Name: Expressie van exogeen cytokine in patiënt afgeleide Xenografts via injectie met een cytokine-getransduceerde stromcellijn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Leer hoe je exogene cytokines produceert in patiënt-afgeleide xenograftmuizen via wekelijkse injecties met een cytokine-getransduceerde stromacellijn.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, een Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant, het Department of Pathology and Human Anatomy, het Department of Basic Sciences, en het Center for Health Disparities and Molecular Medicine aan de Loma Linda University School of Medicine en door een Grant ter Bevordering van Collaboratief en Translationeel Onderzoek van Loma Linda University (KJP). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de NIH.

<ol><li>Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+patient-derived+xenograft+models+for+precision+medicine+approaches+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Med%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia.</a> J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).</li>
<li>Parrish, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+Dependence+in+human+B+lymphopoiesis+increases+during+progression+of+ontogeny+from+cord+blood+to+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow.</a> J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).</li>
<li>Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+and+human+IL-7+activate+STAT5+and+induce+proliferation+of+normal+human+pro-B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells.</a> J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).</li>
<li>Milford, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/304249946_TSLP_or_IL-7_provide_an_IL-7R_signal_that_is_critical_for_human_B_lymphopoiesis?ev=prf_high">TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis.</a> Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).</li>
<li>Reche, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+thymic+stromal+lymphopoietin+preferentially+stimulates+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells.</a> J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).</li>
<li>Francis, O. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+xenograft+model+to+study+the+role+of+TSLP-induced+CRLF2+signals+in+normal+and+malignant+human+B+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis.</a> Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).</li>
<li>Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+human+hemato-lymphoid-system+mice+by+cytokine+knock-in+gene+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement.</a> Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).</li>
<li>Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+the+functionally+distinct+human+bone+marrow+stromal+cell+lines+HS-5+and+HS-27a%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a.</a> Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).</li>
<li>Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+by+lentiviral+vectors+is+limited+by+nuclear+translocation+and+rescued+by+HIV-1+pol+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences.</a> Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Cockrell, A. S., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+by+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery by lentivirus vectors.</a> Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freezing%2C+thawing%2C+and+packaging+cells+for+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Freezing, thawing, and packaging cells for transport.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5061">http://www.jove.com/science-education/5061</a> (2016).</li>
<li>Tasian, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+STAT5+and+PI3K%2FmTOR+pathway+signaling+occurs+in+human+CRLF2-rearranged+B-precursor+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 120 (4), 833-842 (2012).</li>
<li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5048">http://www.jove.com/science-education/5048</a> (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5161">http://www.jove.com/science-education/5161</a> (2016).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Kovacsics, D., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+proteins+by+hydrodynamic+gene+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3023233/">Chapter 15, Creation of &#34;humanized&#34; mice to study human immunity.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bone+marrow+derived+murine+dendritic+cells+for+use+in+2-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Scheeren, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+stromal+lymphopoietin+induces+early+human+B-cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation.</a> Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).</li>
<li>Lee, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+serum+thymic+stromal+lymphopoietin+in+children+with+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis.</a> Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige, snelle en relatief kosteneffectieve methode voor het ontwerpen van PDX om exogeen humaan cytokine uit te drukken. De hier beschreven strategie is gebaseerd op wekelijkse intraperitoneale injecties van een stromale cellijn die getransducteerd wordt om de menselijke cytokine, TSLP uit te drukken. Voordat de hier beschreven methoden werden uitgevoerd, werden stroma ontwikkeld om hoge niveaus van het cytokine van belang (TSLP) en soortgelijk gecontroleerde controle stroma uit te dru...

Patiëntgerelateerde xenografen (PDX) zijn een krachtig in vivo model voor het bestuderen van de productie van normale en kwaadaardige hematopoietische cellen in een &#39;native&#39; zoogdieromgeving. Meestal worden PDX geproduceerd door injectie of transplantatie van menselijke cellen in immuun deficiënte muizen. De productie van PDX met behulp van normale humane hematopoietische stamcellen maakt in vivo studies mogelijk van normaal menselijk bloed en immuuncelontwikkeling. PDX geproduceerd uit leukemie of andere kankercellen maakt het mogelijk om oncogene mechanismen te bestuderen en effectieve therapieën te identificeren in het kader van het bereik van genetische landschappen en mutaties die aanwezig zijn in de menselijke populatie. 1 PDX is daarom de huidige gouden standaard voor translatie biomedisch onderzoek om effectieve therapieën te identificeren en een belangrijk instrument om mechanismen van kankerprogressie te begrijpen. PDX-modellen zijn een essentieel instrument om onderzoek naar gezondheidsverschillen in ziekten te voorkomen door specifieke<html> Genetische letsels of een ziekte waarin de variaties van het genetische landschap van een patiënt aanzienlijk kunnen bijdragen tot oncogenese en behandelingsuitkomst. Muis-menselijke PDX-modellen zijn mogelijk omdat veel muiscytokines hun menselijke analogen adequaat nabootsen bij het activeren van de cytokine-receptoren van menselijke cellen terwijl zij in de muis zijn. Interleukine-7 (IL-7) geeft bijvoorbeeld een kritisch signaal voor humane B-celontwikkeling. 2 In dit geval heeft muis IL-7 voldoende homologie met menselijke IL-7 dat het muse cytokine signaalwegen in humane B-celprecursoren stimuleert. 2 , 3 , 4 Dit is echter niet het geval voor thymische stromale lymfopoietine (TSLP), 5 , 6 die onder andere cytokinen (IL-3, granulocyt-macrofage kolonie stimulerende factor (GM-CSF), stamcelfactor (SCF) ,Ref &quot;&gt; 7 is belangrijk voor de productie van normale en kwaadaardige humane hematopoietische cellen. Wanneer muizen en menselijke cytokinen een lage homologie hebben, laten de muse cytokines hun respectieve receptoren niet op menselijke cellen activeren. Om dit obstakel te overwinnen is een aantal strategieën gebruikt Om expressie van humane cytokinen in PDX-muizen te manipuleren. Deze omvatten injectie van recombinante humane cytokinen, hydrodynamische injectie van DNA, lentivirale expressie, transgene expressie en knockin-genvervanging. 7 Dit rapport beschrijft een methode voor het manipuleren van PDX om menselijk cytokine te produceren via stromale Cytokine-afgifte ( Figuur 1 ). In de hier getoonde werkwijze worden PDX-muizen ontworpen om het menselijke cytokine, TSLP uit te drukken of om te dienen als cytokine-negatieve controles. TSLP-expressie PDX worden bereikt door wekelijkse intraperitoneale injecties van stromale cellen die zijn getransduceerd om hoge niveaus van menselijke TSLP uit te drukken.Cytokine-negatieve PDX &quot;control&quot; muizen zijn op dezelfde manier ontworpen; Hoewel controle stroma worden getransduceerd met een controle vector. Deze methode behaalt normale fysiologische niveaus van menselijk TSLP in PDX-muizen die geïnjecteerd worden met de TSLP + stroma. Geen detecteerbare TSLP wordt waargenomen in PDX-muizen die de cytokine-negatieve stroma ontvangen. We hebben de menselijke stromal cellijn HS-27A geselecteerd voor onze studies omdat het robuust groeit in de cultuur en een zeer lage cytokineproductie toont die geen proliferatie van geïsoleerde stamcellen in coculturen ondersteunt. 8 Voor menselijke TSLP expressie werden stroma getransducteerd met een geavanceerde generatie zelfinactiverende lentivirale vector afgeleid van een eerder beschreven ruggengraat 9 en omvat het cPPT / cts-element en het post-transcriptie-regulatorisch element van de woodchuck hepatitis (WPRE) om transgene expressie te verhogen. Het menselijke TSLP-gen werd geconstrueerd in deze vector onder de controle van de verlengingsfactor-1(EF-1) alpha promotor om robuuste, constitutieve en lange termijn expressie te bereiken. De techniek van dit human-cytokine versterkte PDX-model bestaat uit 4 hoofdstappen. Ten eerste worden getransformeerde stroma in vitro uitgebreid en beoordeeld door enzym-gekoppelde immunosorbentassay (ELISA) voor stabiele cytokineproductie op hoog niveau. Ten tweede wordt de activiteit van humaan cytokine geproduceerd door de getransduceerde stromacellen (en het ontbreken van cytokine-activiteit van controle stroma) geverifieerd met behulp van fosfostroomcytometrie. Cellijnen die bekend zijn om te reageren op cytokine van belang (in dit geval, TSLP) worden geïncubeerd met stromale cel supernatant en geanalyseerd voor cytokine geïnduceerde fosforylering. Ten derde worden muizen geïnjecteerd met getransduceerde humane stroma en dan wordt muisplasma per week beoordeeld door ELISA voor niveaus van menselijk cytokine. Vierde humane hematopoietische cellen worden getransplanteerd en de in vivo functionele effecten van het humane cytokine worden geëvalueerd op een bekend doel ( <em&gt; Bijv. Celpopulatie). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> Figuur 1: PDX Model dat is ontworpen om exogene humane cytokine in muizen te produceren. ( 1A ) Ontwerp experiment en getransduceerde humane stromale cellen ( 1B ) verkrijgen. Verkrijg menselijke cellen (hematopoietische stamcellen, leukemacellen, enz .) Om PDX (patiënten afgeleide xenograft) muizen te genereren. ( 2A ) Injecteerde gemanipuleerde stroma en ( 2B ) transplantatie menselijke cellen in immuun deficiënte muizen volgens experimentele schema. ( 3A-B ) Monitor cytokine concentraties in het stroma supernatant en het muis plasma door ELISA. ( 4 ) Menselijke cellen van de oogst en analyseer de in vivo functionele effecten van het aanwezige humaan cytokine in de PDX. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier alsjeblieft</a>Om een ​​grotere versie van deze figuur te zien. Levering van menselijk cytokine via stromacellen biedt zowel voor- en nadelen als vergeleken met andere methoden voor het leveren / produceren van humane cytokinen in PDX-muizen. 7 In vergelijking met injectie van recombinant humaan cytokine is stroma-gemedieerde afgifte over het algemeen minder duur (de kosten van stromale celcultuur zijn minder dan de kosten van recombinant cytokine) en minder arbeidsintensief (één injectie per week versus meerdere injecties per week). De kwestie van korte halveringstijd van de cytokine wordt ook verminderd, aangezien stroma voortdurend de exogene cytokine produceert. Levering van cytokine via hydrodynamische injectie van DNA kan minder duur zijn dan afgifte via stroma. Het is evenwel ook voorbijgaande en kan meer technische vaardigheden vereisen dan de simpele wekelijkse intraperitoneale injectie die nodig is voor stroma-gemedieerde afgifte. Lentivirale genuitdrukking in de muis kan een minder traNsient methode van de levering van cytokine; In onze handen werden echter fysiologische TSLP niveaus niet bereikt. Bovendien is deze methode arbeidsintensief, waarbij de voortdurende productie van lentivirale vector vereist is. Transgene of knock-in muizen bieden stabiele langetermijnuitdrukking van cytokine en kunnen worden ontwikkeld voor weefselspecifieke expressie, die een voordeel kan zijn. Anderzijds vereist de transgene expressie van het humane cytokinegen op de immuun-deficiënte muisachtergrond die nodig is voor PDX-muizen een enorme investering van middelen voordat de waarde van het model is vastgesteld. Bovendien kunnen transgene modellen in het algemeen niet de mogelijkheid bieden om de timing van cytokine-initiatie of niveau van in vivo cytokineproductie te variëren. Deze kunnen worden bereikt met stroma-gemedieerde afgifte door gewoon het tijdstip te wijzigen voor het initiëren van stromale celinjectie of de dosis stromale cellen die geïnjecteerd zijn. De stromale cel gemedieerde cytokine afgifte methOD gedetailleerde hier werd gebruikt om PDX te ontwikkelen voor het evalueren van de rol van TSLP bij normale humane B-celontwikkeling 4 , 6 en B-cel acute lymfoblastische leukemie met hoge risico&#39;s. 6 Deze methode verschaft een alternatieve cytokine-leveringsmethode voor gebruik bij het opwekken van vergelijkbare modellen met andere cytokinen dan TSLP. Dit model kan ook nuttig zijn voor het genereren van voorlopige gegevens die kunnen helpen bepalen of de waarde van een cytokine transgene of cytokine inklapbare PDX-model de aanzienlijke tijd en geld investering zou waard zijn.

<table><tbody><tr><td>Wet lab reagents&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity,&nbsp; 25cm&sup2; culture area</td><td>Thermo Scientific / Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm&sup2; culture area &amp; vented cap</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm&sup2; culture area &amp; vented cap</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische pipetten</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&nbsp; polypropyleen conische buisjes</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ronde bodem polystyreenbuisjes</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL polypropyleen conische buisjes</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL cryogene flesjes, extern gesneden</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>4230659</td><td></td></tr><tr><td>1 mL pipettips</td><td>Fisher</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L pipettips&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;L pipettips</td><td>Denville Scientific</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>Steriele wegwerpfiltereenheden met SFCA-membraan, Nalgene Rapid-Flow</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH2SO4&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium, 1&times;</td><td>Corning cellgro/ Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human TSLP ELISA Max Deluxe Set</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>3% azijnzuur met methyleenblauw</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr><tr><td>"Trypsine" 1x 0,25% Trypsine 2,21 mM EDTA in HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td>&ldquo;R10&rdquo; cellenkweekmedium, % van totaal volume (maakt 565 mL)</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Recept</td></tr><tr><td>RPMI, 88,5% (500 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>10-040-CV&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 9,9% (56 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, 0,99% (5,6 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine, 0,50% (2,8 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, 0,10% (560 &micro;L)&nbsp;</td><td>MP</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td>&ldquo;R20&rdquo; cellenkweekmedium, % van totaal volume (maakt 195 mL)</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Recept</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; RPMI, 76,84% (150&nbsp; mL)</td><td>zie boven</td><td>zie boven</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; FBS, 20,49% (40 mL)</td><td>zie boven</td><td>zie boven</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 2mM L-glutamine, 1,02% (2 mL)</td><td>zie boven</td><td>zie boven</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1 mM Na pyruvate, 1,02% (2 mL )</td><td>zie boven</td><td>zie boven</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Penicilline-Streptomycine,&nbsp; 0,51% (1 mL)</td><td>zie boven</td><td>zie boven</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 2-Mercaptoethanol, 0,10% (0,1 M),&nbsp; 0,10% (200 &micro;L)</td><td>zie boven</td><td>zie boven</td><td></td></tr><tr><td>&ldquo;Bevriezingsmedium&rdquo;, % van totaal volume</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Recept</td></tr><tr><td>&ldquo;R10&rdquo; medium, 45%</td><td>zie "R10" recept</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 20%</td><td>zie boven</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 10%</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D(-)(+)-Trehalose dihydraat, 5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catolog Nummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Biologische producten&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>"HS-27" HS-27A menselijke stroma lijn</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr><tr><td>"CALL-4" MHH-CALL-4 cellijn, menselijke B-cel precursor leukemie</td><td>DSMZ</td><td>ACC 337</td><td></td></tr><tr><td>&ldquo;NSG muizen&rdquo; NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, mannelijk of vrouwelijk, leeftijd 6 &ndash; 8 weken</td><td>JAX Muizen&nbsp;</td><td># 005557</td><td></td></tr><tr><td>MUTZ-5 cellijn, menselijke B-cel precursor leukemie</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TSLP-eiwit</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catolog Nummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Flow cytometry antilichamen (kloning)*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis CD45 FITC (30F11)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD

expressie van exogeen cytokine in patiënt afgeleide xenografts via injectie met een cytokine-getransduceerde stromcellijn

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Patiëntgerelateerde xenograftmuizen (PDX) worden geproduceerd door transplantatie van menselijke cellen in immuun deficiënte muizen. Deze modellen zijn een belangrijk instrument voor het bestuderen van de mechanismen van normale en kwaadaardige hematopoiesis en zijn de gouden standaard voor het identificeren van effectieve chemotherapieën voor veel kwaadaardigheden. PDX-modellen zijn mogelijk omdat veel van de cytokines van de muis ook op menselijke cellen optreden. Dit geldt echter niet voor alle cytokinen, waaronder veel die kritiek zijn voor het bestuderen van normale en kwaadaardige hematopoiesis in menselijke cellen. Technieken die muizen ontwerpen om menselijke cytokinen te produceren (transgene en inklapmodellen) vereisen aanzienlijke kosten voordat het nut van het model is aangetoond. Andere technieken zijn arbeidsintensief (injectie van recombinant cytokine of lentivirus) en vereisen in sommige gevallen een hoog niveau van technische expertise (hydrodynamische injectie van DNA). Dit rapport beschrijft een eenvoudige methode voor het genereren van PDX-muizen die exogene humane cy hebbenTokine (TSLP, thymische stromale lymfopoietine) via de wekelijkse intraperitoneale injectie van stroma die zijn getransduceerd om deze cytokine te overexpressie. Gebruik van deze methode verschaft een in vivo bron van continue cytokine productie die fysiologische niveaus van circulerend humaan cytokine in de muis bereikt. Plasmaniveaus van menselijk cytokine kunnen worden gevarieerd op basis van het aantal geïnjecteerde stromalcellen, en de productie van cytokine kan op elk moment in het experiment worden geïnitieerd. Deze methode omvat ook cytokine-negatieve controlemuizen die op dezelfde wijze worden geproduceerd, maar door intraperitoneale injectie van stroma getransduceerd met een controle vector. We hebben eerder aangetoond dat leukemacellen die zijn geoogst uit TSLP-expressie PDX, in vergelijking met controle PDX een genuitdrukkingspatroon meer tonen dan het oorspronkelijke patiëntmonster. Samen vormen de cytokine-producerende en cytokine-negatieve PDX-muizen die door deze methode worden geproduceerd, een model systeem dat we succesvol hebben gebruikt om de studie te bestuderenRol van TSLP bij normale en kwaadaardige hematopoiesis.

Een overzicht van het model is weergegeven in figuur 1 . Zodra cytokine-producerende (TSLP + stroma) en controle stroma zijn verkregen, worden ze uitgebreid in cultuur. Vóór stroma injectie in muizen wordt stromale cel supernatant beoordeeld door ELISA om cytokine productie te verifiëren ( Figuur 2 ) en fosfo-flow cytometrie (Protocol # 3) wordt gebruikt om de activiteit van de door de stroma geproduceerde cytokine te verifiëren. Supernatant wordt verzam...

Hier beschreven is een werkwijze voor het produceren van exogeen cytokine in patiënten afgeleide xenograftmuizen via wekelijkse intraperitoneale injectie van een cytokine-getransduceerde stromale cellijn. Deze methode verruimt het nut van PDX en biedt de mogelijkheid voor transiënte of langdurige exogene cytokine-afgifte in een groot aantal PDX-modellen.

Expressie van exogeen cytokine in patiënt afgeleide Xenografts via injectie met een cytokine-getransduceerde stromcellijn

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van xenograft-muizen met circulerende humane cytokinen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van kanker en hematopoëse, zoals: Wat is de rol van een specifiek cytokine bij de normale en maligne lymfocytontwikkeling? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat onderzoekers de circulerende concentraties van exogene cytokinen in hun xenograft-dieren kunnen aanpassen aan de behoeften van hun experiment.Dit elimineert de noodzaak om nieuwe en kostbare transgene muizenlijnen te produceren. Deze techniek zal nuttig zijn voor het onderzoek naar nieuwe kankertherapieën, omdat dit preklinische model kan worden gebruikt om antikankermedicijnen te testen, vergelijkbaar met wat in de kliniek wordt gebruikt. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in normale hematopoëse, kan deze ook worden gebruikt om specifieke ziekten zoals leukemie te bestuderen.Ik heb dit idee voor het eerst ontwikkeld toen we een in vivo-model nodig hadden om de rol van het TSLP-cytokine bij de normale en maligne productie van menselijke B-cellen te evalueren. Begin met het uitplaten van vers ontdooide, met een lege controlevector getransduceerde stroma in cytokine-producerende cellen in vijf milliliter R-10 medium in individuele T25-flasks. Kweek deze gedurende 24 tot 48 uur bij 37 °C in vijf procent CO2.Wanneer het stroma confluent is, worden de cellen losgemaakt met Trypsan in EDTA voor heruitplating in T150-kweekflessen voor drie tot vier dagen. Zodra het stroma confluentie bereikt in de T150-flessen, worden de supernatanten verzameld en bevroren bij 80 °C voor latere evaluatie van de cytokineproductie via ELISA. Vervolgens wordt elke T150-fleskweek overgeplaatst naar drie nieuwe T150-flessen voor verdere kweek tot aan confluentie.Om de cellen na het juiste aantal passagen te bewaren, brengt u de geoogste cel-suspensies over naar een conische buis voor centrifugatie en resuspendeert u de pellets in een vriesmedium. Breng vervolgens aliquots van 1,5E6 cellen over naar buisjes voor langetermijnbewaring voor opslag in vloeibare stikstof. Om het supernatant dat geproduceerd is door gemanipuleerd stroma te valideren, ontdooit u de supernatantmonsters die geoogst zijn van de controle in cytokine-expresserend stroma, en plaatst u drie wells van leukemie-cellijnen per conditie in Au-20 medium met een concentratie van 2E5 cellen per well in een 96-wells weefselkweekplaat.Incubeer de cellen gedurende twee uur bij 37 °C om de fosforylering uit de vorige kweek te laten verdwijnen. Breng de cellen vervolgens vanuit elke put over naar individuele buisjes van 4 mL en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Resuspendeer de pellets in 600 µL per experimentele conditie.Plateer 200 microliters cellen per putje voor elke conditie in triplikaat. Incubeer de cellen gedurende de juiste periode volgens de specifieke commerciële phosphoassay. Pelletteer de cellen aan het einde van de incubatie door middel van centrifugatie.Label de cellen via phospho-flowcytometrie-kleuring volgens het protocol van de fabrikant. Analyseer de cellen vervolgens met flowcytometrie aan de hand van standaard flowcytometrische analyseprotocollen om te verifiëren dat cytokinen in het supernatant van het stroma de leukemiecellen fosforyleren. Na minimaal drie passages na het ontdooien worden de geoogste stromale celsuspensies overgebracht naar individuele conische buizen voor het tellen.Pellet de cellen door centrifugatie en resuspendeer ze voorzichtig in de juiste volumes steriele PBS voor injectie. Bewaar de cellen bij vier graden Celsius tot vlak voor de injectie, waarna de suspensie moet worden opgewarmd tot ten minste kamertemperatuur. Wanneer de cellen gereed zijn, meng dan het eerste monster voorzichtig door inversie en trek 200 microliters van de cellen op in een tuberculinespuit.Fixeer vervolgens het eerste dier en injecteer de cellen in de peritoneale holte met behulp van standaardtechnieken voor intraperitoneale injectie. Om een perifeer bloedmonster af te nemen, plaatst u de muis eerst voorzichtig in een gedesinfecteerde fixatiehouder voor kleine dieren en zet u de buis vast om de bewegingen van het dier te minimaliseren. Schrob daarna de staart met verse isopropylalcohol, gevolgd door het aanbrengen van een lokale anesthetische crème.Knip met zeer scherpe chirurgische scharen ongeveer 5 tot 1 millimeter van de staartpunt af en verzamel ongeveer 80 µL perifeer bloed in gehepariniseerde capillaire buisjes. Gebruik een injectieballetje om de bloedmonsters over te brengen naar gelabelde potassium EDTA microtainer-buisjes en keer het buisje 20 keer om om stolling te voorkomen. Na het centrifugeren van de bloedafnamebuisjes volgens de instructies van de fabrikant, verzamelt u voorzichtig de plasmalaag en bewaart u de aliquots bij -20 °C, nadat het plasma is geportioneerd voor bewaring bij -20 °C.Ontdooi op de dag van de ELISA de bevroren muizenplasmaproeven en verdun de ELISA-standaard serieel tot volumes van 120 µL. Pipetteer vervolgens 40 µL van elke standaard in triplo in de betreffende putjes van de ELISA-plaat, gevolgd door de toevoeging van 40 µL van elk muizenplasmaproef in de betreffende putjes. Voltooi vervolgens de ELISA-analyse volgens de instructies van de fabrikant.Bereid 24 uur na het bestralen van de muizen de humane hematopoëtische cellen voor op xenotransplantatie. Wanneer u de hematopoëtische cellen resuspendeert in steriele PBS, is het raadzaam om ongeveer 15 tot 20 procent extra voor te bereiden, voor het geval er tijdens de transplantatie iets wordt gemorst. Bewaar de cellen bij vier graden Celsius tot aan de transplantatie en plaats het eerste ontvangende dier gedurende ten minste vijf minuten in een verwarmingskooi om dilatatie van de staartvene te vergemakkelijken.Warm de cellen nu op tot kamertemperatuur. Meng de celсусpensie voorzichtig en trek 200 µL op in een tuberculinespuit. Plaats de muis in de fixatiehouder en desinfecteer de staart met isopropylalcohol.Injecteer de cellen in een laterale staartader. Houd de muis vervolgens gedurende ten minste vijf minuten in de gaten om te bevestigen dat er geen bijwerkingen optreden die verband houden met het transplantaat. Patient-derived xenografted, of PDX-dieren, waarin controle-stroma is geïnjecteerd, vertonen consequent spiegels van menselijk thymisch stromaal lymfopoëtine, of TSLP, in het muizenplasma die onder de detectiegrens van de ELISA liggen.De plasmaspiegels van menselijk TSLP in PDX-muizen die zijn geïnjecteerd met TSLP-getransduceerd stroma zijn proportioneel aan de hoeveelheid geïnjecteerde TSLP-stromale cellen gedurende de voorgaande één tot twee weken. Ondanks dat dit in simplicate is uitgevoerd, geeft deze wekelijkse bepaling van de plasmaspiegels van TSLP met behulp van de gemodificeerde ELISA resultaten die over het algemeen consistent zijn in de tijd. Er is aangetoond dat TSLP de productie van normale menselijke B-celprecursoren verhoogt.Inderdaad zijn B-lijncellen in TSLP-plus-muizen significant verhoogd in vergelijking met de controle-PDX-dieren al in het stadium van de B-celvoorloper, wat suggereert dat het menselijke TSLP geproduceerd in TSLP-plus-PDX-dieren de verwachte in vivo functionele effecten uitoefent op doelcelpopulaties. Zodra deze procedures zijn geoptimaliseerd, kunnen er xenograft-muizen worden gegenereerd met detecteerbare niveaus van menselijke cytokinen binnen drie tot vier weken. Het is belangrijk om de cytokinenconcentratie in het supernatant van de stromacellen in de loop van de tijd te bewaken.Dit zorgt ervoor dat de cytokinenproductie gehandhaafd blijft in het cytokinenproducerende stroma en afwezig is in het controle-stroma. PDX-muizen kunnen worden gebruikt voor preklinische studies om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: Hoe wordt de werkzaamheid van een specifiek geneesmiddel van belang beïnvloed door het variëren van de fysiologische spiegels van een experimenteel cytokine van belang in vivo? Dit innovatieve model biedt onderzoekers in de hematologie en oncologie een nieuwe manier om de rol van TSLP bij de ontwikkeling en progressie van leukemie te bestuderen, evenals de rol ervan bij de normale hematopoëse.Mits u toegang heeft tot met cytokinen getransduceerde cellijnen, kunt u de in deze video gedemonstreerde technieken gebruiken om elk exogeen cytokine toe te dienen aan patiëntafgeleide xenograft-ziektemodellen met behulp van een breed scala aan immuundeficiënte muisstammen. Vergeet niet dat het werken met humane hematopoëtische cellen gevaarlijk kan zijn. U dient altijd voorzorgsmaatregelen te nemen om de overdracht van bloedoverdraagbare pathogenen te voorkomen tijdens het werken met deze vloeistoffen en cellen.

expression-exogenous-cytokine-patient-derived-xenografts-via

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Ex vivo Uitbreiding van Tumor-reactieve T-cellen door middel van Bryostatin 1/Ionomycin en de Gemeenschappelijke Gamma Chain Cytokines Formulering

Murine beenmergtransplantatie is een veel gebruikte techniek om immunologische mechanismen voor graft-versus-host ziekte bij mensen bestuderen. De mogelijkheid om T-cel mensenhandel patronen te...

Inductie van Graft-versus-host ziekte en<em&gt; In Vivo</em&gt; T-cel monitoren door gebruik van een MHC-matched muizenmodel

This article describes the technique for ex vivo T cell stimulation to increase the intracellular concentration of cytokines such as interferon-gamma or IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha or TNF-alpha in the T cell. These cytokines  mediate an effective anti-tumor response and can have a therapeutic role in the...

Ex Vivo T Cell Stimulation in the Pancreatic Tumor: A Method to Increase Cytokine Production in T Cells

This video demonstrates the evaluation of stromal cytokine-induced intracellular phosphorylation of proteins in leukemia cells. These intracellular phosphorylated proteins are quantified using the phospho-flow cytometry technique.

Evaluation of Stromal Cytokine-Induced Intracellular Protein Phosphorylation Using Phospho-Flow Cytometry

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de isolatie van tumor-initiërende cellen van humaan Sarcoom patiënt-afgeleide xenotransplantaten door fluorescentie-geactiveerde celsortering, waarbij gebruik wordt gemaakt van humaan leukocyten antigeen-1 (HLA-1) als een negatieve marker, en voor de verdere validering en karakterisering van deze HLA-1-negatieve tumor initiërende cellen.

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Hier presenteren we een protocol voor het opwekken en scoren van ziekten in een Xenogenic graft-versus-hostziekte (xenoGVHD) model. xenoGVHD biedt een in vivo model om immunosuppressie van menselijke T-cellen te bestuderen. Daarnaast beschrijven we hoe we menselijke T-cellen in weefsels met digitale PCR kunnen detecteren als een hulpmiddel om immunosuppressie te kwantificeren.

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

Deze studie beschrijft een methode om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes te isoleren die immuunstimulerende granulocyten macrofaagkolonie-stimulerende factoren dragen uit embryonale stamcellen.

Isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen

Hier presenteren we een protocol om de isolatie en uitbreiding van perifere bloedmononucleaire cellen-afgeleide cytokine-geïnduceerde CD3+CD56+ killer cellen uit te voeren en hun cytotoxiciteitseffect tegen hematologische en vaste kankercellen te illustreren met behulp van een in vitro diagnosestroom cytometriesysteem.

Isolatie en uitbreiding van cytotoxische Cytokine-geïnduceerde Killer T-cellen voor kankerbehandeling

Dit protocol beschrijft de chirurgische generatie van orthotopic alvleesklier tumoren en de snelle vertering van vers geïsoleerde lymfatische alvleesklier tumoren. Na de spijsvertering kunnen levensvatbare immuuncelpopulaties worden gebruikt voor verdere downstream-analyse, inclusief ex-vivo stimulatie van T-cellen voor intracellulaire cytokine detectie door Flowcytometrie.

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

Het huidige protocol beschrijft hoe de menselijke huid kan worden geënt op niet-obese diabetische (NOD) -scid interleukine-2 gammaketen receptor (NSG) muizen. Een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding van de menselijke huid voor transplantatie, de voorbereiding van muizen voor transplantatie, transplantatie van de menselijke huid van gespleten dikte en de herstelprocedure na de transplantatie zijn opgenomen in het rapport.

Xenograft huidmodel om menselijke immuunresponsen in vivo te manipuleren

Leer hoe je exogene cytokines produceert in patiënt-afgeleide xenograftmuizen via wekelijkse injecties met een cytokine-getransduceerde stromacellijn.

Expressie van exogeen cytokine in patiënt afgeleide Xenografts via injectie met een cytokine-getransduceerde stromcellijn

Meer video's verkennen