Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie

Het algemene doel van dit experiment is om de vorming van bloedvaten in vivo in driedimensionale scaffolds in realtime te visualiseren door middel van multifotonmicroscopie. Deze metingen zijn een sleutelvraag in het gebied van botgeneratie, zoals hoe het vormen van bloedvaten in vivo in driedimensionale scaffolds in realtime kan worden geneutraliseerd en misleid. Het voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om gelijktijdig CERES, extracellulaire metrische en omringende moleculaire netwerken in vivo te neutraliseren.

Om te beginnen, bereid een homogene oplossing met 20 gram PLGA en 20 milliliter 1, 4 dioxaan. Voeg vervolgens twee gram poedervormig nHAP toe aan de oplossing. Meng de suspensie krachtig met een magnetische roerder bij 1500 tpm bij kamertemperatuur gedurende 16 uur om een uniforme pasta te vormen die zal worden gebruikt voor het printen van poreuze PLGA NHAP scaffolds.

Na het printen, vriesdroog de scaffolds gedurende 48 uur om alle oplosmiddelen volledig te verwijderen. Steriliseer ze vervolgens in 75 procent ethanol gedurende één uur. Daarna, lyofiliceer ze nogmaals om neutraal, antiseptic materiaal te verkrijgen.

Voeg vervolgens vier en een half keer 10 tot de vijfde orde van lentivirale deeltjes toe aan elke scaffold en laat de deeltjes absorberen in een gehumidificeerde incubator die 37 graden Celsius handhaaft gedurende twee uur. Nu de lentivirale deeltjes op de scaffolds zijn geabsorbeerd, was de scaffolds twee keer met twee milliliter PBS om eventuele vrije residuen te verwijderen. Bevries de gewassen scaffolds snel in vloeibare stikstof.

En na wederom lyofiliceren, bewaar ze bij min 80 graden Celsius voor verder onderzoek. Breng 3D scaffolds die eerder zijn gecoat met vier en een half keer tien tot de vijfde lentivirale deeltjes die groen fluorescent eiwit dragen over in twee punt nul milliliter cryogeen vloeibare flacons gevuld met één milliliter volledig DMEM en incubeer ze bij 37 graden Celsius met schudden gedurende vijf dagen. Verzamel elke twaalf uur van de incubatie één milliliter monsters van het medium dat lentivirale deeltjes bevat die zijn vrijgekomen uit de scaffolds, en vervang ze met één milliliter vers medium.

Om HEK293T cellen te transduceren, verwijder eerst het medium van HEK293T cellen gekweekt in een 12 wel plaat en was de cellen twee keer met PBS. Voeg vervolgens één milliliter van het eerder verzamelde medium toe aan de gewassen HEK293T cellen en incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius in een gehumidificeerde incubator. Na 48 uur van incubatie, meet het aantal GFB positieve HEK293T cellen door middel van flowcytometrie om het aantal bioactieve lentivirale deeltjes te bepalen.

Om te beginnen, verdeel willekeurig C57 zwarte zes muizen in drie behandelingsgroepen: controle, PH en PHp van elk 14 dieren. Scheer de huid op het hoofd van een verdoofde muis en desinfecteer het oppervlak met een jodiumtinctuur en vervolgens 75 procent alcoholoplossing. Plaats het hoofd van de muis in een stereotactisch instrument en maak met een scalpel een snede in de huid en maak vervolgens met een schaar een lineaire snede van één centimeter.

Gebruik een steriele wattenstaafje om het periosteum van het schedelbot af te schrapen om het oppervlak te onthullen. Maak vervolgens aan de linkerkant van de schedel met een trephine boor een kritisch grootte defect van vier millimeter diameter. Transplanteer de scaffold in de zijkant van het botdefect.

Gebruik oogheelkundige pincetten om de chirurgische plaats voorzichtig te bedekken met het periosteum. Sluit vervolgens de wond door drie steken per centimeter incisie aan te brengen. Toedienen ten slotte de pijnstiller buprenorfine om postoperatieve pijn te beheersen en houd het dier op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur te handhaven totdat het wakker wordt.

Wanneer de muis bij bewustzijn komt, voorzie hem van voedsel en water en bewaak zijn dagelijkse activiteit tot het einde van het experiment. Nadat het multifotonmicroscopiesysteem voor TPEF en SHG beeldvorming is geassembleerd, stem de femtosecond titanium saffier laser af op 860 nanometer. Om nieuw gevormde bloedvaten te visualiseren, injecteer de muis intraveneus met 200 microliter van een oplossing van 10 milligram per milliliter dextran in zoutoplossing, en immobiliseer vervolgens het verdoofde dier op een verwarmende plaat om zijn lichaamstemperatuur op 37 graden Celsius te handhaven.

Injecteer de muis intraperitoneaal met 200 microliter zoutoplossing om uitdroging te voorkomen. Ten slotte, voorzie het dier van een drie procent mengsel van isofluraan in 100 procent zuurstof om voldoende anesthesie en pijnstilling te handhaven tijdens het beeldvormen. Om met beeldvorming te beginnen, scant een paar galvo spiegels om een bemonsteringsgebied van 512 bij 512 micrometer te creëren.

Gebruik vervolgens een NA een punt O water immersie objectief lens, focus de excitatie straal op het monster en verzamel het teruggekaatste TPEF HSG signaal. Stel het gezichtsveld in zodat het het normale botgebied en de rand van het defect in de controlegroep dekt, maar alleen de geïmplanteerde scaffold wanneer het dier van de PH of PHp groep wordt beeldvormd. Scan vervolgens vijf verschillende sites van het defect.

Verzamel elke 12 seconden beeldstacks over een beeldvormingsperiode van twee uur. Hier wordt een foto van de scaffold weergegeven die is voorbereid met de 3D-printtechniek, samen met een micro-CT-afbeelding die de algehele porositeit van het bereide materiaal toont. De microporeuze structuur van de scaffold is te zien in een SEM-afbeelding die is verkregen met 5000 keer vergroting.

Zoals getoond, HEK293T cellen behandeld met medium dat lentivirale deeltjes bevat die zijn vrijgekomen uit de scaffolds, hebben efficiënt het groen fluorescent eiwit geëxpresseerd. Naar schatting door middel van flowcytometrie, bereikte het totale aantal vrijgekomen deeltjes ongeveer 40 procent. Het meest robuuste vrijlatingseffect werd waargenomen binnen de eerste 2