Een protocol om de morfologische veranderingen van Clostridium difficile In reactie op Antibiotische Behandeling

Het algemene doel van deze microbiologische beeldvormingsmethode is om een beschrijvend middel te bieden om de fenotypische effecten van farmacologische behandeling te onderscheiden. Dus deze methode kan echt helpen op het gebied van infectieziekten. Specifiek kijkend naar de morfologische effecten van bepaalde antibiotica en hoe het C.Difficile doodt.

Het grote voordeel van deze techniek is dat het hoge resolutie beeldvorming combineert met in vitro celkweektechnieken om een gedetailleerd overzicht te geven van de dodende werking van geneesmiddelen. De implicatie van deze techniek kan zich uitstrekken naar therapie voor Clostridium difficile-infectie, of kortweg CDI. De reden is dat deze techniek een middel kan bieden voor het identificeren hoe een antibioticum gunstig kan zijn bij de behandeling van CDI.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in farmacologische werking, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals een model met gemengde kweek of in vivo dierstudies. Over het algemeen worstelen mensen met deze nieuwe methode omdat het kweken van C.difficile en het bedienen van een rasterelektronenmicroscoop een uitdaging is. We hadden het idee voor deze methode voor het eerst toen we probeerden verschillende werkingsmechanismen van antibiotica te onderscheiden.

Ik wil je graag voorstellen aan het onderzoeksteam dat je vandaag zult ontmoeten. Jahangir Alam is een professor en microbioloog. Hij coördineert alle labactiviteiten die je vandaag zult zien.

Tasnuva Rashid is een afgestudeerde student in het lab. Ze doet veel van de dagelijkse microbiologie. Eugenie Bassere is een postdoc-fellow.

Ze heeft Tasnuva echt veel van de vaardigheden geleerd en assisteert ook in het lab. Brad Endres is een andere postdoc in het lab. Hij zal veel microscopie doen met de hulp van Long Chang.

Om omgevingsisolaties voor te bereiden terwijl je steriele handschoenen draagt, gebruik je een voorgesteriliseerde katoenen gaas om het oppervlak van elk gebied van belang te vegen, zoals een vloer, deur, handvat of plank. Plaats vervolgens de doek in een gesteriliseerde buis. Verwissel handschoenen tussen monsters.

Om klinische isolaten voor te bereiden, gebruik je een inoculatieslinger om 10 tot 100 milligram klinische ontlastingsmonsters te plateren op cefoxitine cycloserine fructose agar, of CCFA, en intubeer de monsters onder strikte anaërobe omstandigheden gedurende 48 tot 72 uur. Bewaar geïsoleerde kolonies van de C.Difficile-voorraad in cryo-buisjes bij negatief 80 graden Celsius voor verdere analyses. Verrijk de omgevingsveegmonsters in hart-herseninfusie of BHI-bouillon met 05% natriumtaurocholaat en plaats de monsters in een anaërobe kamer bij 37 graden Celsius gedurende vijf dagen.

Centrifugeer een milliliter van de cultuur bij 10.000 keer G en gebruik 100 microliter ethanol om het pellet opnieuw op te schorten. Plateer 50 microliter van de opnieuw opgeschorte cellen op CCFA-platen en incubeer de culturen in een anaërobe kamer bij 37 graden Celsius gedurende 40 tot 48 uur. Bewaar de geïsoleerde kolonies van C.difficile-voorraad in cryo-buisjes bij negatief 80 graden Celsius voor verdere analyses.

Gebruik de latex-agglutinatie reagent, of PCR, om de vermoedelijke C.difficile-kolonies te testen. Laat gezuiverde omgevings- of klinische C.difficile-stammen groeien op bloedagarplaten in een anaërobe kamer bij 37 graden Celsius gedurende 48 uur. Gebruik een inoculatieslinger om een geïsoleerde kolonie te nemen en deze over te brengen in vijf milliliter BHI-medium in een 15 milliliter buis.

Laat vervolgens de cultuur groeien in een anaërobe kamer bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Gebruik vers, voorgereduceerd BHIS aangevuld met natriumtaurocholaat en de juiste concentratie antibioticum om de pre-cultures 1 tot 100 te verdunnen tot ongeveer 10 tot de zesde CFU per milliliter. Verzamel met een pipetten een monster van een milliliter op elk tijdstip en plateer of verspreid een kleine aliquot op een bloedagarplaat.

Incubeer de plaat gedurende 48 uur in een anaërobe kamer bij 37 graden Celsius en tel het resulterende aantal kolonies om de CFU's te bepalen. Verzamel één milliliter cellen van elk tijdstip in microcentrifugebuisjes en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 10.000 keer G. Gooi het supernatant weg en was de cellen met PBS.

Slinger de monsters opnieuw en gooi het supernatant weg. Gebruik vervolgens een milliliter 4% paraformaldehyde om de cellen opnieuw te verdunnen en incubeer de buisjes een uur op kamertemperatuur. Nadat de monsters opnieuw zijn geslingerd en het supernatant is weggegooid, was de cellen twee keer met gedistilleerd water voordat ze opnieuw worden verdund in 100 microliter gedistilleerd water.

Pas het volume aan afhankelijk van de troebelheid van de oplossing. Na het labelen van dekglasjes, voeg je 40 microliter van het monster toe. Onder een flowhood, incubeer de dekglasjes gedurende 15 minuten om de vloeistof te laten verdampen en de cellen aan het glas te laten hechten.

Als er nog vloeistof aanwezig is, gebruik dan een blazer om deze te verwijderen. Plaats de dekglasjes in een bureausputteringsmachine en plak ze vast. Plaats puur goud in de sputtermachine.

Schakel vervolgens de machine in en begin met sputteren bij lage druk. Coat de cellen gedurende 30 seconden bij 80 microampere, wat overeenkomt met 20 nanometer goudcoating. Om met het beeldvormen te beginnen, ventileer je eerst de SEM correct in de computersoftware door op de knop Venten te drukken.

Na het coaten van de cellen, breng je ze over naar de rasterelektronenmicroscoop of SEM. Bevestig de gecoate dekglasjes met behulp van de koolstoftape op het metalen podium. Zodra de SEM is geventileerd, zou de deur gemakkelijk open moeten gaan.

Vergrendel het metalen podium in de SEM-kamer door het vast te schroeven. Klik vervolgens op de knop Pomp in de software. Wanneer het systeem okay terug leest, is de SEM klaar voor gebruik.

Klik onder het tabblad Detector op de SE-detector. Schakel de straal in door op de knop te klikken die het voltage weergeeft.