Absolute kwantificering van Aß _1-42 In CSF met behulp van een Massaspectrometrische Reference Measurement Procedure

Het algemene doel van deze referentiemetingsprocedure is om metingen van een bèta in menselijk CSF te harmoniseren. Deze methode kan helpen bij het standaardiseren van tests voor de meting van CSF a beta 42, wat een biomarker is voor centrale amyloïde pathologie en een neuropathologisch kenmerk van de ziekte van Alzheimer. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze grondig is gevalideerd en geen antilichamen gebruikt voor de kwantificering van AVR 142.

De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van de ziekte van Alzheimer omdat deze zou worden gebruikt om tests te harmoniseren en de introductie van algemene grenswaarden in klinische onderzoeken te vergemakkelijken. Hoewel deze methode inzicht kan geven in amyloïde pathologie bij mensen, kan deze ook worden toegepast op andere mortale organismen zoals transgene muizen en niet-menselijke primaten om nieuwe medicijnen te ontwikkelen. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat AVR 142 erg hydrofoob is en gemakkelijk aan oppervlakken kan plakken, zoals pipetten en buisjes.

Voeg eerst 40 microliter N15 a beta peptide toe aan 0,46 milliliter 20% acetonitril en 4% geconcentreerde ammoniak in een 0,5 milliliter microcentrifugebuisje. Meng de peptide-oplossing gedurende een minuut op een vortexmixer. Voeg 50 microliter van de peptide-oplossing toe aan 1,95 milliliter 20% acetonitril en 4% geconcentreerde ammoniak in een twee milliliter microcentrifugebuisje.

Meng de peptide-oplossing gedurende een minuut op een vortexmixer. Bereid vervolgens zes kalibratie-oplossingen door de juiste volumes van elke oplossing in microcentrifugebuisjes te mengen. Na het mengen van de kalibratie-oplossingen, bereid de uiteindelijke kalibrators in duplicaat voor door de juiste volumes van de corresponderende kalibratie-oplossingen en menselijk CSF in 0,5 milliliter microcentrifugebuisjes te mengen.

Meng elke oplossing gedurende een minuut op een vortexmixer. Om de interne standaard voor te bereiden, voeg eerst 32 microliter 13C a beta peptide toe aan 1,968 milliliter 20% acetonitril en 4% geconcentreerde ammoniak in een twee milliliter microcentrifugebuisje. Meng de peptide-oplossing gedurende een minuut op een vortexmixer.

Voeg vervolgens 0,1 milliliter van de peptide-oplossing toe aan 4,9 milliliter 20% acetonitril en 4% geconcentreerde ammoniak in een vijf milliliter microcentrifugebuisje. Meng de peptide-oplossing gedurende een minuut op een vortexmixer. Om het responsfactormonster voor te bereiden, voeg 40 microliters van het native a beta peptide toe aan 0,46 milliliter 20% acetonitril en 4% geconcentreerde ammoniak in een 0,5 milliliter microcentrifugebuisje.

Na het mengen, voeg 20 microliter van de peptide-oplossing en 20 microliter van vier microgram per milliliter, 15N a beta peptide toe aan 1,96 milliliter 20% acetonitril en 4% geconcentreerde ammoniak in een twee milliliter microcentrifugebuisje. Meng de peptide-oplossing gedurende een minuut op een vortexmixer. Voeg vervolgens 20 microliter van de peptide-oplossing toe aan 0,38 milliliter kunstmatig CSF in een 0,5 milliliter microcentrifugebuisje.

Na het voorbereiden van duplicaat, meng elke oplossing gedurende een minuut op een vortexmixer. Na het ontdooien van de monsters op een roller, voeg 0,18 milliliter van elke kalibrator, responsfactor en onbekende monster toe aan een eeen milliliter diepe 96-putjesplaat, zorg ervoor dat de monsters in of dicht bij de bodem van de putjes worden toegevoegd. Voeg nu 20 microliter interne standaard toe aan elke put door een druppel van de standaard los te laten op de zijkant van de put dicht bij het oppervlak van het monster zonder de pipettip onder te dompelen.

Voeg vervolgens 0,2 milliliter vijf molaire guanadinehydrochloride toe aan elke put. Plaats de monsterplaat op een microplaatshaker en meng de monsters gedurende 45 minuten bij 1100 rpm. Voeg na het mengen 0,2 milliliter 4% fosforzuur toe aan elke put.

Plaats vervolgens de monsterplaat op de microplaatshaker en meng kortstondig bij 1000 rpm. Plaats een reservoirbak voor afval onder een gemengde modus kationenuitwisselings 96-wel solid phase extractie, of SPE-plaat in de extractieplaat manifoldkamer. Condisioneer vervolgens de SPE-sorbent door 0,2 milliliter methanol toe te voegen aan elke put.

Breng vervolgens de sorbent in evenwicht door 0,2 milliliter 4% fosforzuur toe te voegen aan elke put. Gebruik een achtkanaals pipet om alle monsters van de diepe putjesplaat naar de SPE-plaat over te brengen. Was vervolgens de sorbent tweemaal nadat de monsters zijn doorgegaan door 0,2 milliliter 4% fosforzuur toe te voegen aan elke put.

Nadat het wasmiddel van de sorbent is geëlueerd, vervang de reservoirbak door buisjes. Elueer vervolgens het monster van de sorbent door twee 50 microliter aliquots van 75% acetonitril en 10% geconcentreerde ammoniak toe te voegen, waarbij opgemerkt wordt dat deze oplossing een zeer lage vacuüm vereist om door de sorbent te gaan. Droog de eluaten door middel van vacuümcentrifugatie zonder warmte toe te passen.

Seal tenslotte de buisjes en bevries ze bij 80 graden Celsius tot analyse. De kalibrators zijn dicht bij de regressielijn met lage standaardafwijkingen. Als kalibratie niet lineair is, moet de run worden weggegooid en is de afwijking hoogstwaarschijnlijk te wijten aan onjuiste pipetteringstechnieken en/of fouten in de verdunning van kalibrators.

De variatiecoëfficiënt van replica's moet bij voorkeur onder 10% zijn. De native 15N en 13C a beta elueren gelijktijdig uit de LC-kolom met bijna symmetrische pieken en zonder significante staartvorming. Ten minste 10 metingen moeten worden uitgevoerd voor elke piek en kunnen worden aangepast met een maximale injectietijd in de methode. De peptiden kunnen gelijktijdig worden gemeten tijdens de MS-analyse, tenzij de methodegevoeligheid suboptimaal is, waarbij alleen peptiden van belang mogen worden gemeten voor elke injectie.

Eenmaal beheerst kan deze techniek in vier uur worden uit