Name: Een protocol om de morfologische veranderingen van Clostridium difficile In reactie op Antibiotische Behandeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Leer een microbiologische beeldvormingsmethode voor het bestuderen van morfologische veranderingen in Clostridium difficile na antibiotische behandeling met behulp van rasterelektronenmicroscopie. Deze techniek combineert hoge-resolutie imaging met in vitro celkultuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze experimenten zijn ondersteund door onderzoekssubsidies van Merck and Co. en Summit, PLC.

1. Isolatie van C. difficile uit verschillende milieu- of klinische bronnen <ol><li> Milieuisolaten: Gebruik een voorgesteriliseerd katoenmeter (licht bevochtigd met 0,85% NaCl), snijd het oppervlak van een bezienswaardigheid (vloer, deur, handvat, plank, enz. ). 8 Zorg ervoor dat u steriele handschoenen draagt ​​en de doek in een gesteriliseerde buis plaatst nadat u klaar bent. </li><li> Klinische isolaten (ontlasting): Plaat 10 tot 100 mg klinische ontlastingmonsters op cefoxitine-cycloserine-fructose-agar (CCFA) met een inentingslus en incuberen onder strikte anaërobe omstandigheden gedurende 48 - 72 uur. Bewaar geïsoleerde kolonies van C. difficile voorraad in cryovials bij -80 ° C voor verdere analyses. 7 , 9 , 10 </li><li> Verrijk de zuivelmonsters in de hersenhart infusie (BHI) bouillon met 0,05% natriumtaurocholaat en plaats in een anaërobe kamer bij 37 ° CVoor 5 dagen. Centrifugeer 1 ml van de kweek bij 10.000 xg en resusteer de pellet in 100 μl ethanol. </li><li> Platte de geresuspendeerde cellen (50 μl) op cycloserinecefoxitine fructose agar (CCFA) platen en incubeer gedurende 40-48 uur in een anaërobe kamer bij 37 ° C. Bewaar geïsoleerde kolonies van C. difficile voorraad in cryovials bij -80 ° C voor verdere analyses. </li><li> Test verdachte C. difficile kolonies met behulp van het latexagglutineringsreagens of PCR. </li></ol> 2. Culturing C. difficile en Killing Kinetische Procedures <ol><li> Groei gezuiverde milieu- of klinische C. difficile stammen op bloedagarplaten in een anaërobe kamer bij 37 ° C gedurende 48 uur. </li><li> Neem één geïsoleerde kolonie met een inoculatielus, zet het over in 5 ml BHI-medium in een 15 ml buis en groei gedurende 24 uur in een anaërobe kamer bij 37 ° C. </li><li> Verdun de pre-culturen 1: 100 tot ongeveer 10 6 kolonievormende eenheidS (CFU) / ml in vers voorverdiend BHIS (BHI plus 5 g / l gist extract en 1% L-cysteïne) aangevuld met 0,1% natriumtaurocholaat en de juiste concentratie antibiotica (T0). </li><li> Verzamel een 1 ml monster met een pipet op elk tijdstip (T0, T6, T24, T48) en plaat / verspreid een kleine aliquot (100 μL in seriële verdunningen) op een bloedagarplaat. Laat de cellen op 48 uur in een anaërobe kamer bij 37 ° C groeien en tel het resulterende aantal kolonies om CFU te bepalen. </li></ol> 3. Het voorbereiden van monsters voor het scannen van elektronenmicroscopie <ol><li> Verzamel 1 ml cellen van elk tijdstip in microcentrifugebuizen en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant en wascellen in PBS. </li><li> Centrifugeer de monsters opnieuw bij 10.000 xg gedurende 10 minuten en wrijf de supernatant af. Re-verdunde cellen in 1 ml 4% paraformaldehyde en incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer de monsters opnieuw gedurende 10 minuten bij 10,000 xg en weggooien supernatant. Was cellen tweemaal met gedestilleerd water en roer in 100 μl gedestilleerd water. Pas volume aan, afhankelijk van de troebelheid van de oplossing. OPMERKING: Het maken van meerdere seriële verdunningen is een goed idee. </li><li> Etiket deksels en voeg 40 μL van het monster erop. Incubeer gedurende 15 minuten in een debiet om de vloeistof te verdampen en laat de cellen aan de deklaag kleven. Als er nog vloeistof aanwezig is, gebruik een ventilator om de vloeistof te verwijderen. </li><li> Plaats gelabelde dekglazen met cellen in een bureau spuitmachine en tape omlaag. Zet puur goud in de sputtermachine. Zet de machine aan en begin met sputteren bij lage druk (50 mTorr). Coatcellen gedurende 30 s bij 80 mA, die vertaalt naar 20 nm goudcoating. </li><li> Overdracht gecoate cellen naar de aftast elektronenmicroscoop. </li></ol> 4. Imaging C. difficile cellen op een scanning elektronenmicroscoop <ol><li> Haal de aftastelektronmicroscoop (SEM) goed uit door prDe ventilatieknop op de computersoftware. </li><li> Bevestig de bekledde deklagen op de metalen trap met behulp van koolstofband. Zodra de SEM is afgevoerd, dient de deur gemakkelijk te openen. Sluit de metalen trap in de SEM-kamer door erin te schroeven. </li><li> Klik op de POMP knop op de computer software. De SEM zal bruikbaar zijn als het systeem &quot;Vac OK&quot; leest. </li><li> Klik op de SE-detector onder het detectors tabblad. Zet de balk aan door op de knop die de spanning geeft, te klikken. Start afbeelden bij een lagere spanning (5 kV) alvorens de spanning te verhogen (tot 15 kV). Een afbeelding verschijnt nadat de balk is ingeschakeld. </li><li> Met behulp van de tracking functie, zoek een gebied op de bekledde coverlips naar de afbeelding. Zoom in de regio en vind staafvormige structuren; Dit zijn clostridium difficile . </li><li> Zoom in en focus op de afbeelding om het systeem te kalibreren. Dit dient op meerdere werkafstanden te gebeuren: 15, 9 en 5 mm. Beeld op een werkafstand van 5 mm. </li><li> Schakel de u aanLtra hoge resolutie beeldvormingsmodus en begin astigmatisme te concentreren en optimaliseren. </li><li> Begin met hoge vergroting te concentreren. Gebruik hiervoor de grove en fijne focus. Pas het astigmatisme ook aan om een ​​duidelijker beeld te krijgen. <ol><li> Verstel astigmatisme bij hoge vergroting. Om dit te doen, pas de astigmatismewissels aan (ze lijken op de fijne / grove focuswisseling) en controleer het beeld voor de duidelijkheid door digitaal in te zoomen op de computersoftware. </li></ol></li><li> Zie de slow scan functie om een ​​hoge kwaliteit afbeelding te verzamelen. Sla de verzamelde afbeelding op als een .TIFF-bestand, dat gebruikt wordt voor analyse. Zorg dat de gegevensbalk geselecteerd is als er tijdens de analyse metingen worden gemeten. </li><li> Verzamel beelden op verschillende hoeken (tot 52 ° door de hoek direct op de SEM te draaien. Hoekige beelden geven de nadere informatie meer informatie weer. </li><li> Verander de bundelspanning afhankelijk van de cellen die worden afgebeeld. Houd dit meestal tussen 5 - 15 kV voor alle experimenten. </li&gt; <li> Nadat de beeldvorming is voltooid, zet u de balk uit en verhoog de werkafstand tot 20 mm. De kamer kan dan worden afgezet en het podium kan worden verwijderd. Kopieer alle beelden op een drive voor verdere analyse. </li></ol> 5. Beeldverwerking en analyse <ol><li> Download en installeer de vrij beschikbare software, FIJI (http://fiji.sc), naar de computer. </li><li> Open het beeldbestand in FIJI. </li><li> Gebruik de lijnfunctie om de schaalbalk nauwkeurig op te sporen. </li><li> Klik op het tabblad Analyse in het FIJI-programma en kies uiteindelijk de Select Scale-functie. Er verschijnt een venster dat de instelling van de bekende afstand vereist op basis van de schaalbalk. Verander ook de lengte-eenheid en klik op OK. </li><li> Nu het programma voor afstand is gekalibreerd, gebruik dan de lijnfunctie om de cellengte te meten. Om de lengte te verkrijgen, gebruik de lijnfunctie om de cel in zijn geheel te traceren. Selecteer het tabblad Analyse opnieuw en klik vervolgens op Maat. De lengte moet ca.Oor in de eerder genoemde eenheden. </li></ol>

<ol><li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile infection in the United States.</a> N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).</li>
<li>Vickers, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ridinilazole%3A+a+novel+therapy+for+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection.</a> Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+update+on+emerging+antibiotic+treatment+options+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).</li>
<li>Ambrose, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+EMA+guideline+for+antimicrobial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">New EMA guideline for antimicrobial development.</a> Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).</li>
<li>Bassères, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+imaging+the+pharmacological+effects+of+antibiotic+treatment+on+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 40, 10-14 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Effects+of+Surotomycin+Treatment+on+Clostridium+difficile+Toxin+A+and+B+Production%2C+Immune+Response%2C+and+Morphological+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).</li>
<li>Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+potentially+pathogenic+Clostridium+difficile+contamination+in+household+environs%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs.</a> Anaerobe. 27, 31-33 (2014).</li>
<li>Aitken, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+Endemic+Setting%2C+Clostridium+difficile+Ribotype+027+Is+Virulent+But+Not+Hypervirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).</li>
<li>Basseres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapse+of+antibiotic+associated+colitis%3A+endogenous+persistence+of+Clostridium+difficile+during+vancomycin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy.</a> Gut. 24 (3), 206-212 (1983).</li>
<li>Chilton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+oritavancin+on+Clostridium+difficile+spore+germination%2C+outgrowth+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery.</a> J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).</li>
<li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+a+review+of+current+and+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li>
<li>McDonald, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidemic%2C+toxin+gene-variant+strain+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile.</a> New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).</li>
</ol>

KWG heeft in het verleden en momenteel onderzoeksondersteuning ontvangen van Merck & Co. en Summit, PLC.

Het doel van de huidige studie was het creëren van een high-throughput methode voor het isoleren van C. difficile en het testen van antibiotica gevoeligheid met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) als middel om een ​​meer grondige karakterisering van de farmacologische werking van het antibiotica. Met behulp van de hierin beschreven protocollen hebben we aangetoond dat beeldvorming van de fenotypische reactie van de cel op antibiotische behandeling inzicht kan geven in de farmacologische werking van...

Clostridium difficile is een gram positieve , spore-vormende bacterie, die jaarlijks ongeveer 500.000 infecties veroorzaakt in de VS en wordt beschouwd als een dringend ziekteverwekkend patiënt door de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), het hoogste risico. 1 Het afgelopen decennium heeft aanzienlijke drugontwikkeling in antimicrobiële stoffen met activiteit tegen C. difficile gezien . 2 , 3 In vitro studies zijn een noodzakelijk onderdeel van het geneesmiddelontwikkelingsproces. 4 Traditioneel worden in vitro gevoeligheids- en tijddodenstudies gebruikt om toekomstige dieren en andere in vivo studies te valideren. Hoewel deze methoden een belangrijke rol spelen bij het evalueren van doden, nemen ze de fenotypische reactie van de cellen niet op de farmacologische behandeling vast. Door scanning elektronenmicroscopie (SEM) op te nemen met standarD doden van kinetische studies, is een meer grondige karakterisering van de antibiotische directe effecten mogelijk. 5 , 6 , 7 Hier presenteren wij een methode waarbij SEM gebruikt wordt als middel om de werkzaamheid van antibioticabehandeling te profileren.

<table><tbody><tr><td>katoengaas&nbsp;</td><td>Caring</td><td>PRM21408C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron</td><td>7532</td><td></td></tr><tr><td>50 mL buisjes</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion (BHI)&nbsp;</td><td>Criterion</td><td>C5141</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteïne</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10389</td><td></td></tr><tr><td>gistextract</td><td>Criterion</td><td>C741</td><td></td></tr><tr><td>natriumtaurocholaat</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18346</td><td></td></tr><tr><td>anaerobe kamer</td><td>Coy</td><td></td><td>vinyl anaerobe kamer</td></tr><tr><td>cycloserinecefoxitine fructose agar (CCFA) platen</td><td>Anaerobe systems</td><td>AS-213</td><td></td></tr><tr><td>bloedagar platen</td><td>Hardy diagnostics</td><td>A-10</td><td></td></tr><tr><td>latex agglutinatiereagens</td><td>Oxoid</td><td>DR1107A</td><td>C. diff testkit</td></tr><tr><td>microcentrifugebuisjes</td><td>Eppendorf</td><td>222363204</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-259-98</td><td></td></tr><tr><td>microscoopglaasjes</td><td>J. Melvin freed brand</td><td>7525M</td><td>75 x 25mm</td></tr><tr><td>afzuigkap</td><td>Labconco</td><td>Class II type A2&nbsp;</td><td>bioveiligheidskast</td></tr><tr><td>bureausputterapparaat</td><td>Denton Vacuum</td><td>Desk II</td><td></td></tr><tr><td>tape</td><td>Plastic Core</td><td>05072-AB</td><td>SPI dubbelzijdig koolstoftape</td></tr><tr><td>goud</td><td>Denton Vacuum</td><td>TAR001-0158</td><td>2.375&rdquo; diameter x.002&rdquo; dikke goudfolie</td></tr><tr><td>scanning elektronenmicroscoop</td><td>FEI</td><td>XL-30</td><td></td></tr></tbody></table>

een protocol om de morfologische veranderingen van<em&gt; clostridium difficile</em&gt; in reactie op antibiotische behandeling

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Beoordeling van antibiotische werking met nieuwe geneesmiddelontwikkeling gericht op anaërobe bacteriën is moeilijk en technisch veeleisend. Om inzicht te krijgen in mogelijke MOA, kunnen morfologische veranderingen in verband met de blootstelling aan antibiotica worden gedetecteerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Het integreren van SEM imaging met traditionele kill curves kan ons inzicht in drugsactie verbeteren en het drugontwikkelingsproces bevorderen. Om dit uitgangspunt te testen werden dodenkrommen en SEM-studies uitgevoerd met behulp van geneesmiddelen met bekende maar verschillende MOA (vancomycine en metronidazool). C. difficiele cellen (R20291) werden tot 48 uur met of zonder aanwezigheid van antibiotica gegroeid. Gedurende het 48 uur interval werden cellen verzameld op meerdere tijdspunten om de doeltreffendheid van antibiotica te bepalen en voor beeldvorming op de SEM. In overeenstemming met eerdere verslagen had vancomycine en metronidazole significante bactericide activiteit na 24 uur behandeling zoals gemeten door kolonievormende eenheid (CFU) landenting. Met behulp van SEM beeldvorming bleken we dat metronidazol significante effecten op cellengte had (&gt; 50% reductie in cellengte voor elk antibioticum, P &lt;0,05) in vergelijking met controles en vancomycine. Hoewel de fenotypische respons op medicijnbehandeling niet eerder op deze wijze is gedocumenteerd, zijn ze consistent met de MOA van het geneesmiddel, die de veelzijdigheid en betrouwbaarheid van de beeldvorming en metingen en de toepassing van deze techniek voor andere experimentele verbindingen aantoont.

Clostridium difficile is een sporenvormende bacterie en daarom is het essentieel om de morfologische verschillen tussen vegetatieve en sporencellen voorafgaand aan elke functionele analyse te bepalen. Figuur 1 toont representatieve afbeeldingen van vegetatieve cellen die werden opgenomen tijdens de exponentiële fase van de groeicurve en de sporencellen. Zoals afgebeeld, zijn vegetatieve cellen lange, gladde, staafvormige structuren, terwijl sporen kleine, ovale ...

De werkzaamheid van antibiotica wordt meestal bepaald door het uitvoeren van dodingskinetische studies en het meten van kolonievormende eenheden (CFU's). Door rasterelektronenmicroscopie (SEM) te integreren met deze standaardmethoden, kunnen we de farmacologische effecten van behandeling tussen verschillende antibiotica onderscheiden.

Een protocol om de morfologische veranderingen van<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In reactie op Antibiotische Behandeling

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Het algemene doel van deze microbiologische beeldgevingsmethode is om een meer beschrijvende manier te bieden om de fenotypische effecten van farmacologische behandeling te onderscheiden. Daarom kan deze methode zeer nuttig zijn op het gebied van infectieziekten. Er wordt specifiek gekeken naar de morfologische effecten van bepaalde antibiotica en hoe deze C.Difficile doden.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het beelden met een hoge resolutie combineert met in vitro celkweektechnieken om een gedetailleerd inzicht te bieden in de farmaceutische dodende werking. De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar de therapie voor Clostridium difficile-infectie, kortweg CDI. De reden hiervoor is dat deze techniek een middel kan bieden om te identificeren hoe een antibioticum nuttig kan zijn bij de behandeling van CDI.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de farmacologische werking, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals gemengde cultuurmodellen of in vivo dierstudies. Over het algemeen hebben mensen moeite met deze nieuwe methode omdat het kweken van C.difficile en het bedienen van een scanning elektronenmicroscoop uitdagend is. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we probeerden onderscheid te maken tussen de werkingsmechanismen van verschillende antibiotica.Ik stel u graag het onderzoeksteam voor dat u vandaag zult ontmoeten. Jahangir Alam is professor en microbioloog. Hij coördineert alle laboratoriumactiviteiten die u vandaag zult zien.Tasnuva Rashid is een promovendus in het laboratorium. Zij voert een groot deel van de dagelijkse microbiologische werkzaamheden uit. Eugenie Bassere is een postdoctoraal onderzoeker.Zij heeft Tasnuva vele vaardigheden geleerd en helpt daarnaast mee in het lab. Brad Endres is een andere postdoc in het lab. Hij zal veel microscopie uitvoeren met hulp van Long Chang.Om milieu-isolaten voor te bereiden terwijl u steriele handschoenen draagt, gebruikt u een vooraf gesteriliseerd katoenen gaasje om het oppervlak van elk gebied van belang af te nemen, zoals een vloer, deur, klink of plank. Plaats het wattenstaafje vervolgens in een gesteriliseerd buisje. Wissel de handschoenen tussen de monsters.Om klinische isolaten voor te bereiden, gebruikt u een inoculatielus om 10 tot 100 milligram klinische ontlastingstestmonsters uit te platen op cefoxitin-cycloserine-fructose-agar, of CCFA, en incubeert u de monsters onder strikt anaerobe condities gedurende 48 tot 72 uur. Bewaar geïsoleerde kolonies van de C.Difficile-voorraad in cryovials bij -80 °C voor verdere analyses. Verrijk de monsters van omgevingsswabs in brain heart infusion, of BHI-bouillon, met 0,5% natriumtaurocholate en plaats de monsters in een anaerobe kamer bij 37 °C gedurende vijf dagen.Centrifugeer één milliliter van de cultuur bij 10 000 ×g en gebruik 100 µL ethanol om de pellet opnieuw te suspenderen. Plaats 50 µL van de resuspenderde cellen op CCFA-platen en incubeer de culturen in een anaerobe kamer bij 37 °C gedurende 40 tot 48 uur. Bewaar de geïsoleerde koloniën van de C.difficile-voorraad in cryovials bij -80 °C voor verdere analyses.Gebruik het latex-agglutinatiereagens of PCR om de vermoedelijke C.difficile-kolonies te testen. Kweek gezuiverde omgevings- of klinische C.difficile-stammen op bloedagarplaten in een anaerobe kamer bij 37 °C gedurende 48 uur. Gebruik een inoculatielus om één geïsoleerde kolonie te nemen en over te brengen naar 5 mL BHI-medium in een buis van 15 mL.Kweek de cultuur vervolgens in een anaerobe kamer bij 37 °C gedurende 24 uur. Gebruik vers, vooraf gereduceerd BHIS aangevuld met natriumtaurocholaat en de juiste concentratie antibioticum om de preculturen 1 op 100 te verdunnen tot ongeveer 10⁶ CFU per ml. Neem met een pipet bij elk tijdstip een monster van één ml en zaai een klein aliquot uit op een bloedagarplaat.Incubeer de plaat gedurende 48 uur in een anaerobe kamer bij 37 °C en tel het resulterende aantal koloniën om de CFU's te bepalen. Verzamel één milliliter cellen van elk tijdstip in microcentrifugebuisjes en centrifugeer deze bij 10.000 ×g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en was de cellen met PBS.Centrifugeer de monsters opnieuw en verwijder het supernatant. Gebruik vervolgens één milliliter 4%paraformaldehyde om de cellen opnieuw te verdunnen en incubeer de buisjes gedurende één uur bij kamertemperatuur. Nadat de monsters opnieuw zijn gecentrifugeerd en het supernatant is verwijderd, worden de cellen twee keer gewassen met gedestilleerd water voordat ze opnieuw worden verdund in 100 µL gedestilleerd water.Pas het volume aan afhankelijk van de troebelheid van de oplossing. Breng na het labelen van de dekglasjes 40 µL van het monster op deze aan. Incubeer de dekglasjes gedurende 15 minuten onder een laminaire flowkast om de vloeistof te laten verdampen en de cellen aan het glas te laten hechten.Als er nog vloeistof aanwezig is, gebruik dan een blaasblazer om deze te verwijderen. Plaats de dekglasjes in een sputterapparaat en plak ze vast. Bevestig puur goud in het sputterapparaat.Zet vervolgens het apparaat aan en begin met sputteren bij lage druk. Coat de cellen gedurende 30 seconden bij 80 microampères, wat overeenkomt met een goudlaag van 20 nanometers. Om te beginnen met de beeldvorming, moet de SEM eerst correct worden ontlucht via de computersoftware door op de Vent-knop te drukken.Nadat de cellen zijn gecoat, worden ze overgebracht naar de scanning elektronenmicroscoop (SEM). Bevestig de gecoate dekglasjes met koolstofband op de metalen tafel. Zodra de SEM is ontlucht, kan de deur gemakkelijk worden geopend.Zet de metalen objecttafel vast in de SEM-kamer door dezeten vast te schroeven. Klik vervolgens op de knop Pump in de software. Wanneer het systeem een bevestiging geeft, is de SEM klaar voor gebruik.Klik onder het tabblad Detector op de SE-detector. Zet de bundel aan door op de knop te klikken waarop de spanning wordt weergegeven. Start de beeldvorming bij een lagere spanning voordat u de spanning verhoogt.Er verschijnt een beeld nadat de bundel is ingeschakeld. Zoek met de trackingfunctie een gebied op de gecoate dekglasjes om te beelden. Zoom in op de regio en zoek naar staafvormige structuren, die Clostridium difficile representeren.Om het systeem te kalibren, zoomt u in, stelt u het beeld grof scherp en koppelt u Z aan de vrije werkafstand. Dit dient op meerdere werkafstanden te gebeuren, zoals bij 15, 9 en 5 millimeter. Schakel vervolgens over naar de beeldgevingsmodus met ultra-hoge resolutie.Gebruik de grove en fijne focusregelaars om bij een hoge vergroting scherp te stellen. Pas de astigmatismeregelaars aan voor een helderder beeld en controleer de scherpte door met de computersoftware digitaal in te zoomen op het beeld. Gebruik de langzame scan om een afbeelding van hoge kwaliteit te verkrijgen.Sla de verzamelde afbeelding op als een tiff-bestand voor latere analyse; zorg ervoor dat de databalk is geselecteerd als er tijdens de analyse metingen zullen worden verricht. Verzamel afbeeldingen onder verschillende hoeken om meer diepte-informatie onthuld te krijgen door de tafel van de SEM te kantelen. Optimaliseer de focus en het astigmatisme voordat u een afbeelding met een langzame scan verzamelt.Nadat de beeldvorming is voltooid, schakelt u de bundel uit en vergroot u de werkafstand naar 20 millimeter. Ventileer vervolgens de kamer en verwijder de objecttafel. Verwerk de beelden en open de beeldbestanden in Fiji.Gebruik de lijnfunctie om de schaalbalk nauwkeurig te omtrekken. Klik op het tabblad Analyze en kies vervolgens de functie Select Scale. Er verschijnt een venster waarin de bekende afstand op basis van de schaalbalk moet worden ingesteld.Wijzig ook de lengte-eenheid en klik op OK. Gebruik ten slotte de lijnfunctie om de cel in zijn geheel te omtrekken om de cellengte te meten. Selecteer opnieuw het tabblad Analyse en klik vervolgens op meten.De lengte moet worden weergegeven in de eerder aangegeven eenheden. Deze afbeeldingen tonen C.difficile vegetatieve cellen die zijn vastgelegd tijdens de exponentiële fase van de groeicurve, evenals sporecellen. Vegetatieve cellen zijn lange, gladde, staafvormige structuren; terwijl sporen kleine ovale structuren zijn met een ruw exterieur.Zoals in deze figuur wordt getoond, groeien de controlecellen en bereiken zij een plateau; daarentegen neemt het totaal aantal CFU's van de cellen die behandeld zijn met de antibiotica vancomycine en metronidazol af tot de detectielimiet, wat duidt op een bactericide effect. Zoals aangetoond zijn vancomycine en metronidazol effectief in het doden van C.difficile bij concentraties boven de MIC. Om het nut van SEM voor het beelden van C.difficile aan te tonen, werden cellen gefotografeerd vóór en na de behandeling met het geneesmiddel om vast te stellen hoe de morfologie veranderde.In het geval van vancomycine waren sommige celwanden aangetast en waren sommige met metronidazol behandelde cellen kleiner van formaat. Om te testen of de celgrootte beïnvloed was, werd de cellengte geanalyseerd met het programma Fiji. Zoals in deze afbeelding wordt aangetoond, kan de grootte van vegetatieve cellen in de controlecasus enigszins variëren; maar de meeste zijn ongeveer 6 micrometer lang.Zoals echter in deze grafiek te zien is, werd de cellengte beïnvloed in metronidazol-behandelde cellen, maar niet in vancomycine-behandelde cellen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in minder dan twee dagen worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat uw monster gefixeerd en volledig droog moet zijn vóór het coaten en afbeelden.Na deze procedure kunnen we aanvullende methoden uitvoeren om verdere vragen te beantwoorden, zoals de manier waarop bacteriën reageren op antibioticabehandelingen; dit kan ons bijvoorbeeld meer inzicht geven in het begrijpen van het werkingsmechanisme van antibiotica. Deze techniek heeft een enorm potentieel en kan de weg vrijmaken voor onderzoekers in het veld van de microbiologie om de fysiologie en farmacologie van Clostridium difficile verder te onderzoeken. Ik hoop dat u het kijken naar deze video vandaag heeft gewaardeerd.Ik hoop dat u uit deze procedure heeft geleerd hoe u C.difficile-cellen kunt kweken en karakteriseren, hoe u de dodoodeindynamiek van antibiotica tegen C.difficile kunt bestuderen en hoe u vervolgens de morfologische veranderingen die gepaard gaan met die dodoodeindynamiek kunt beoordelen met behulp van geavanceerde microscopie. Aangezien we werken met Clostridium difficile, moeten we extra voorzorgsmaatregelen nemen en alle beschermende

a-protocol-to-characterize-morphological-changes-clostridium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Winston, J. A. et al. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the quantification of Clostridium difficile in fecal samples from an infected mouse model using selective culture techniques. It outlines the procedures for sample collection, anaerobic processing, serial dilution, and colony enumeration to assess bacterial colonization and host-pathogen interactions.

Quantification of Clostridium difficile in Fecal Samples from an Infected Mouse Model

This video demonstrates an assay to measure the accumulation of a fluorescent antibiotic probe in bacterial cells. Exposure to an efflux pump inhibitor disrupts the transmembrane proton gradient in bacterial cells, upon which a fluorophore-conjugated antibiotic is added. Inhibition of efflux pumps due to the disrupted proton gradient causes accumulation of the antibiotic inside the bacteria. Bacterial cells are lysed, and the fluorescence intensity is measured to confirm antibiotic accumulation.

An Assay to Measure the Accumulation of a Fluorescent Antibiotic Probe in Bacterial Cells

Clostridium difficile is een pathogene bacterie die een strikt anaerobe en veroorzaakt antibiotica geassocieerde diarree (AAD). Hier, werkwijzen voor het isoleren, kweken en onderhouden C. difficile vegetatieve cellen en sporen worden beschreven. Deze technieken vereisen een anaërobe kamer, die regelmatig onderhoud nodig heeft om te zorgen voor een goede voorwaarden voor een optimale C. difficile teelt.

Het kweken en onderhouden<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In een anaëroob milieu

Dit protocol beschrijft de cefoperazon muismodel van Clostridium difficile infectie (CDI) met een klinisch relevante en genetisch handelbaar stam, R20291. Nadruk op klinische ziekte monitoring, C. difficile bacteriële opsomming, toxine cytotoxiciteit en histopathologische veranderingen in heel CDI in een muismodel worden beschreven in het protocol.

-Cefoperazone behandelde muismodel van klinisch relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Strain R20291

Dit artikel bevat een beschrijving van een eenvoudige eiwit microarray methode voor profilering humorale immuunreacties aan een 7-plex panel van sterk gezuiverd Clostridium difficile antigenen in menselijke sera. Het protocol kan worden uitgebreid voor de bepaling van specifieke antilichaam reacties in preparaten van polyklonale intraveneuze immunoglobuline.

Een eiwit Microarray Assay voor serologische bepaling van antigeen-specifieke antilichaam reacties volgende Clostridium difficile -infectie

Fluorescerende gelabelde antibiotica zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om meerdere aspecten van antimicrobiële resistentie te bestuderen. Dit artikel beschrijft de voorbereiding van fluorescerende gelabelde antibiotica en hun toepassing op het bestuderen van antibioticaresistentie bij bacteriën. Sondes kunnen worden gebruikt om mechanismen van bacteriële resistentie (bijvoorbeeld efflux) te bestuderen door spectrofotometrie, stroomcytometrie en microscopie.

Visualisatie van bacteriële resistentie met behulp van fluorescerende antibiotica sondes

Hier presenteren we een protocol om het door antibiotica geïnduceerde pseudo-kiemvrije dextraansulfaat-natrium-geïnduceerde colitis-muismodel op te stellen om de rol van darmmicrobiota bij het reguleren van de positieve effecten van Bacillus cereus op colitis te onderzoeken.

Onderzoek naar de verlichtende effecten van toediening van Bacillus cereus op colitis door middel van darmmicrobiotamodulatie

Antibioticapersistentie beschrijft het vermogen van kleine subpopulaties binnen een gevoelige isogene populatie om tijdelijk hoge doses bacteriedodende antibiotica te verdragen. Het huidige protocol combineert benaderingen om het fenotype van antibioticapersistentie op moleculair en cellulair niveau te karakteriseren na blootstelling van Escherichia coli aan dodelijke doses ofloxacine.

Populatie- en eencellige analyse van antibioticapersistentie in Escherichia coli

De huidige diagnostische antimicrobiële gevoeligheid testen is gebaseerd op de groei van plankton isolaten in voedselrijk, aërobe omstandigheden. Hier maken we gebruik van een alternatieve kunstmatige sputum medium om antimicrobiële gevoeligheid van Pseudomonas aeruginosa biofilms te bestuderen onder zowel aërobe en Microaërofiele voorwaarden meer representatief zijn voor de cystic fibrosis long.

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Leer een microbiologische beeldvormingsmethode voor het bestuderen van morfologische veranderingen in Clostridium difficile na antibiotische behandeling met behulp van rasterelektronenmicroscopie. Deze techniek combineert hoge-resolutie imaging met in vitro celkultuur.

Een protocol om de morfologische veranderingen van

Meer video's verkennen