Name: Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer zeldzame antigeen-bindende B-cellen isoleren uit menselijk perifeer bloed met magnetische nanodeeltjes voor fenotypische en functionele analyse. Deze methode verbetert immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) en de National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201 en F30OD021477).

1. Isolatie van menselijke PBMCs <ol><li> Verzamel 30-50 ml bloed met behulp van heparine bloedafnamebuisjes. OPMERKING: De hoeveelheid bloed hangt af van de specifieke experimentele vraag alsmede frequentie bloed van antigeenspecifieke B-cellen van belang. Gehepariniseerd bloed kunnen direct worden verwerkt of zachtjes geschud gedurende de nacht bij kamertemperatuur verwerken van de volgende dag. De vertraging in de verwerking heeft zeer weinig invloed op de efficiëntie van verrijking en is geassocieerd met een minimaal verlies van levensvatbaarheid. </li><li> Meng volbloed 1: 1 met een steriele, kamertemperatuur magnesium en calcium vrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> In een 50 ml steriele conische buis, voeg 10 ml kamertemperatuur dichtheidsgradiënt oplossing. Bewaar de geopende dichtheidsgradiënt flessen in het donker bij 4 ° C, maar opwarmen tot kamertemperatuur vóór gebruik. </li><li> Indien mogelijk zet de pipet pistool aan de trage instelling en / of zeer weinig, maar toch consistent, trekker druk uit te oefenen om langzaamlaag 30-35 ml van het verdunde bloed bovenop de dichtheidsgradiënt, zorg dat de twee niet te mengen. Opmerking: Het plaatsen van de punt van de pipet tegen de rand van de 50 ml conische het geven van het verdunde bloed zal zorgen voor een constante stabiele stroom. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij 20 ° C met de rem uitgeschakeld. </li><li> Verwijder de bovenste laag, die plasma en bloedplaatjes bevat, let de mononucleaire cellaag hieronder niet te verstoren. </li><li> Met een steriele pipet, verzamel de mononucleaire cellaag (buffy coat) en plaats in een afzonderlijke steriele 50 ml conische buis. </li><li> Voeg PBS aan de celsuspensie tot een volume van 50 ml. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij 20 ° C met rem. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer pellet cellen in 10 ml PBS. Tellen cellen en het bepalen van de levensvatbaarheid van het gebruik van een hemocytometer of geautomatiseerde cel tegen te gaan. </li><li> Resuspendeer cellen bij 10 7 cellen / ml en plaats op ijs tot klaar voor verdere verwerking.</li></ol> 2. Kleuring van cellen <ol><li> Verwijder 1-2 x 10 6 cellen per fluorescentie compensatie / FMO controle nodig is, indien van toepassing. Centrifuge resterende cellen bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C met rem. </li><li> Resuspendeer cellen in steriel gefiltreerd koude FACS-buffer (PBS + 1% runderserumalbumine (BSA) + 0,01% natriumazide) en 3-6 x 10 7 cellen / ml (verwijderen in een 1,5 ml centrifugebuis). Zorg ervoor dat de FACS buffer is koud en te houden op het ijs gedurende de kleuring procedure. <ol><li> Verdeel de celpopulatie in vieren (AD) bij het optimaliseren van de test. Gebruik fractie A antigeen-specifieke B-cellen plaats, gebruik fracties B en C te verrijken om de specificiteit van de verrijking / kleuring bepalen (zie 2.5 en 2.6) en het gebruik fractie D de frequentie en aantal antigeenspecifieke cellen vast te de niet aangepaste bevolking berekening van het rendement mogelijk te maken en vouw-verrijking. </li></ol></li><li> Voeg menselijk FcyR blokkeren reagent fracties AD op ijs voorkomen binding van antilichamen aan Fc-receptoren. OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant voor de juiste omstandigheden. </li><li> Add fluorochroom geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakteantigenen plaats cel fracties AD 30 min op ijs in het donker, dat evenwel niet tot fluorochromen die kunnen kruisreageren met het anti-ver-rood-fluorescerende kleurstof antilichamen gekoppeld aan magnetische nanodeeltjes omvatten. LET OP: Deze omvatten antilichaamconjugaten tot bijna-infrarood fluorescerende kleurstof, Cy5, Cy5.5 en Cy7. Elke levensvatbaarheid vlekken die toegevoegd moet verenigbaar zijn met het gebruik van een fixeermiddel zijn. Als men niet van plan de cellen met behulp van FACS analyse, maar bepalen de antilichaamsecreterende frequentie, bijvoorbeeld door ELISPOT, oppervlakte kleuring met antilichamen overbodig. </li><li> Om de specificiteit van de assay, incubeer fractie B met een voldoende hoeveelheid niet-gemerkt antigeen voor 30 min op ijs, zodat de meerderheid van de receptoren met een affiniteit van ten minste10 -6 M geblokkeerd. OPMERKING: Meestal een goede uitgangsconcentratie een 50-100-voudige overmaat van de hoeveelheid antigeen voldoende geacht 2.6 hieronder (bijvoorbeeld 50-100 pM). Dit zou een L-cellen met hoge affiniteit te blokkeren voor de ongelabelde antigen te binden aan het gebiotinyleerde antigeen, dat wordt toegevoegd in stap 2.6 hieronder, waardoor bevestiging van de specificiteit van de verrijkte cellen. Deze stap kan in combinatie met stap 2.4 worden voltooid. </li><li> Voeg gebiotinyleerd antigeen fracties A, B en D. Incubeer op ijs gedurende 30 min. OPMERKING: Concentratie van gebiotinyleerd antigeen worden getitreerd om de optimale hoeveelheid om een ​​adequate detectie en scheiding van cellen binding van niet-specifieke cellen te waarborgen bystander bepalen. Typisch een goed uitgangspunt concentratie test is 1-5 uM. LET OP: Voor fracties A en D, deze stap kan gelijktijdig worden gedaan met stap 2.4. Voor de fractie B, moet deze stap worden uitgevoerd nadat stap 2.5 (wassen in betwEen stappen niet nodig). </li><li> Weglaten gebiotinyleerd antigeen van Fraction C om eventuele binding van B-cellen aan andere reagentia in het protocol, zoals streptavidine ver rood-fluorescerende kleurstof en de magnetische korrels te bepalen. </li><li> Was de cellen tweemaal uit suspensie van cellen in 1 ml koude FACS-buffer per 5 x 10 7 cellen en centrifugatie bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Na de laatste wasbeurt, verdun geconcentreerde celsuspensie in 1 ml 2% formaldehyde per 5 x 10 7 cellen en laat zitten in het donker op ijs gedurende 5 minuten. OPMERKING: Fixatie van de cellen op dit punt verzekert dat de gebiotinyleerde antigen gebonden blijft aan de BCR voor de rest van de procedure. Voor levensvatbare cellen - voor downstream-analyse, zoals in ELISPOTs of adoptief transfers, laat de fixatie stap. </li><li> Was de cellen tweemaal met 1 ml koude FACS-buffer per 5 x 10 7 cellen en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer in 1 ml koud FACS buffer per 5 x 107 cellen. </li><li> Voeg 1-2 pg streptavidine-ver-rood-fluorescerende kleurstof / ml en incuberen op ijs gedurende 20 minuten in het donker. Titreer de hoeveelheid streptavidine voor elke toepassing. </li><li> Was de cellen tweemaal met 1 ml koude FACS-buffer per 5 x 10 7 cellen en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Fractie D is voorbereid op dit punt niet verrijking zal ondergaan met de magnetische korrels. Opmerking: Dit monster wordt gebruikt om de frequentie en het aantal antigeenspecifieke B-cellen in het monster. Deze wordt gebruikt om de opbrengst te bepalen en verrijking voudige verrijking bereikt. </li></ol> 3. magnetische nanodeeltjes gebaseerde Enrichment <ol><li> Resuspendeer cellen uit monsters AC in 1 ml koude buffer scheiding (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) per 5 x 10 7 cellen en passeren door een 40 urn filter om eventuele klonten die de kolom zou kunnen verstoppen te verwijderen. </li><li> Voeg Anti-Cy5 / Anti-ver-rood-fluorescerende kleurstof nanodeeltjes. for optimaal resultaat moet de concentratie van de nanodeeltjes worden getitreerd voor elk gebruik, maar een goed startpunt is 50 pl suspensie per 5 x 10 7 cellen / ml. Roteren in het donker bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Was tweemaal met 1 ml koude buffer scheiding bij 400 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in 1 ml koude buffer scheiding per 5 x 10 7 cellen. </li></ol> 4. Magnetische Verrijking met behulp van LS of LD Columns <ol><li> Plaats drie LS of LD kolommen in het magnetische veld van een magnetische scheider en voeg 3 ml scheidingsbuffer de kolommen nat (zie het produkt te bepalen welk type kolom het meest geschikt). Laat alle 3 ml door de kolom te passeren en gooi deze na collectie. Opmerking Hoewel scheiding van magnetische nanodeeltjes gelabelde cellen kan worden uitgevoerd met een van de magnetische scheidingsinrichtingen die commercieel verkrijgbaar zijn, het laboratorium is het meeste succes met behulp van LS kolommen had, in terms opbrengst, zuiverheid en efficiency van verrijking. </li><li> Plaats drie 15 ml conische buizen label &quot;Fractie A / (B) / (C) negatief&quot; voor negatief geselecteerde cellen in de kolom. Voeg het magnetisch gelabelde cellen hun respectieve kolom en laat het volledige volume passeren. </li><li> Voeg 3 ml koude buffer scheiding geplaatst, en laat deze door de kolom stroomt en herhaal met 2 ml. Verzamel de negatief geselecteerde cellen en zet apart op ijs. </li><li> Verwijder de kolom uit het magnetische veld en bovenop een 15 ml conische buis label &quot;Fractie A / (B) / (C) positief&quot;, voor het positief geselecteerde cellen. </li><li> Vul de kolom naar de top met ongeveer 6 ml scheidingsbuffer onmiddellijk duiken dit volume door de kolom cellen die het magnetische veld gebonden was met de bijgeleverde zuiger verzamelen. </li><li> Om de zuiverheid te verhogen, kan de positief geselecteerde cellen verder worden verrijkt met een tweede schone kolom, het herhalen van de procedure. </li><li> Spin zowel negatief als positief geselecteerde fracties bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en schorsen gewenste eindvolume. Ga verder met downstream-analyse, zoals FACS, ELISPOT of adoptieve overdracht. </li></ol>

<ol><li>de Wildt, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+analysis+and+production+of+monoclonal+antibody+fragments+originating+from+single+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells.</a> J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).</li>
<li>Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fractionation+and+arrangement+on+fibers%2C+beads%2C+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).</li>
<li>Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new%2C+simple+method+for+the+preparation+of+lymphocytes+bearing+specific+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors.</a> Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).</li>
<li>Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+centrifugation+procedure+for+the+purification+of+sheep+erythrocyte+antigen-binding+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells.</a> J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).</li>
<li>Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+antigen-enriched+b+cells.+I.+Purification+and+response+to+thymus-independent+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens.</a> J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).</li>
<li>Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+of+antigen-specific+B+lymphocytes+by+means+of+immunomagnetic+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles.</a> Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).</li>
<li>Smith, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+anergic+B+cells+in+prediabetic+and+new-onset+type+1+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients.</a> Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).</li>
<li>Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+specificity+contributes+to+the+outcome+of+diabetes+in+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice.</a> J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).</li>
<li>Woda, M., Mathew, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+dengue+viruses+as+probes+to+identify+antigen-specific+memory+B+cells+by+multiparametric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).</li>
<li>Nair, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+fluorescent+labeling+to+identify+memory+B+cells+specific+for+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+vaccine+antigens+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immun+Inflamm+Dis%22%5BJournal%5D)">Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo.</a> Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).</li>
<li>Amanna, I. J., Slifka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+rare+memory+B+cell+populations+by+two+independent+and+complementary+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches.</a> Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).</li>
<li>Scheid, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+identification+of+HIV+gp140+binding+memory+B+cells+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood.</a> Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).</li>
<li>Doucett, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+characterization+of+virus-specific+B+cells+by+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry.</a> Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).</li>
<li>Malkiel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints+for+Autoreactive+B+Cells+in+Peripheral+Blood+of+Lupus+Patients+Assessed+By+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry.</a> Arthritis Rheumatol. , (2016).</li>
<li>Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+B+cell+populations+mediate+early+and+late+memory+during+an+endogenous+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response.</a> Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).</li>
<li>Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD20+positive+human+B+lymphocytes+separated+with+the+magnetic+cell+sorter+%28MACS%29+can+be+induced+to+proliferation+and+antibody+secretion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro.</a> Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier beschrijven we een nieuwe werkwijze voor isolatie en verrijking van antigeen-bindende B-cellen uit humaan perifeer bloed bereiken. De werkwijze is goed toepasbaar voor muizen en andere weefsels zoals de milt en lymfeklieren, en is compatibel met post-verrijking analyse van cel fenotype en functie (manuscript in voorbereiding). De gebruiker moet zich bewust van een aantal variabelen die het succes van deze procedure kan beïnvloeden. Uit ervaring dode cellen meestal bij de magnetische kra...

Beperkende verdunning analyses van antilichaam uitscheidende cellen precursorfrequentie suggereren dat B-cellen reactief voor een bepaald antigeen kenmerkend optreden met een frequentie van 0,05-0,005% in de normale repertoire, afhankelijk van de status vaccinatie en grootte / het aantal aanwezige epitopen op het antigeen. De lage frequentie van deze cellen is het moeilijk om veranderingen in de status tijdens de ontwikkeling van immuunresponsen, zoals na vaccinatie en blootstelling aan een vreemd antigeen, of tijdens de ontwikkeling van auto-immuniteit te bestuderen. Eerder hebben onderzoekers isolatie van antigeen-reactieve B-cellen met behulp van technieken variërend van antigeen beklede platen of kolom adsorptiemiddelen, op met antigeen beklede rode bloedcellen resetten om uitgevoerd fluorescentie-geactiveerde celsortering 1, 2, 3, 4, 5, 6. though deze technieken zijn succesvol bij het identificeren en isoleren van antigeen-reactieve B-cellen zijn, zijn de resultaten variëren qua opbrengst, zuiverheid en schaalbaarheid. Onlangs hebben we een nieuwe methode om zowel te detecteren en te verrijken zeldzame B lymfocytensubpopulaties met magnetische nanodeeltjes. De methode kan verrijken met een relatief hoge opbrengst en zuiverheid van grote populaties starten, en is compatibel met de analyse van de reacties op antigeen. Door verrijken van populaties van cellen in suspensie, waarbij de werkwijze elimineert beperkingen die samenhangen met de geometrie van de met antigeen beklede platen of kolommen, en beperken doorvoer. Tenslotte, aangezien verrijkte cellen geassocieerd blijven met antigeen en een fluorescerende reporter, kunnen verder worden gezuiverd door FACS-sortering. Zoals hierin beschreven hebben we deze benadering voor onderzoek van perifeer bloed tetanustoxoïde-reactieve B-cellen voor en na immunisatie van menselijke patiënten, evenals autoantigeen-reactieve B-cellen van patiënten met verschillende autoi gebruiktmmune aandoeningen, waaronder type 1 diabetes, de ziekte van Graves, en de ziekte van 7 Hashimoto. De werkwijze werkt evengoed bij muis en mens, en is compatibel met de analyse van antigeen-reactieve B-cellen van verschillende weefsels (manuscript in voorbereiding). In de basisopstelling weergave worden perifeer bloed mononucleaire cellen eerst geïncubeerd met gebiotinyleerd antigeen met antilichamen tegen oppervlakteantigenen vereist voor fenotypische analyse cel. Deze etikettering wordt gevolgd door wassen en fixatie, en toevoeging van streptavidine gekoppeld met ver-rood-fluorescerende kleurstof voor detectie van het gebiotinyleerde antigeen bindende cellen (Figuur 1). Eerdere studies hebben antigeenspecifieke B-cellen die in een vergelijkbare wijze maar met gebruik van antigenen rechtstreeks geconjugeerd aan een fluorochroom 8, 9, 10, 11. Hoewel dit is een waardigebenadering, gebruik van gebiotinyleerde antigenen in combinatie met streptavidine maakt grotere signaalversterking (dus betere differentiatie van bindende en niet-bindende cellen), met name wanneer antigenen kleine 12, 13, 14. Een aanvullende overweging is het gebruik van streptavidine in plaats van avidine omdat streptavidine gedeglycosyleerde, afneemt aspecifieke binding. Verder gebruiken we ver-rood-fluorescerende kleurstof als fluorochroom vanwege de fotostabiliteit, kwantumopbrengst (helderheid) en de kleine afmetingen (~ 1,3 kD). Eiwit fluorochromen zoals phycoerythrine (~ 250 kD) en allofycocyanine (~ 105 kD) 15 niet optimaal omdat veel potentieel antigene epitopen bevatten. Toepassing van een kleine organische fluorescente kleurstof uit één epitoop, zoals ver-rood-fluorescerende kleurstof, vermindert de complexiteit van de geïsoleerde celpopulatie. Zodra cellen gebiotinyleerd-antigen en ver-rood-fluorescerende kleurstof-streptavidine geadsorbeerd, worden ze verrijkt met behulp van anti-ver-rood-fluorescerende kleurstof-geconjugeerde magnetische nanodeeltjes. Één nanodeeltjes worden niet herkend door de meeste flowcytometers en derhalve niet behoeven te worden verwijderd vóór zuivering door FACS sortering en downstream assays 16. Magnetische selectie van antigeenspecifieke B-cellen verrijkt de populatie van belang, waardoor de tijd en kosten van sortering zeldzame gebeurtenissen met een flow cytometer. Hieronder tonen we representatieve resultaten van de verrijking van tetanus-toxoïde-specifieke B-cellen van een patiënt vóór en zeven dagen na tetanustoxoïd booster immunisatie. We kozen deze specifieke toepassing als bijvoorbeeld om het vermogen van deze methode om antigeenspecifieke B-cellen in vivo na acute stimulatie verrijking tonen. In combinatie met flowcytometrie is deze methode geschikt voor het verrijken en differentiëren antigeenspecifieke naïeve, geheugen, enplasmablast B-cellen en kan de onderzoeker aan veranderingen in de frequentie in de tijd te volgen. Bovendien nemen we een andere mogelijke downstream assay, zoals een ELISPOT assay, hetgeen aantoont dat cellen behouden het vermogen om antilichaam uitscheiden na verrijking. Een andere toepassing van deze werkwijze adoptieve overdracht van verrijkte cellen in een gastheer kunnen inhouden. We hebben eerder aangetoond cellen behouden het vermogen om als antigeenpresenterende cellen om antigenspecifieke T-cellen na isolatie en overdracht (gegevens niet getoond). Daarom zijn er een aantal mogelijke downstream assays die kunnen worden gekoppeld met de methode, die tezamen het begrip van de antigeen-specifieke immuunrespons informeert. We hebben de hieronder beschreven methode, met inbegrip van de controles aan de totale opbrengst, zuiverheid, cel specificiteit te bepalen, en vouw-verrijking.

<table><tbody><tr><td>Antigen van belang</td><td>variabel</td><td>variabel</td><td>Minimaal 100 &mu;g om gemakkelijk te biotinyleren; gebruik bij gebruik van eiwit een eiwit dat is gevalideerd door ELISA. Het moet vrij zijn van dragereiwit&nbsp;</td></tr><tr><td>Biotine voor labeling; bijv. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotine</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>Biotine is beschikbaar in verschillende formuleringen, zoals die met&nbsp; ruimte tussen verschillende lengtes, dus het type dat wordt gebruikt moet worden bepaald door de onderzoeker</td></tr><tr><td>Streptavidine-Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S21374</td><td>Kan worden verkregen bij andere leveranciers.</td></tr><tr><td>Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-395</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolommen</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS handmatige scheiders</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>variabel</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td></td><td></td><td>Verdun tot 2% met PBS; optioneel als downstream assay levende cellen vereist</td></tr><tr><td>PBS zonder calcium en magnesium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Vol bloed in heparine gevulde opvangbuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0,01% natriumaziet)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scheidelingsbuffer (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml kegelbuizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml kegelbuizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf buisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactieve oppervlaktemarker antilichamen, Fc Block, levend/dood discriminerende kleurstof, indien nodig</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISPOT benodigdheden, indien nodig</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detectie en verrijking van zeldzame antigeen-specifieke b-cellen voor analyse van fenotype en functie

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B-cellen die reageren met een specifiek antigeen komen meestal voor met een frequentie van <0,05% van de lymfocyten. Al tientallen jaren zijn onderzoekers op zoek naar methoden om deze zeldzame cellen te isoleren en te verrijken voor studies naar hun fenotype en biologie. Benaderingen zijn onvermijdelijk gebaseerd op het principe dat B-cellen natuurlijk antigeen herkennen door middel van celoppervlaktereceptoren die representatief zijn voor de specificiteit van antilichamen die uiteindelijk door hun gedifferentieerde dochters zullen worden uitgescheiden. Misschien is de meest voor de hand liggende benadering van het probleem het gebruik van fluorochroom-geconjugeerde antigenen in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). De bruikbaarheid van deze methoden is echter beperkt door de celfrequentie en de haalbare snelheid van analyse en isolatie door elektronische sortering. Er wordt een nieuwe methode beschreven om zeldzame antigeenspecifieke B-cellen te verrijken met behulp van magnetische nanodeeltjes die resulteren in een hoge opbrengstverrijking van antigeen-reactieve B-cellen uit grote uitgaande celpopulaties. Deze methode maakt een beter toezicht mogelijk op het fenotype en de biologie van antigeen-reactieve cellen voor en na in vivo antigeen-ontmoeting, zoals na immunisatie of tijdens de ontwikkeling van auto-immuniteit.

Analyse van de zuiverheid, opbrengst, en vouw-verrijking met behulp van flowcytometrie Populaties verrijkt zoals hierboven beschreven onvermijdelijk contaminerende cellen die niet gebonden streptavidine far-red-fluorescerende kleurstof maar zijn ingevangen in de matrix bevat. Deze verontreinigingen kunnen van verrijkte populaties van FACS-sortering worden verwijderd. Om de zuiverheid van verrijkte populatie te schatten, poort op ...

Een eenvoudige maar effectieve methode die magnetische nanodeeltjes in dienst aan antigeen-reactieve B-cellen voor functionele en fenotypische analyse op te sporen en te verrijken wordt beschreven.

Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Het algemene doel van deze eenvoudige maar effectieve procedure is het isoleren en verrijken van zeldzame antigeenbindende B-cellen uit menselijk perifeer bloed met behulp van magnetische nanodeeltjes voor hun fenotypische en functionele analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de immunologie met betrekking aan het fenotype en de biologie van zeldzame antigeenbindende B-cellen, zowel vóór als na een in-vivo antigeeninteractie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het problemen wegneemt die geassocieerd zijn met geometrie, in het bijzonder wanneer men een styreenplaat of een grote kraal gebruikt.Bovendien voorkomt het problemen die verband houden met de stroomsnelheid wanneer men zeldzame cellen isoleert uit vrij grote startcellpopulaties middels flowcytometrie. Meng direct na het opvangen van 30 tot 50 milliliters volbloed in geheparineerde bloedafnamebuizen het bloed in een ratio van 1:1 met steriele, op kamertemperatuur gebrachte magnesium- en calciumvrije PBS. Laag vervolgens het bloedmengsel op 10 milliliters dichtheidsgradiëntoplossing op kamertemperatuur in een steriele conische buis van 50 milliliter, waarbij een langzame en consistente druk op de pipetknop wordt uitgeoefend.Scheid de cellen door middel van centrifugatie. Verwijder het plasma en de bovenlaag die bloedplaatjes bevat en gebruik een steriele pipet om de buffy coat met mononucleaire cellen over te brengen naar een nieuwe steriele buis van 50 milliliter. Vul de buis aan tot 50 milliliters PBS voor het wassen van de mononucleaire cellen door centrifugatie.Resuspendeer vervolgens het pellet in 10 milliliters verse PBS voor het tellen en resuspendeer de cellen tot een concentratie van 1x10^7 cellen per milliliter in verse PBS op ijs. Om de cellen te kleuren voor binding aan magnetische beads, brengt u eerst aliquots van 1-2x10^6 cellen over in vijf milliliter polystyreenbuisjes voor elke fluorescentiecompensatie en Fluorescence Minus One-controle, indien van toepassing. Verzamel vervolgens de rest van het cellenmonster door centrifugatie en resuspendeer het pellet tot een concentratie van 3-6x10^7 cellen per milliliter in steriel gefilterde koude FACS-buffer.Verdeel de celoplossing gelijkmatig over vier FACS-buisjes op ijs en voeg menselijke Fcgamma-receptor-blokkeringsreagens toe aan deze vier experimentele monsterfracties. Voeg na afloop van de incubatie voor het blokkeren van aspecifieke binding de passende fluorescentie-geconjugeerde antilichamen voor celoppervlak-kleuring toe aan de cellen in alle vier de monsterfracties. Voeg vervolgens het passende gebiotineerde antigeen toe aan fracties A en D, gevolgd door de toevoeging van een voldoende volume niet-gelabeld antigeen aan fractie B, zodanig dat de meeste receptoren met een affiniteit van ten minste 1x10^6 molar geblokkeerd zijn.Incubeer alle monsters gedurende 30 minuten op ijs, gevolgd door een incubatie van 30 minuten van fractie B met het betreffende gebiotineerde antigeen. Was na afloop van de incubaties de cellen twee keer in één milliliter ijskoude FACS-buffer per 5x10^7 cellen. Resuspendeer de pellets vervolgens gedurende vijf minuten in het donker op ijs in één milliliter 2% formaldehyde per 5x10^7 cellen.Na de fixatie worden de cellen nog twee keer gewassen, zoals zojuist gedemonstreerd. Resuspendeer vervolgens de pellets in één milliliter verse, ijskoude FACS-buffer per 5x10^7 cellen. Label de cellen daarna met één tot twee microgram van het passende secundaire streptavidine-geconjugeerde antilichaam gedurende 20 minuten in het donker op ijs en was de cellen nog twee keer.Voor verrijking op basis van magnetische nanodeeltjes resuspendeert u de cel fracties A, B en C in één milliliter koude Separation Buffer per 5x10^7 cellen en filtert u de cellen door individuele 40 microliter strainers om eventuele klonten te verwijderen. Voeg vervolgens de fluorescente kleurstof-nanodeeltjes toe in de juiste concentratie gedurende 10 minuten in het donker bij vier graden Celsius onder rotatie en was de monsters twee keer in één milliliter koude Separation Buffer. Resuspendeer de pellets in één milliliter koude Separation Buffer per 5x10^7 cellen.Equilibreer vervolgens drie magnetische kolommen op bijbehorende magneten met telkens drie milliliter Separatiebuffer, waarbij het volledige volume Separatiebuffer door elke kolom in een afvalbak wordt geleid. Plaats nu onder elke kolom een gelabelde conische buis van 15 milliliter en voeg de met magnetische partikels gelabelde cellen toe aan de respectievelijke kolommen. Wanneer het volledige volume van elke celfractie door elke kolom is gestroomd, voegt u drie milliliter verse, ijskoude Separatiebuffer toe aan de bovenkant van elke kolom en verzamelt u de effluenten in de gelabelde buizen.Nadat de tweede wasbeurt volledig door de kolommen is geloopen, worden de buisjes met negatief geselecteerde cellen van elke fractie op ijs geplaatst en worden de kolommen overgebracht naar nieuwe buisjes van 15 milliliter voor elke fractie. Vul elke kolom met ongeveer zes milliliter verse Separation Buffer en drijf de buffer onmiddellijk door de kolommen om de magnetisch gebonden cellen op te vangen. Verzamel vervolgens zowel de positieve als de negatieve celfracties door middel van centrifugatie en resuspendeer de pellets in de geschikte oplossing voor de geplande downstream-analyse.In deze grafieken laat de frequentie van tetanus-toxoïd-reactieve B-cellen van een persoon die voor het laatst meer dan tien jaar geleden is gevaccineerd tegen tetanus zien dat deze methode in staat is om de tetanus-toxoïd-bindende cellen ongeveer zevenvoudig te verrijken met een zuiverheid van circa 4%. De toevoeging van een 50-voudig overschot aan ongelabeld tetanus-toxoïd aan de cellen van een proefpersoon die ongeveer drie jaar vóór de bloedafname was gevaccineerd, resulteerde in een afname van de tetanus-toxoïd-binding met 83% voordat het gebiotineerde antigeen werd toegevoegd, wat de specificiteit van de antigeenbinding aantoont. Wanneer het gebiotineerde antigeen uit de procedure wordt weggelaten, bindt nog slechts 0,2% van de B-cellen, wat vermoedelijk de binding van een niet-tetanus-antigeen in het absorbent weerspiegelt.Deze grafieken laten zien hoe de frequentie van tetanus-toxoïde-specifieke naïeve B-cellen uit een bloedmonster, afgenomen zeven dagen na de booster-vaccinatie van een gezonde proefpersoon, afneemt van 84% naar 64% na de boost. Tegelijkertijd stijgt het percentage van de geheugen- en plasmablastpopulaties respectievelijk van 16% naar 36% en van nul naar 40%. Bovendien illustreren representatieve ELISPOT-gegevens van een perifeer bloedmonster, verkregen zeven dagen na de boost van een gezonde proefpersoon, de verviervoudige verrijking in de frequentie van tetanus-toxoïde antilichaam-secreterende cellen die werd waargenomen in de geïsoleerde tetanus-toxoïde-bindende B-cellen.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer drie tot vier uur worden voltooid met alle juiste controles. De methode kan worden gecombineerd met secundaire assays, zoals de overdracht van cellen naar geadopteerde recipiënten voor daaropvolgende studies naar het lot en de functie van de cellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u zeldzame antigeenbindende B-cellen uit menselijk perifeer bloed kunt isoleren en verrijken met behulp van de juiste controles.

detection-enrichment-rare-antigen-specific-b-cells-for-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze procedure beschrijft de detectie en isolatie van de muis Th17 leukocyten die actief IL-17 afscheiden na stimulatie.

Detectie en isolatie van levensvatbare muis IL-17-afscheidende T-cellen

Dit protocol beschrijft het gebruik van peptide: MHC tetrameren en magnetische microbolletjes voor laagfrequente populaties van epitoop-specifieke T-cellen isoleren en analyseren door flowcytometrie. Deze methode maakt de directe bestudering van endogene T-celpopulaties plaats...

Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

This video demonstrates the use of the ELISpot assay to assess the function of antibody-secreting B cells, ASCs. The antibodies secreted by the ASCs interact with the membrane-bound polyclonal antibody fragments, which are detected by the enzyme-conjugated IgG or IgM antibodies. The colored spot produced in each well indicates the presence of the specific antibody's isotype, which correlates with the B cells' secretory activity.

Functional Assessment of Antibody-Secreting B Cells Using ELISpot Assay

Immunofenotypeer van vol bloed is onmisbaar voor het bewaken van het menselijk immuunsysteem. Echter, het aantal benodigde reagentia en de instabiliteit van specifieke fluorochromen in voorgemengde cocktails vereisen dagelijkse bereiding van reagentia. Hier laten we zien dat semi-geautomatiseerde bereiding van een kleuringsantilichaamcocktail helpt om betrouwbare immunofenotypering te vestigen door de variabiliteit in het doseren van reagentia te minimaliseren.

Een semi-automatische Aanpak Voorbereiding Antibody Cocktails voor Immunophenotypic Analyse van de humane perifere bloed

Menselijk perifeer bloed wordt vaak gebruikt voor de beoordeling van de humorale immuunrespons. Hier worden de methoden beschreven voor het isoleren van menselijke B-cellen uit perifeer bloed, het differentiëren van menselijke B-cellen in antilichaam (Ab)-secreterende B-cellen (ASC's) in cultuur en het tellen van het totale aantal IgM- en IgG-ASC's via een ELISpot-assay.

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

Beschrijven we een methode voor de productie van menselijke antilichamen specifiek voor een antigeen van belang vanaf zeldzame B-cellen die in menselijk bloed circuleren. Generatie van deze natuurlijke antilichamen is efficiënt en snel, en de verkregen antilichamen kunnen onderscheid maken tussen sterk verwante antigenen.

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

Hier beschrijven we een eencellige proteomic aanpak om te evalueren van immuun fenotypische en functionele (intracellulaire cytokine inductie) veranderingen in het perifere bloedmonsters geanalyseerd via massale cytometry.

Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry

Antigeen-specifieke T-cellen zijn moeilijk te karakteriseren of frametechnieken gebruiken in therapieën vanwege hun extreem lage frequentie. Hierin bieden we een protocol voor de ontwikkeling van een magnetische deeltjes die aan antigeen-specifieke T-cellen binden kan te verrijken van deze cellen en vervolgens uit te breiden ze verschillende keer voor zowel de karakterisering en de therapie.

Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

We bieden een gedetailleerd protocol voor het isoleren en identificeren van zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulaties in muizenlongen door middel van T-celverrijking op basis van magnetische kralen en peptide:major histocompatibility complex (MHC)-tetrameren.

Identificatie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen uit muizenlongen met peptide: belangrijke histocompatibiliteitscomplextetrameren

Leer zeldzame antigeen-bindende B-cellen isoleren uit menselijk perifeer bloed met magnetische nanodeeltjes voor fenotypische en functionele analyse. Deze methode verbetert immunologisch onderzoek.

Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie

Meer video's verkennen