Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie

Het algemene doel van dit experiment is om de in vivo vorming van bloedvaten in driedimensionale scaffolds in real-time te visualiseren met behulp van multifotonmicroscopie. Deze metingen zijn van essentieel belang in het vakgebied van botgeneratie, zoals de vraag hoe de in vivo vorming van bloedvaten in driedimensionale scaffolds in real-time kan worden geneutraliseerd en beïnvloed. Een voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om in vivo gelijktijdig CERES, extracellulaire matrices en omringende moleculaire netwerken te neutraliseren.

Bereid eerst een homogene oplossing voor die bestaat uit 20 gram PLGA en 20 milliliter 1, 4 dioxane. Voeg vervolgens twee gram nHAP-poeder toe aan de oplossing. Meng de suspensie met een magnetische roerder krachtig bij 1500 rpm op kamertemperatuur gedurende 16 uur om een uniforme pasta te vormen die gebruikt zal worden voor het printen van poreuze PLGA NHAP-steigers.

Nadat ze zijn geprint, worden de scaffolds 48 uur gevriesdroogd om alle oplosmiddelen volledig te verwijderen. Steriliseer ze vervolgens gedurende één uur in 75 procent ethanol. Lyofiliseer ze daarna nogmaals om een neutraal, antiseptisch materiaal te verkrijgen.

Voeg vervolgens 4,5 × 10⁵ lentivirale particles toe aan elk scaffold en laat de particles absorberen in een bevochtigde incubator bij 37 °C gedurende twee uur. Nadat de lentivirale particles op de scaffolds zijn geabsorbeerd, worden de scaffolds twee keer gewassen met 2 mL PBS om alle ongebonden residuen te verwijderen. Vries de gewassen scaffolds snel in met vloeibare stikstof.

Sla ze na het opnieuw lyofiliseren op bij -80 °C voor verdere studies. Breng 3D-steigers, die vooraf zijn gecoat met 4,5 × 10⁵ lentivirale partikels die het groene fluorescerende eiwit dragen, over in cryogene vials van 2,0 ml gevuld met 1 ml compleet DMEM en incubeer ze vijf dagen lang bij 37 °C onder schudcondities. Verzamel elke twaalf uur van de incubatie monsters van 1 ml van het medium dat lentivirale partikels bevat die uit de steigers zijn vrijgekomen, en vervang deze door 1 ml vers medium.

Om HEK293T-cellen te transduceren, verwijdert u eerst het medium van de HEK293T-cellen die zijn gekweekt in een 12-wells plaat en wast u de cellen twee keer met PBS. Voeg vervolgens één milliliter van het eerder verzamelde medium toe aan de gewassen HEK293T-cellen en incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator. Meet na 48 uur incubatie het aantal GFB-positieve HEK293T-cellen via flowcytometrie om het aantal bioactieve lentivirale deeltjes te bepalen.

Verdeel om te beginnen willekeurig C57 black six muizen over drie behandelingsgroepen: controle, PH en PHp, met elk 14 dieren. Scheer de huid op de kop van een geanestheseerde muis en desinfecteer het oppervlak met een jodiumtinctuur en vervolgens met een 75 procent alcoholoplossing. Plaats de kop van de muis in een stereotactisch instrument en snijd de huid in met een scalpel en maak vervolgens met een schaar een lineaire snede van één centimeter.

Schraap met een steriel wattenstaafje het periosteum van het schedelbot om het oppervlak bloot te leggen. Maak vervolgens aan de linkerzijde van de schedel met een trepanboor een kritiek defect met een diameter van vier millimeter. Transplanteer het steigerframe in de zijde van het botdefect.

Gebruik oogheelkundige pincetten om de operatiewond voorzichtig te bedekken met het periost. Sluit daarna de wond door drie hechtingen per centimeter incisie aan te brengen. Dien slutend het analgeticum buprenorfine toe om postoperatieve pijn te bestrijden en houd het dier op een warmte盤 om de lichaamstemperatuur te handhaven totdat het dier ontwaakt.

Zodra de muis het bewustzijn hervindt, dient u deze te voorzien van voedsel en water en de dagelijkse activiteit te monitoren tot het einde van het experiment. Nadat het multifoton-microscopiesysteem voor TPEF- en SHG-beeldvorming is samengesteld, stelt u de femtoseconde titanium-saffierlaser in op 860 nanometers. Om nieuw gevormde bloedvaten te visualiseren, injecteert u de muis intraveneus met 200 µL van een dextranoplossing van 10 mg/mL in zoutoplossing; immobiliseer vervolgens het geanestheseerde dier met het stereotactische instrument op een warmteplaat om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden.

Injecteer de muis intraperitoneaal met 200 µL zoutoplossing om uitdroging te voorkomen. Voorzie het dier tenslotte van een mengsel van 3% isofluraan in 100% zuurstof om voldoende anesthesie en analgesie tijdens de beeldvorming te behouden. Om te beginnen met de beeldvorming, scan een paar galvo-spiegels om een bemonsteringsgebied van 512 bij 512 µm te creëren.

Focus vervolgens de excitatiestraal op het monster met behulp van een water-immersie-objectief met een NA van 1,0 en verzamel het terugverstrooide TPEF HSG-signaal. Stel het gezichtsveld zo in dat dit het normale botgebied en de rand van het defect beslaat bij de controlegroep, maar alleen het geïmplanteerde steiger bij de beeldvorming van het dier uit de PH- of PHp-groep. Scan vervolgens vijf verschillende locaties van het defect.

Neem elke 12 seconden beeldstacks op gedurende een beeldvormingsperiode van twee uur. Hier wordt een foto getoond van het scaffold dat met de 3D-printtechniek is geprepareerd, samen met een micro-CT-beeld dat de totale porositeit van het geprepareerde materiaal laat zien. De microporeuze structuur van het scaffold wordt getoond in een SEM-beeld dat is opgenomen bij een vergroting van 5000 keer.

Zoals getoond, expresseerden HEK293T-cellen die behandeld waren met medium bevattend lentivirale lavere partikels die uit de scaffolds waren vrijgekomen, efficiënt het groene fluorescerende eiwit. Zoals geschat via flowcytometrie, bereikte het totale aantal vrijgekomen partikels ongeveer 40 procent. Het meest robuuste vrijgave-effect werd waargenomen binnen de eerste 24 uur van de studie en nam geleidelijk af in de loop van de tijd, wat bevestigt dat lentivirale partikels die op de scaffolds zijn gecoat hun biologische activiteit tot 96 uur behouden.

In vivo-analyse van de bloedvaten die gevormd werden binnen een schedeldefect toonde aan dat nieuwe bloedvaten, die in de controlegroep muizen niet detecteerbaar waren, acht weken na transplantatie van de scaffold duidelijk zichtbaar waren in zowel de PH- als de PHp-groepen. Daarnaast werden in zowel de PH- als de PHp-groepen veel plaatsen van collageendepositie gedetecteerd, maar alleen in de PHp-groep kon een toenemend aantal kleinere vaten worden waargenomen die in de scaffolds groeiden, en het totale bloedvatareaal was significant verschillend. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de kop van de muis te immobiliseren om deze tijdens het scannen stil te houden en zo artefacten te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals fotoakoestische beeldvorming, worden uitgevoerd om aanvullende gegevens te verkrijgen, zoals beelden van dieper gelegen weefsels. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van botregeneratie om angiogenese in transplantaten te bestuderen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u in vivo plasmavorming in 3d-scaffolds in real-time kunt visualiseren, en van microfotomicroscopie.