (tabel 2). Voor elke 96-wells-plaat, make-up genoeg master mix voor 10 extra Reacties (totaal 106), om verlies te compenseren van vloeistof tijdens pipetteren. 
		Opmerking: In het tweede PCR reactie gebruik de 5 X PCR van de buffer met laden kleurstof om agarose gel laden.</li>
		<li>De meester mixen voor de TCR-Alfa en TCR-beta reacties op 22,5 µL per putje in twee nieuwe 96-Wells-PCR platen met behulp van een meerkanaals, Pipetteer.</li>
		<li>De multiplex PCR reactie sjabloon toevoegen op 2,5 µL per putje. 
		Opmerking: De resterende eerste PCR reactie moet worden verzegeld en opgeslagen bij-20 ° C om te dienen als een bron van extra sjabloon, als het noodzakelijk wordt (Zie stap 4.3 Opmerking).</li>
		<li>Zegel de platen, zachtjes vortex, en spin down bij 1000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
		<li>De geneste PCR reactie worden uitgevoerd met de volgende cycli: 5 min bij 95 ° C gevolgd door 34 cycli van 20 bij 95 ° C, 30 s bij 56 ° C s en 1 min bij 72 ° C, gevolgd door 7 minuten op 72 ° C.</li>
		<li>Run 5 µL van de uiteindelijke reactie uit op een 1% agarose gel met ethidiumbromide (met inbegrip van de negatieve en positieve controles putten). 
		Opmerking: De verwachte band moet worden uitgevoerd op ongeveer 500 bp grootte. Een voorbeeld-reactie is afgebeeld in Figuur 2.</li>
		<li>Zuiveren van de rest van de tweede reactie (20 µL) met behulp van een 96-Wells-indeling PCR zuivering kit Elueer met 15 µL van 70 ° C H 2 O per putje en uitvoeren van Sanger sequencing. Gebruik de juiste TCR-alpha of TCR-beta adapter voorwaartse primer voor sequencing (tabel 1). 
		Opmerking: Sequenties kunnen worden geanalyseerd met software online beschikbaar Immunogenetica.</li>
	</ol></li></ol> 4. Alfa en bèta ketens van PCR sub-kloont.
 Opmerking: de pool van de voorwaartse primers gebruikt in de eerste reactie, en de omgekeerde inleidingen in de tweede PCR reactie worden gebruikt om op te nemen beperkingsplaatsen. Dus, de verkregen Alfa en beta keten PCR producten zijn klaar om te worden opeenvolgend sub gekloonde in de sjabloon retrovirale vector ( Figuur 1).
<ol><li>Digest de gezuiverde PCR producten vanuit naar de beta genest reactie met BstbI en MfeI (tabel 3). 
	Opmerking: Niet meer dan 5 µg invoegen.</li>
	<li>Parallel, verteren de sjabloon vector met BstbI en MfeI (tabel 3). Gebruik de sjabloon vector per TCR µg 1-2. De verteerd vector worden uitgevoerd op een agarose gel en isoleren van de grotere band (~ 7500 bp). Zuiveren van de vector met een gel DNA zuivering kit. 
	Opmerking: Tijdens de restrictie-enzym digest, lymfkliertest TCR-beta variabele gebied van de sjabloon wordt verwijderd, rekening houdend met de toevoeging van de menselijke TCR-beta variabele regio.</li>
	<li>Zuiveren het verteerd PCR producten met behulp van een PCR zuivering kit. 
	Opmerking: Controleer of de capaciteit van de zuivering DNA van de kolommen in de kit; Gebruik meerdere kolommen indien nodig. Het minimumbedrag voor een gezuiverde invoegen die nodig zijn voor een succesvolle afbinding reactie is 50 ng bij een minimumconcentratie van 10 ng/µL. Als het bedrag van de gezuiverde invoegen niet voldoende voor een succesvolle Afbinding is, de tweede PCR reactie kan worden herhaald.</li>
	<li>Behandeling van de sjabloon vector met 10 U CIP enzym gedurende 1 uur bij 37 ° C om te voorkomen dat de zelf-Afbinding, gevolgd door warmte inactivatie voor 10 min op 75 ° C. zuiveren het DNA met PCR zuivering kit (tabel 3).</li>
	<li>Ligate TCR-beta invoegen en vector DNA ligase met een totaal volume van 20 µL op 6 molaire overmaat van het donormateriaal gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. 
	Opmerking: In totaal, de afbinding reactie moet bevatten ongeveer 150 ng van DNA (tabel 3).</li>
	<li>Voor transformaties, meng 8 µL van de afbinding reactie met 80 µL van chemisch bevoegde E.coli DH5α cellen (Tabel van materialen) en incubeer op ijs voor 30 min. warmte schok bij 42 ° C gedurende 45 s. toevoegen 500 µL Super Optimale bouillon met omzettingsproducten onderdrukking (S.O.C.) medium en schud gedurende 1,5 uur op 37 ° C.</li>
	<li>Plaat uit 250 µL van bacteriële cultuur op een ampicilline met lysogenie Bouillon (LB) agarplaat. De plaat 's nachts (~ 16 h) Incubeer bij 37 ° C.</li>
	<li>De volgende dag Kies bacteriële kolonies, en ze opgroeien in 3 mL LB opslagmedium met ampicilline 's nachts. Isoleren van de plasmide-DNA met behulp van DNA plasmide zuivering kit.</li>
	<li>Bevestigen de succesvolle invoeging van de bèta keten door een kleine test-digest met de enzymen van de beperking BstbI en MfeI. Combineren in een 12 µL totale reactie volume, 200-500 µg plasmide DNA, 0,25 µL van elk enzym en 10 X enzym buffer (tabel 3). De reactie die worden uitgevoerd op een 1% agarose gel met ethidiumbromide om te bevestigen de grootte van de band invoegen (~ 500 bp).</li>
	<li>Na de bevestiging van de aanwezigheid van de insert, het volgnummer van de TCR-bèta-sectie van de vector met behulp van de IRES omgekeerde primer (tabel 1).</li>
	<li>Na de bevestiging van de sequentie van de insert TCR-bèta, het uitvoeren van een soortgelijk proces voor het inbrengen van de alpha variabele regio. Verteren de gezuiverde PCR producten van de reactie van de alpha geneste, en de nieuw gegenereerde TCR-beta invoegen met vector, met SnaBI en SacII. 
	Opmerking: Tijdens de restrictie-enzym digest, lymfkliertest TCR-alpha variabele gebied van de sjabloon wordt verwijderd, rekening houdend met de toevoeging van de menselijke TCR-alpha variabele regio.</li>
	<li>Ligate alpha TCR vectoren codering van de bijbehorende bèta variabele regio met behulp van DNA-ligase in een totaal volume van 20 µL op 6 molaire overmaat van het donormateriaal gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur ingevoegd. 
	Opmerking: In totaal, de afbinding reactie moet bevatten ongeveer 150 ng van DNA (tabel 3).</li>
	<li>Voor transformaties, meng 8 µL van de afbinding reactie met 80 µL van chemisch bevoegde E.coli DH5α cellen (Tabel van materialen) en incubeer op ijs voor 30 min. warmte schok bij 42 ° C gedurende 45 s. toevoegen 500 µL S.O.C. middellange en schud gedurende 1,5 uur op 37 ° C.</li>
	<li>Plaat uit 250 µL van bacteriële cultuur op een ampicilline met lysogenie Bouillon (LB) agarplaat. De plaat 's nachts (~ 16 h) Incubeer bij 37 ° C.</li>
	<li>De volgende dag Kies bacteriële kolonies, en ze opgroeien in 3 mL LB opslagmedium met ampicilline 's nachts. Isoleren van de plasmide-DNA met behulp van DNA plasmide zuivering kit.</li>
	<li>Bevestigen de succesvolle invoeging van de alpha keten door een kleine test-digest met de enzymen van de beperking SnaBI en SacII. In een 12 µL totale reactie volume combineren 200-500 µg plasmide DNA, 0,25 µL van elk enzym en 10 x enzym buffer (tabel 3). De reactie die worden uitgevoerd op een 1% agarose gel met ethidiumbromide om te bevestigen de grootte van de band invoegen (~ 500 bp).</li>
	<li>Na de bevestiging van de aanwezigheid van de insert, het volgnummer van de TCR-alpha-sectie van de vector met behulp van de MSCV2-forward primer (tabel 1).</li>
	<li>Nadat de volgorde van Alfa keten is gevalideerd, controleert u of de volledige TCR invoegen door sequentiebepaling van TCR-bèta-reverse en IRES-reverse primer (tabel 1).</li>
</ol> 5. Controleer of TCR cel oppervlakte expressie en specificiteit.
 Opmerking: HEK293T cellen worden gebruikt voor het testen van succesvolle TCR keten paring en cel oppervlakte expressie ( figuur 3A) 8. Peptide-MHC tetrameer kleuring kan ook worden uitgevoerd op de transfected cellen van de HEK293T om te testen voor het bewaren van antigene specificiteit post TCR gene isolatie ( figuur 3B).
<ol><li>Plaat HEK293T cellen in 12-well weefselkweek platen op 1 x 10 5 cellen per putje in 1 mL volledige DMEM media met 5% FCS en cultuur 's nachts op 37 ° C. plaat uit voldoende cellen aan te wijzen voor elke nieuwe TCR aparte putten , besturingselement sjabloon TCR vector, CD3 vector alleen, controle Nou TCR vector alleen, en een niet-transfected. 
	Opmerking: Transfectie met een volledig muis sjabloon TCR vector (mTCR-pMIA) in combinatie met mCD3εγδζ-pMIG vector, mTCR-pMIA vector alleen, en mCD3εγδζ-pMIG vector alleen worden gebruikt als de positieve en negatieve controles. 
	Opmerking: Complete DMEM bevat 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 100 µM niet-essentiële aminozuren, 5 mM HEPES-buffer, 5.5 x 10 -5 eenheden van 2-mercaptoethanol, 100 U/ml penicilline/streptomycine.</li>
	<li>De volgende dag, de cellen met 1 µg chimeer h/mTCR-pMIA vector, 1 µg muis GFP-pMSCVII-CD3εγδζ (pMIG) vector en een liposoom gebaseerde transfectiereagens instructies van de fabrikant transfect.</li>
	<li>Voor elke TCR, 6 µL transfectiereagens aan 100 µL kamertemperatuur, serumvrij DMEM toevoegen. Kort vortex, en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten</li>
	<li>In aparte 1,5 mL buizen combineren 1 µg van TCR-pMIA vector met 1 µg muis GFP-pMSCVII-CD3εγδζ (pMIG) vector of 1 µg voor elke afzonderlijke voor besturingselementen vector.</li>
	<li>Dropwise, de transfectie reagens/DMEM oplossing aan de buizen met de vector DNA toevoegen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten</li>
	<li>Dropwise, voeg de transfectie reagens/DMEM/DNA oplossing aan de HEK293T cellen. Tik zachtjes op de plaat te mengen. Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 h.</li>
	<li>Na 24 h vervangen de media, en houden van de cellen in cultuur voor extra 24 h.</li>
	<li>Verwijderen van cellen uit de plaat door krachtig pipetteren en vlekken van de cellen met anti-muis CD3 antilichaam (2,5 µg/mL) om te controleren oppervlakte uitdrukking van de chimeer-TCR stroom cytometry.</li>
	<li>Te vergelijken CD3 expressie tussen cellen transfected waren tot een vergelijkbaar niveau, gate de analyse van de cellen, uiting geven aan een vergelijkbaar hoog niveau van fluorescerende verslaggever moleculen (GFP voor CD3 complexe en Ametrine voor TCR expressie vector). Optimaal, moet de analyse worden gated op GFP + Ametrine + cellen binnen 10 4 tot en met 10-5 en TL-intensiteit ( figuur 3A). 
	Opmerking: Het niveau van CD3 expressie in cellen transfected met de chimeer constructie moet vergelijkbaar zijn met de controle muis (oorspronkelijke sjabloon) vector ( figuur 3A). De gegenereerde TCR retrovirale vectoren zijn compatibel met in vivo expressiesystemen als eerder beschreven 4.</li>
</ol>

<ol><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+development+and+the+CD4-CD8+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision.</a> Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).</li>
<li>Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+fate+and+intense+debate%3A+myths%2C+models+and+mechanisms+of+CD4-+versus+CD8-lineage+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice.</a> Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).</li>
<li>Tubo, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+naive+CD4%2B+T+cells+from+a+diverse+repertoire+produce+different+effector+cell+types+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection.</a> Cell. 153 (4), 785-796 (2013).</li>
<li>Sprouse, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+and+expression+of+human+TCRs+in+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice.</a> J Immunol Methods. , (2016).</li>
<li>Lennon, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+islet+accumulation+in+type+1+diabetes+is+a+tightly+regulated%2C+cell-autonomous+event%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event.</a> Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).</li>
<li>Dash, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+analysis+of+TCRalpha+and+TCRbeta+chains+at+the+single-cell+level+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice.</a> J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).</li>
<li>Kobayashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cloning+and+expression+system+yields+and+validates+TCRs+from+blood+lymphocytes+of+patients+with+cancer+within+10+days%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days.</a> Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).</li>
<li>Szymczak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+%27self-cleaving%27+2A+peptide-based+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).</li>
<li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li>
<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+retrogenic+mice%3A+a+rapid%2C+flexible+alternative+to+T-cell+receptor+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice.</a> Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).</li>
<li>Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+T-cell+selection+in+vivo+using+T+cell-receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice.</a> Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).</li>
<li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+percentage+of+peripheral+T+cells+with+two+different+T+cell+receptor+alpha-chains+and+of+their+potential+role+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity.</a> J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).</li>
<li>Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Bone+Marrow+Progenitor+Cells+to+Generate+T-cell+Receptor+Retrogenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li>
<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice%3A+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).</li>
<li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+%28TCR%29+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR%2FCD3+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In het huidige protocol beschrijven we een efficiënte methode voor eencellige TCR versterking en latere sub-kloont van gepaarde TCR Alfa en bèta ketens in een sjabloon retrovirale expressie vector. Hoewel verscheidene eencellige PCR protocollen hebben ontwikkeld, zijn geen tot nu toe compatibel met onmiddellijke sub-kloont in een expressie-vector. In de meeste gevallen wordt een partiële sequentie omvat de zeer variabel CDR3 regio's versterkt, met genoeg opeenvolging te extrapoleren de variabele regio. Deze kleinere groo...

De T-cel receptor (TCR) dicteert T Celgedrag tijdens ontwikkeling, steady-state/homeostase en antigene stimulatie in de periferie1,2,3. Recente uitbreiding van diepe sequencing technologieën heeft ontdekt een eerder ondergewaardeerde TCR diversiteit binnen antigeen specifieke T cel reacties. TCR diversiteit suggereert een potentieel voor functioneel brede T cel reacties. Teneinde de TCR sequentieanalyse repertoire met TCR functionele testen, moeten de sequencing-benaderingen worden ontworpen om verenigbaar met experimentele systemen en in vivo modellen gebruikt voor latere functionele analyse van select TCRs. We hebben een efficiënte aanpak voor menselijke TCR volgorde isolatie ontwikkeld en gestroomlijnd sub-kloont in een chimeer mens/muis TCR sjabloon vector compatibel met TCR expressie in HLA-gehumaniseerd muizen4. Isolatie van overeenkomstige Alfa en bèta ketens van heterodimeric TCRs vereist PCR versterking van beide ketens van een enkele cel. Hoewel verscheidene eencellige TCR klonen protocollen zijn ontwikkeld en gebruikt, zijn geen tot nu toe gemakkelijk compatibel met high-throughput gestroomlijnde directe klonen van onbekende Vα/Vβ TCRs in retrovirale vectoren nodig voor opnieuw uitdrukking in vivo 4,5,6,7. Eerdere studies hebben gebruikt twee belangrijke benaderingen, hetzij om selectief versterken een beperkt gedeelte van de TCR voldoende te extrapoleren de volgorde of te versterken van de gehele TCR reeks4,5,6 , 7. downstream functionele analyse van TCR sequenties verkregen via de eerste benadering vereist kostbaar in silico vergadering en DOVO bouw van de TCR. Terwijl de tweede benadering de volledige sequentie van de TCR biedt, is de menselijke constante regio niet compatibel met in vivo uitdrukking van de gekloonde TCRs in muismodellen. Onze aanpak is speciaal ontworpen om compatibel met in vivo functionele analyse van TCRs in muismodellen. We ontwikkelden een efficiënte en gestroomlijnde eencellige PCR protocol dat zorgt voor directe sub klonen van PCR fragmenten in de sjabloon expressie vector.
Onze aanpak maakt gebruik van een hooggevoelige multiplex-genest PCR-reactie die is uitgevoerd in twee stappen. In de eerste reactie van de multiplex stap een zwembad van 40 primers specifiek voor alle V-beta-ketens en een zwembad van 44 primers specifiek voor alle de V-alpha-ketens worden gebruikt voor het versterken van de TCR-alpha of TCR-beta zonder de voorkennis van de reeks (tabel 1). De voorwaartse primer heeft een adapter-reeks, die is opgenomen in de 5' van het PCR-product. De omgekeerde primer is gebaseerd op de constante regio van de TCR. We hebben geconstateerd dat unieke beperkingsplaatsen die afwezig uit menselijke variabele of junction TCR gebieden en verwerkt deze in nieuw ontworpen TCRα en TCRβ inleidingen (Figuur 1). In de tweede geneste reactie, worden een primers specifiek voor de opeenvolging van de adapter en een geneste omgekeerde primer binnen de constante regio gebruikt voor het verder versterken van de TCR kettingen met hogere specificiteit (tabel 1, Figuur 1). Na enkele cel isolatie, twee rondes van PCR (eerste reactie met een pool van zowel Vα als Vβ inleidingen, en ten tweede met adapter inleidingen) resulteren in een PCR product dat kan worden direct sub gekloond in de sjabloon retrovirale vector. De uiteindelijke constructie van de TCR codeert, in een enkele open leesraam (ORF), menselijke variabele regio's gecombineerd met muis constant regio's verbonden via het 'zelf verbrijzelen' eiwit sequentie, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. De volgorde van P2A is gebruikt in meerdere systemen, en is uitgebreid getest speciaal voor de expressie van TCRs8,9,10,11. Hoewel, na vertaling allermeest naar de P2A volgorde blijft gekoppeld aan de C-terminus van de alpha keten verbonden door een flexibele linker, terwijl de bèta keten signaal reeks een extra proline, deze wijziging heeft heeft geen nadelig effect op de TCR functie. De muis constant regio wordt gebruikt in de constructie in plaats van de mens om te voorkomen dat eventuele gewijzigde interacties met stroomafwaartse signalering onderdelen wanneer opnieuw uitgedrukt in muis cellen. De één ORF zal resulteren in stoichiometrische aparte expressie van Alfa en bèta ketens9,11. Het huidige protocol is gebaseerd op de reagentia en benaderingen die wijd beschikbaar zijn, en is ontworpen om te worden uitgevoerd in een gestroomlijnde en efficiënte manier. Hoewel we specifiek deze techniek gebruikt hebben om te TCRs uit zelfontledende T cellen betrokken bij auto-immuunziekte diabetes assay, verwachten wij dat dit protocol kan zijn breed toepasbaar voor identificatie en beoordeling van de functionele van menselijke TCRs specifiek voor auto-immune epitopes, kanker epitopes of reacties op pathogenen en vaccins.

<table><tbody><tr><td>CFSE&nbsp;</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>anti-human CD4 (OKT4) BV421</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-mouse CD3 AF647</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>100322</td><td>2.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU&nbsp;&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit&nbsp;</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (RT enzym)&nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA polymerase 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96 Well Half Skirt PCR Plate</td><td>Phenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Clear Adhesive Film&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&nbsp;</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U (insert) 30 U (vector)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>Calf Intestinal Phosphatase (CIP)</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>Quick ligase&nbsp;</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus minipreps DNA purification systems&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus midipreps DNA purification systems&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>DNA clean &amp; concentrator-25 kit</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 DNA clean &amp; concentrator-5 kit</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT-1 Reagent 1mL (transfectiereagens)</td><td>Mirus&nbsp;</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II (sorter)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (flow cytometer)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gestroomlijnd eencellige tcr isolatie en generatie van retrovirale vectoren voor in vitro en in vivo expressie van menselijke tcrs

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Hoewel verschillende methoden voor het rangschikken van gepaarde T-cel receptor (TCR) Alfa en bèta ketens uit één T cellen hebben ontwikkeld, zijn geen tot nu toe bevorderlijk voor downstream in vivo functionele analyse van TCR heterodimers. We hebben een verbeterde protocol op basis van een tweestaps multiplex-genest PCR, wat resulteert in een PCR product dat omspant de hele variabele regio's van een menselijke TCR Alfa en bèta ketens ontwikkeld. Door het unieke beperkingsplaatsen identificeren en hen op te nemen in de PCR inleidingen, hebben we het PCR product compatibel gemaakt met directe sub-kloont in de sjabloon retrovirale vector. De resulterende retrovirale construct codeert een chimeer mens/muis TCR met een muis intracellulaire domein, die functioneel in muis cellen of in vivo Muismodellen. Over het algemeen combineert het protocol hier beschreven menselijke eencellige gekoppeld TCR Alfa en beta keten identificatie met gestroomlijnde generatie van retrovirale vectoren gemakkelijk aanpasbaar voor in vitro en in vivo TCR expressie. De video en het begeleidende materiaal zijn ontworpen om een zeer gedetailleerde beschrijving van de eencellige PCR, zodat de kritische stappen gevolgd en potentiële valkuilen vermijden worden kunnen. Daarnaast bieden wij een gedetailleerde beschrijving van de klonen stappen die nodig zijn voor het genereren van de expressie-vector. Eenmaal onder de knie, kon de hele werkwijze vanaf één cel Sorteren op expressie van de TCR worden uitgevoerd in een korte periode van twee weken.

De efficiëntie van de multiplex-genest PCR reactie wordt gecontroleerd in stap 3.2.7 (Figuur 2) door het 5µL van de tweede reactie op een agarose gel opraakt. Gemiddeld de efficiëntie van TCR-beta versterking naar verwachting ongeveer 80%, terwijl de efficiency van de reactie van de TCR-alpha meestal lager, op ongeveer 50 is %4. Alleen gekoppelde TCR-alpha en TCR-bèta ketens kunnen worden gebruikt voor de TCR expressie; alle PCR produc...

De huidige protocol combineert eencellige gekoppeld menselijke TCR alpha en beta keten sequencing met gestroomlijnd generatie van retrovirale vectoren compatibel met in vitro en in vivo TCR expressie.

Gestroomlijnd eencellige TCR isolatie en generatie van retrovirale vectoren voor In Vitro en In Vivo expressie van menselijke TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van immunologie, zoals het TCR-alfa en bèta-repertoire van een specifieke populatie van een antigeen, evenals de in vivo functionaliteit van humane TCR's. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de relatief hoge efficiëntie van de PCR-reactie en de compatibiliteit met daaropvolgende TCR-klonen. Dit protocol gebruikt een twee-staps PCR om de TCR-alfa- en bèta-ketens uit een enkele cel te versterken zonder voorafgaande kennis van de TCR-sequentie.De eerste PCR is een multiplex-reactie met behulp van een pool van alfa- of bèta-variabele-regio-specifieke primers in combinatie met een primer specifiek voor de constante regio. De tweede PCR is een nested-reactie die primeert vanaf de adaptersequentie die in de vijf prime-einden van het PCR-product is opgenomen, evenals een interne constante regio-sequentie. Deze primers bevatten ook unieke restrictieplaatsen in de vijf prime- en drie prime-einden van het PCR-product om de daaropvolgende klonen te vergemakkelijken.Eenmaal gekloond in de sjabloonvector, is de gecodeerde TCR-sequentie chimerisch, bestaande uit humane variabele regio's met spiegelende constante regio's. De chimerische TCR-constructie zorgt voor interactie tussen de TCR en het spiegelende CD3-signaleringscomplex, waardoor dit TCR-kloonprotocol compatibel is met daaropvolgende functionele studies in spiegelende cellijnen en in gehumaniseerde muismodellen. Zorg voor de eencellige sorteer door de omgekeerde transcriptiereagentia voor te bereiden in een schone, sjabloonvrije ruimte.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in de eencellige PCR-methode worstelen vanwege de lage niveaus van sjabloon. Aan de andere kant is de gevoeligheid van de multiplex nested PCR gevoelig voor lage niveaus van sjabloonbesmetting. Daarom is het noodzakelijk om de gebieden grondig schoon te maken waarin u de PCR-reacties gaat instellen.Een mengsel van drie omgekeerde primers specifiek voor de constante regio van de alfa- en bètaketens worden gebruikt in deze reactie. Bereid het omgekeerde transcriptie mastermix voor door reagentia in een pipetteerreservoir te combineren. Om rekening te houden met pipetteerfout, maak genoeg reactiemengsel voor tien extra putjes.Gebruik een multikanaalspipet om zes microliter per putje in een 96-wells PCR-plaat te pipetteren. Bedek de plaat losjes met een afdichting en houd de plaat op ijs. Bereid T-cellen voor eencellige sorteer door de cellen te kleuren met antilichamen tegen celoppervlaktemarkers.Sorteer T-cellen een keer per putje terwijl u de twaalf rijen leeg laat, wat als negatieve controle zal dienen. Verzegeld de plaat met kleeffolie en draai gedurende vijf minuten bij 1000g bij vier graden Celsius. Voer onmiddellijk de omgekeerde transcriptiereactie uit.Als het mogelijk is, voer de eerste PCR-reactie dezelfde dag uit. Om de multiplex-reactie uit te voeren, meng apart de V-alfa en V-bèta PCR mastermixes in pipetteerreservoirs. Houd de plaat met cDNA op ijs of op een koude blok.Breng 22,5 microliter van de TCR-bèta-reactie over in een nieuwe 96-wells PCR-plaat. Gebruik vervolgens een multikanaalspipet om 2,5 microliter cDNA over te brengen naar de PCR-plaat. Gebruik een multikanaalspipet om 22,5 microliter van de TCR-alfa-reactie direct in de plaat met de rest van het cDNA te pipetteren.Verzegeld de platen met kleefstof, voorzichtig gevortext en kort gecentrifugeerd. Voer de eerste PCR-reactie uit. Platen kunnen worden bewaard bij 20 graden Celsius.De volgende dag bereidt u de tweede nested PCR-reacties voor. Gebruik een multikanaalspipet om de mastermixes voor de TCR-alfa en TCR-bèta-reacties bij 22,5 microliter per putje in twee nieuwe 96-wells PCR-platen te pipetteren. Voeg het multiplex PCR-reactie-sjabloon toe bij 2,5 microliter per putje.Verzegeld de platen, voorzichtig gevortext en kort gecentrifugeerd. De resterende eerste PCR-reactie moet worden verzegeld en bewaard bij 20 graden Celsius om als bron van back-upsjabloon te dienen. Voer de tweede PCR-reactie uit.Nadat de tweede nested PCR-reactie voltooid is, draai vijf microliter van de reactie uit op een 1% agarosegel. Voeg de positieve en negatieve controleputjes toe. De verwachte band zou rond de 500 basenparen groot moeten zijn.Zuiver de rest van de tweede reactie, twintig microliter, met behulp van een 96-wells formaat PCR-zuiveringskit en voer Sanger-sequencing uit. De verkregen TCR-sequenties kunnen worden geanalyseerd met behulp van online beschikbare immunogenetische software. De sequentie-informatie kan worden gebruikt om het repertoire en de klonalititeit van de T-celpopulatie te beoordelen.Gepaarde TCR-alfa- en bèta-sequenties kunnen worden gebruikt in verdere functionele analyse. Voer opeenvolgende ligaties uit van TCR-bèta en TCR-alfa in de sjabloonvector. De sjabloon TCR-bèta en TCR-alfa worden vervangen door de PCR-versterkte ketens.Bij de eerste ligatie wordt de sjabloon TCR-bèta vervangen door de PCR-versterkte bètaketen. Nadat de succesvolle insertie van TCR-bèta is geverifieerd door test-digest insequencing, vervangt u de sjabloon TCR-alfa met de PCR-versterkte alfaketen. HEK293T-cellen worden gebruikt om succesvolle TCR-ketenparing en celoppervlakte-expressie te testen.HEK293T-cellen worden geco-getransfecteerd met de TCR-vector gemarkeerd door de ametrine fluorescente reporter en een vector die het CD3-complex codeert, gemarkeerd door GFP. De celoppervlakte-expressie van de chimerische TCR wordt geverifieerd door flowcytometrie door de cellen te kleuren met anti-muis CD3-antilichaam. Het niveau van celoppervlakte CD3-expressie in cellen getransfecteerd met de chimerische TCR-constructie zou vergelijkbaar moeten zijn met die getransfecteerd met de volledig spiegelende controle-sjabloonvector.Kortom, we hebben een efficiënt PCR-gebaseerd protocol beschreven voor de identificatie en kloon van gepaarde TCR-ketens uit enkele cellen. We verwachten dat dit een waardevol hulpmiddel zal zijn om humane T-celreacties te bestuderen bij auto-immunite

streamlined-single-cell-tcr-isolation-generation-retroviral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We zien hier dat epigenetische herprogrammering via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) kan worden gebruikt als een instrument om muismodellen te genereren met een vooraf bepaalde T-cel receptor (TCR) specifieke kenmerken. Deze transnuclear muizen drukken de overeenkomstige TCR uit hun endogene locus onder de controle van de endogene promotor.

Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

Het manipuleren van temporele genexpressie in differentiërende embryonale stamcellen (ESCs) kan worden bereikt met behulp van induceerbare gensystemen. De generatie van deze cellijnen is echter kostbaar en tijdrovend. Dit protocol bereikt snelle expressie van een transgen in differentiërende ES-afgeleide cellen en daaropvolgende analyse van downstream hematopoëtische differentiatie.

Retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellijnen Afgeleid embryoiden lichaamscellen voor Analyse van hematopoietische differentiatie

We presenteren een snel en flexibel protocol voor een enkelvoudig T-celreceptor (TCR) retroviraal-gebaseerd in vivo expressiesysteem.  Retrovirale vectoren worden gebruikt om beenmerg-progenitorchellen te transduceren om T-celontwikkeling en functie van een enkele TCR in vivo te bestuderen als een alternatief voor TCR-transgene muizen.

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

Hierin beschrijven we een nieuwe methode om antigeenspecifieke T-celreceptoren (TCR's) door het koppelen van de TCRα of TcR van een bestaande TCR, bezit de antigeen-specificiteit van interesse, met aanvullende hemichain van de perifere T-cel receptor repertoire genereren. De novo geproduceerde TCRs behouden antigeen-specificiteit met verschillende affiniteit.

Generating<em&gt; De Novo</em&gt; Antigeen-specifieke menselijke T-cel receptoren door Retrovirale Transductie van Centric Hemichain

Dit protocol stroomlijnt de productie van retrovirale vectoren en de transductie van T-cellen bij muizen, waardoor de efficiënte generatie van CAR-T-cellen van muizen wordt vergemakkelijkt.

Efficiënte generatie van muizen chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen

We presenteren een protocol voor retrovirale transductie van gids-RNA in primaire T-cellen van Cas9 transgene muizen, en bieden een efficiënt alternatief voor genbewerking bij het bestuderen van Th17-differentiatie.

Retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in vitro

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

We presenteren verbeterde protocollen voor retrovirale transductie van transportreceptoren en competitieve homing om receptor-gemedieerde orgaan- en micro-omgevingsspecifieke lymfocytenpositionering te bestuderen. Deze methode biedt waardevolle inzichten in mechanismen voor het transport van immuuncellen en heeft potentiële toepassingen in toekomstig fundamenteel en therapeutisch onderzoek.

Efficiënte retrovirale transductie en competitieve homing voor het onderzoeken van GPCR-gemedieerde T-cellokalisatie in diverse weefselmicro-omgevingen

Er is een gedetailleerd protocol voorzien voor het gebruik van CRISPR/Cas9-technologie om zeer efficiënte, gerichte knock-in van grote, multicistronische constructies in primaire menselijke T-cellen te bereiken via de homologie-gemedieerde eindjoining (HMEJ) DNA-reparatieroute. T-cellen die met dit cGMP-aanpasbare protocol zijn ontwikkeld, behouden een uitstekende celexpansie, cytotoxiciteit en cytokineproductie.

Niet-virale engineering van primaire menselijke T-cellen via homologie-gemedieerde end-joining gerichte integratie van grote DNA-sjablonen

Dit protocol beschrijft de essentiële stappen voor de kweek van primaire T-cellen, waaronder hun isolatie, activatie, expansie en tijdelijke transfectie door mRNA-elektroporatie. Daarnaast worden een workflow en antilichaampanel voorgesteld voor flowcytometrische analyse van fenotype, activatiemarkers, levensvatbaarheid en chimere antigeenreceptor (CAR)-expressie.

Isolatie, cultivatie en tijdelijke transfectie van primaire menselijke T-cellen om chimerische antigeenreceptoren (CAR) T-cellen te genereren

Leer een gestroomlijnde methode voor TCR-isolatie uit enkele cellen en retrovirale vectorgeneratie voor immunologisch onderzoek. Deze techniek analyseert TCR-repertoire en functionele expressie in vivo.

Gestroomlijnd eencellige TCR isolatie en generatie van retrovirale vectoren voor In Vitro en In Vivo expressie van menselijke TCRs (Video) | JoVE Journal

Gestroomlijnd eencellige TCR isolatie en generatie van retrovirale vectoren voor In Vitro en In Vivo expressie van menselijke TCRs

Meer video's verkennen