Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie

Het algemene doel van deze eenvoudige maar effectieve procedure is om zeldzame antigeenbindende B-cellen uit menselijk perifeer bloed te isoleren en te verrijken met behulp van magnetische nanodeeltjes voor hun fenotypische en functionele analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie met betrekking tot het fenotype en de biologie van zeldzame antigeenbindende B-cellen, zowel vóór als na een ontmoeting met antigeen in-vivo. Het grote voordeel van deze techniek is dat het problemen vermijdt die geassocieerd zijn met geometrie, vooral wanneer men een styreenplaat of een grote kraal gebruikt.

En het vermijdt problemen die geassocieerd zijn met stroomsnelheid wanneer men cellen isoleert door middel van flowcytometrie om zeldzame cellen in vrij grote startcellpopulaties te isoleren. Direct na het verzamelen van 30 tot 50 milliliter vol bloed in heparine-gecoate bloedopvangbuisjes, meng het bloed in een 1:1-verhouding met steriele magnesium- en calciumvrije PBS op kamertemperatuur. Vervolgens, giet het bloedmengsel op 10 milliliter kamertemperatuur dichtheidsgradiëntoplossing in een steriele 50 milliliter kegelbuis met behulp van langzame consistente pipettriggerdruk.

Scheiden de cellen door centrifugatie. Gooi de plasma- en bloedplaatjeshoudende bovenste laag weg en gebruik een steriele pipet om de mononucleaire cellenbuffy coat over te brengen naar een nieuwe steriele 50 milliliter buis. Vul de buis tot 50 milliliter met PBS voor het wassen van de mononucleaire cellen door middel van centrifugatie.

Vervolgens, resuspendeer de pellet in 10 milliliter vers PBS voor het tellen en resuspendeer de cellen op een concentratie van 1x10^7 cellen per milliliter in vers PBS op ijs. Om de cellen te kleuren voor magnetische kraalbinding, draag eerst 1-2x10^6 cellenaliquots over naar vijf milliliter polystyreenbuisjes voor elke fluorescentiecompensatie en Fluorescence Minus One controle naargelang geschikt is. Vervolgens, verzamel de rest van het cellenmonster door middel van centrifugatie en resuspendeer de pellet tot een concentratie van 3-6x10^7 cellen per milliliter in steriele gefilterde koude FACS-buffer.

Splits de cellenoplossing gelijkmatig in vier FACS-buisjes op ijs en voeg humane Fcgamma-receptorblokkeringsreagent toe aan deze vier experimentele monsterfracties. Aan het einde van de non-specifieke bindingsblokkeringsincubatie, voeg de geschikte fluorescentie-geconjugeerde celoppervlaktekleuringantilichamen toe aan de cellen in alle vier monsterfracties. Vervolgens, voeg het geschikte biotinyleren antigeen toe aan fracties A en D gevolgd door de toevoeging van een voldoende volume ongelabeld antigeen aan fractie B zodat de meerderheid van de receptoren met een affiniteit van ten minste 1x10^6 molair geblokkeerd wordt.

Incubeer alle monsters gedurende 30 minuten op ijs gevolgd door een 30 minuten incubatie van fractie B met het geschikte biotinyleren antigeen. Aan het einde van de incubaties, was de cellen twee keer in één milliliter ijskoude FACS-buffer per 5x10^7 cellen. En resuspendeer de pellets in één milliliter 2% formaldehyde per 5x10^7 cellen gedurende vijf minuten in het donker op ijs.

Na fixatie, was de cellen nogmaals twee keer zoals zojuist aangetoond. En resuspendeer de pellets in één milliliter verse ijskoude FACS-buffer per 5x10^7 cellen. Label vervolgens de cellen met één tot twee microgram van het geschikte secundaire Streptavidine-geconjugeerde antilichaam gedurende 20 minuten in het donker op ijs en was de cellen nogmaals twee keer.

Voor magnetische nanodeeltje-gebaseerde verrijking, resuspendeer de A, B en C cellenfracties in één milliliter koude Scheidingsbuffer per 5x10^7 cellen en filter de cellen door individuele 40 microliter zeefjes om eventuele klonters te elimineren. Vervolgens, voeg de fluorescente kleurstof nanodeeltjes toe in de geschikte concentratie gedurende 10 minuten in het donker bij vier graden Celsius met rotatie en was de monsters twee keer in één milliliter koude Scheidingsbuffer. Resuspendeer de pellets in één milliliter koude Scheidingsbuffer per 5x10^7 cellen.

Vervolgens, breng drie magnetische kolommen in evenwicht op hun geschikt gedimensioneerde magneten met elk drie milliliter Scheidingsbuffer, waarbij het gehele volume Scheidingsbuffer door elke kolom in een afvalcontainer loopt. Plaats nu een gelabelde 15 milliliter kegelbuis onder elke kolom en voeg de magnetische deeltjesgelabelde cellen toe aan hun respectieve kolommen. Wanneer het gehele volume van elke cellenfractie door elke kolom is gepasseerd, voeg drie milliliter verse ijskoude Scheidingsbuffer toe aan de bovenkant van elke kolom, waarbij de effluenten in de gelabelde buisjes worden verzameld.

Nadat de tweede wassing volledig door de kolommen is gedraineerd, plaats de buisjes met negatief geselecteerde cellen van elke fractie op ijs en breng de kolommen over naar nieuwe 15 milliliter buisjes voor elke fractie. Vul elke kolom met ongeveer zes milliliter verse Scheidingsbuffer en duw de buffer onmiddellijk door de kolommen om de magnetisch gebonden cellen te verzamelen. Verzamel vervolgens zowel de positieve als negatieve cellenfracties door middel van centrifugatie en resuspendeer de pellets in de geschikte oplossing voor de geplande downstream-analyse.

In deze grafieken, toont de frequentie van tetanus-toxoïde reactieve B-cellen van een persoon die meer dan een decennium geleden voor het laatst tegen tetanus werd gevaccineerd de mogelijkheid van deze methode om de tetanus-toxoïde bindende cellen ongeveer zevenvoudig te verrijken met een zuiverheid van ongeveer 4%. De toevoeging van een 50-voudig overschot van ongelabeld tetanustoxoïde aan de cellen van een persoon die ongeveer drie jaar vóór het bloedmonster werd gevaccineerd. Voordat biotinyleren antigeen wordt toegevoegd, wordt de tetanus-toxoïde binding verlaagd met 83% wat de specificiteit van antigeenbinding aantoont. Wanneer het biotinyleren antigeen wordt weggelaten in de procedure, binden nog slechts 0,2% van de B-cellen, vermoedelijk weerspiegelend de binding van een of ander niet-tetanus antigeen in het absorberend materiaal.

Deze grafieken to