Name: Absolute kwantificering van Aß 1-42 In CSF met behulp van een Massaspectrometrische Reference Measurement Procedure (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer de absolute kwantificering van Aβ 1-42 in cerebrospinaal vocht met behulp van massaspectrometrie. Deze gevalideerde methode zonder antilichamen standaardiseert metingen voor Alzheimer-onderzoek en klinische trials.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd uitgevoerd namens de International Federation of Clinical Chemistry Working Group on CSF Proteins, die de volgende samenstelling heeft: Kaj Blennow (Voorzitter) en Henrik Zetterberg, Universiteit van Göteborg, Zweden; Les Shaw en Magdalena Korecka, Universiteit van Philadelphia, PA, VS; Ingrid Zegers, Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, België; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Duitsland; en Rand Jenkins, PPD Bioanalytical Laboratory, Richmond, VA, VS; Randall Bateman, Washington University, MO, VS; en H Vanderstichele, Innogenetics NV, Gent, België. Dit werk was ook onderdeel van de Global Consortium for Biomarker Standardization CSF Reference Methods Working Group, geleid door Maria C. Carrillo, Ph.D., Senior Director, Medical & Scientific Relations, Alzheimer's Association. Het onderzoek werd ondersteund door The Swedish Research Council (subsidies #14002, #521-2011-4709 en #2013-2546); de Knut en Alice Wallenberg Foundation; Demensförbundet; en Emil en Wera Cornell's, Aina Wallström en Mary-Ann Sjöblom's, Gun en Bertil Stohne's, Magnus Bergvall's en Gamla Tjänarinnor's Stichtingen.

Opmerking: Dit protocol vereist aliquots van ten minste 50 uL, met een concentratie van 50 ug / ml voor elk Aß peptide, als uitgangsmateriaal. De Aß peptiden worden opgelost in 20% acetonitril (ACN) en 4% geconcentreerde ammonia oplossing in gedeïoniseerd water (v / v) en bewaard bij 80 ° C. Let op: Zie tabel 1 voor informatie over veiligheid. 1. Bereiding van de oplossingen <ol><li> Bereid 100 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammonia oplossing in gedeïoniseerd water (v / v) door het verdunnen van 20 ml ACN en 4 ml geconcentreerde ammoniak (~ 25%) in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 100 ml met gedeïoniseerd water. Maak dagelijks vers. </li><li> Bereid 50 ml van 5 M guanidine-hydrochloride door het oplossen van 26,08 g guanidine-hydrochloride in gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 50 ml. Bewaren bij 20 ° C en maak verse maandelijks. </li><li> Bereid 200 ml 4% fosforzuur in gedemineraliseerd water (v /v) door het verdunnen van 9,4 ml geconcentreerd fosforzuur (~ 85%) in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 200 ml met gedeïoniseerd water. Bewaar in de koelkast en maak verse wekelijks. </li><li> Bereid 50 ml 75% ACN en 10% geconcentreerde ammonia (v / v) in gedeïoniseerd water door het verdunnen 37,5 ml ACN en 5 ml geconcentreerde ammonia (~ 25%) in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 50 ml met gedeïoniseerd water. Maak dagelijks vers. </li><li> Dooi ten minste 2,5 ml van het menselijk CSF voor de kalibrators, verkregen uit-de geïdentificeerde overgebleven monsters uit routine klinische analyse. </li><li> Bereid kunstmatige CSF bevattende 150 mM Na, K 3,0 mM, 1,4 mM Ca, Mg 0,8 mM, 1,0 mM P en 155 mM Cl in gedeïoniseerd water en voeg runderserumalbumine tot een eindconcentratie van 4 mg / ml. Slechts 1 mL nodig per analyse, maar stelt een groot volume, hoeveelheid, en opslag voor later gebruik. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Calibrators <ol><li> Bereid 0,5 ml 4 ug / ml 15 NAβ 1-42 peptide door toevoeging van 40 ul van 50 ug / ml 15 NAβ 142-,46 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 0,5 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut. </li><li> Bereid 2 ml 100 ng / ml 15 NAβ 1-42 peptide door toevoeging van 50 pi van de 4 ug / ml 15 NAβ 142-1,95 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 2 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut. </li><li> Neem zes kalibrator oplossingen (AF) door mengen van de volumes van elk van de in tabel 2 oplossing. Gebruik 0,5, 1,5 en 2 ml microcentrifugebuizen. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut. </li><li> Bereid de uiteindelijke kalibrators (in tweevoud) in 0,5 ml microcentrifugebuizen door het toevoegen van de bijbehorende ijkoplossingen en menselijke CSF volgens tabel 3. Meng op een vortex mixer gedurende 1 min. </li></ol> 3. Voorbereiding van de interne standaard <ol><li> Bereid 2 mL 0,8 ug / mL 13 CAβ 1-42 peptide door toevoeging van 32 ul van 50 ug / ml 13 CAβ 142-1,968 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 2 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut. </li><li> Bereid 5 ml 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 peptide door toevoeging van 0,1 ml 0,8 ug / ml tot 4,9 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 5 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut. </li></ol> 4. Voorbereiding van de Response Factor Sample OPMERKING: De responsfactor (RF) bepaling wordt uitgevoerd om de concentratie van het gemerkte eiwit gebruikt voor kalibratie (15 NAβ 1-42) te bepalen. Dit vereist dat de concentratie van het natieve 1-42 Aß peptide werd bepaald met aminozuuranalyse (AAA). Zo is het volume en de concentratie van natuurlijk Ap-peptide 1-42 aliquotsmoeten de eisen van de AAA voldoen. <ol><li> Bereid 0,5 ml 4 ug / ml natuurlijke (ongemerkt) Aß 1-42 door toevoeging van 40 ul van 50 ug / ml natief Aß 1-42 0,46 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 0,5 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut. </li><li> Bereid een 2-mL 40 ng / mL mengsel van natief en 15 NAβ 1-42 door toevoeging van 20 ul van 4 ug / ml natief Aß 1-42 en 20 pi van 4 ug / mL 15 NAβ 1-42 tot 1,96 ml 20% ACN en 4% geconcentreerd ammonia in een 2 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut. </li><li> Voeg 20 ul van 40 ng / mL mix 0,38 ml kunstmatige CSF in een 0,5 ml microcentrifugebuis. Bereid duplicaten en mix op een vortex mixer gedurende 1 min. </li></ol> 5. Monstervoorbereiding OPMERKING: Ontdooi de te meten monsters bij kamertemperatuur op een roller. <ol><li>Voeg 0,18 ml van elke calibrator, responsfactor en onbekende monster (inclusief kwaliteitscontrole [QC] samples, indien gebruikt) tot een 1 mL eiwit 96 diepe putjes, volgens figuur 1 (uitgaande van een volledige plaat wordt gebruikt). Zorg ervoor dat de monsters voegen, of dicht bij, de bodem van de putjes. </li><li> Voeg 20 ul van interne standaard aan elk putje (dat wil zeggen, kalibratoren, reactie factoren, QCs en onbekenden); is het cruciaal om de druppel op de kant van de bron dicht bij het oppervlak van het monster vrij te dompelen de pipetpunt. </li><li> Voeg 0,2 ml van 5 M guanidine-waterstofchloride aan elk putje. </li><li> Het monster plaat op een microplaat schudinrichting en meng de monsters gedurende 45 minuten bij 1100 rpm. De optimale frequentie kunnen verschillen afhankelijk van de instrumentatie. De frequentie en amplitude van de mixer, zodat de oplossingen grondig gemengd en geen druppels interne standaard of CSF ongemengde gelaten aan de zijde van de putjes. </li><li> Voeg 0,2 ml 4% fosforzuuraan elk putje. Vortex meng kort. </li></ol> 6. Solid Phase Extraction Opmerking: In alle was-, laad- en elutiestappen, passen de laagst mogelijke vacuüm na het toevoegen van de oplossing en geleidelijk naar behoefte te laden of te elueren de oplossing. Schakel het vacuüm tussen elke laad- en elutiestap. <ol><li> Zet een reservoir tray voor afvalstoffen in het kader van een mixed-mode, kation-uitwisseling, 96-well vaste fase extractie (SPE) plaat in de winning plaat verdeelkamer. </li><li> Conditioneer de SPE sorptiemiddel door toevoeging van 0,2 ml methanol aan elk putje. </li><li> Het sorptiemiddel evenwicht door toevoeging van 0,2 ml 4% fosforzuur aan elk putje. </li><li> Breng alle monsters (ongeveer 0,62 ml in elk putje) uit de diepe-wells plaat aan de SPE plaat. Gebruik een acht-kanaals pipet bij het overbrengen van de monsters van de deep-well plaat om de SPE plaat; Het is niet cruciaal voor de gehele of gelijk volumina van monsters dragen, aangezien de monsters stage bevattenal standaard die zal compenseren voor variaties. </li><li> Was het sorptiemiddel nadat de monsters door middel van toevoeging van 0,2 ml 4% fosforzuur aan elk putje gepasseerd. </li><li> Na het wassen oplosmiddel uitgewassen uit het sorptiemiddel, vervangt het reservoir dienblad met een verzameling plaat of tubes. </li><li> Elueer het monster van het sorptiemiddel met tweemaal toevoegen van 50 ui 75% ACN / 10% geconcentreerde ammonia en merk op dat deze oplossing vereist een zeer laag vacuüm door het sorbens te passen. Vergeet niet om het vacuüm tussen elke toevoeging te schakelen. <ol><li> OPTIE: Sluit de collectie plaat of tubes en vries ze bij -80 ° C. Haal de afdichting uit de collectie plaat of tubes voordat u verder met stap 6.8.2. </li><li> Droog de eluaten met vacuümcentrifugatie (zonder toepassing van warmte); Dit kan van de ene tot enkele uren, afhankelijk van het vacuüm centrifuge. </li><li> Verzegel de containers en bevriezen bij -80 ° C. </li></ol></li></ol> 7. Liquid Chromatografie <ol><li> Bereid mobiele fase A (5% ACN en 0,3% geconcentreerde ammoniak in gedemineraliseerd water [v / v]), B (4% gedemineraliseerd water en 0,1% geconcentreerde ammoniak in ACN [v / v]), en de naald was (50% ACN en 4% geconcentreerd ammoniak in gedemineraliseerd water [v / v]). <ol><li> Voor 500 ml mobiele fase A, voeg 25 ml ACN en 1,5 ml geconcentreerde ammoniak in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 500 ml met gedeïoniseerd water. </li><li> Voor 500 ml mobiele fase B, voeg 500 ul van geconcentreerde ammonia en 25 ml gedeïoniseerd water ACN. Pas het uiteindelijke volume tot 500 ml met ACN. </li><li> Bereid 250 ml naald wassen door toevoeging van 120 ml ACN en 10 ml geconcentreerde ammoniak in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 250 ml met gedeïoniseerd water. </li><li> Zet de mobiele fasen A en B en naald wasflessen wordt in een bad sonicatie gedurende 20 minuten voor gebruik met het systeem LC </li></ol></li><li> Ontbinden elk monster met 25 ul van 20% ACN en 4% concentrated ammoniakoplossing en plaats ze op een schudder gedurende 20 min. Centrifugeer beneden de monsters en plaats ze in de autosampler (houden bij 7 ° C). </li><li> Injecteer 20 uL monster op een 1 x 250 mm 2 polystyreen-divinylbenzeen (omgekeerde fase) monolithische kolom gehandhaafd op 50 ° C. <ol><li> Gebruik de LC gradiënt in tabel 4 met een debiet van 0,3 ml / min. Doorschakelen de eerste twee en de laatste vijf minuten naar afval (post-kolom) met een omleiding klep om de verontreiniging van de massaspectrometer verminderen. </li></ol></li></ol> 8. massaspectrometrische analyse LET OP: Deze parameters werden gebruikt voor een quadrupool-orbitrap hybride massaspectrometer uitgerust met aheated elektrospray ionisatie bron. <ol><li> Stel de parameters voor de ionenbron volgens tabel 5. </li><li> Stel de MS instrument om de 4+ lading staten van inheemse Aß 1-42 te isoleren (1,129.48 massa-ladingsverhouding [m / z]), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 m / z), en 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) in de quadrupool massa-analysator met een isolatie breedte van 2,5 m / z. </li><li> Versnippering van de geïsoleerde peptiden in de botsing cel met een genormaliseerd botsingsenergie (NVU) van 17,0. Dit zou moeten worden afgestemd op elk instrument, zelfs van hetzelfde type (en in het bijzonder als het gebruik van andere soorten instrumenten, zoals een triple quadrupool MS). </li><li> Noteer het fragment spectra met een resolutie van 17.500, met een automatische versterkingsregeling Doelwit van 2 x 10 5 kosten en een maximale injectietijd van 250 ms. </li></ol> 9. Data Processing <ol><li> Gebruik de som van het product ionen (met een massatolerantie van ± 250 milli gewichtseenheden [mmu]) in tabel 6 de chromatografische gebieden berekeningen voor elke peptide. Merk op dat de types ion en cijfers alleen worden getoond voor inheemse AP <sub&gt; 1-42 product ionen, omdat ze hetzelfde zijn voor zowel 15 NAβ 1-42 en 13 CAβ 1-42. </li><li> Bepaal de gemiddelde responsfactor van beide responsfactor monsters door het oppervlak te delen onder de curve (chromatografische piek) van 15 NAβ 1-42 waarbij het gebied onder de curve van natieve Aß 1-42. </li><li> Dient de concentratie van de 15 NAβ 1-42 voor kalibratie met de responsfactor berekend in stap 9.2 vermenigvuldigen. </li><li> Construeer een ijkcurve door het gebied verhoudingen van 15 tot 13 NAβ 1-42 CAβ 1-42 van de twee kalibrators tegen de concentratie. </li><li> Bereken de helling en intercept van de ijklijn met behulp van lineaire regressie. </li><li> Bereken de oppervlakte verhouding van inheemse Aß 1-42 om de interne standaard (13 CAβ 1-42) voor unbekende monsters. </li><li> Extrapoleren concentratie van onbekende monsters uit de ijkcurve door de helling en intercept verkregen in stap 9.5. </li></ol>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20107219">Alzheimer's disease.</a> N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neuropathology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease.</a> Acta Neurol Scand Suppl. 165, 3-12 (1996).</li>
<li>Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16876668">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).</li>
<li>Dubois, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+research+diagnostic+criteria+for+Alzheimer%27s+disease%3A+the+IWG-2+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria.</a> Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).</li>
<li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li>
<li>Buchhave, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22213792">Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia.</a> Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).</li>
<li>Olsson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+and+blood+biomarkers+for+the+diagnosis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).</li>
<li>Bjerke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+influencing+amyloid+Beta+concentration+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2010).</li>
<li>Dumurgier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersite+variability+of+CSF+Alzheimer%27s+disease+biomarkers+in+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting.</a> Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).</li>
<li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+biomarker+variability+in+the+Alzheimer%27s+Association+quality+control+program%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program.</a> Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).</li>
<li>Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23519967">Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers.</a> Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).</li>
<li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+measurement+procedures+for+Alzheimer%27s+disease+cerebrospinal+fluid+biomarkers%3A+definitions+and+approaches+with+focus+on+amyloid+beta42%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42.</a> Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).</li>
<li>Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+endogenous+androgenic+steroids+in+cattle%27s+meat+by+gas+chromatography+mass+spectrometry+using+a+surrogate+analyte+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach.</a> Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).</li>
<li>Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry+methods+for+quantitation+of+mevalonic+acid+in+human+plasma+and+urine%3A+method+validation%2C+demonstration+of+using+a+surrogate+analyte%2C+and+demonstration+of+unacceptable+matrix+effect+in+spite+of+use+of+a+stable+isotope+analog+internal+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).</li>
<li>Leinenbach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+candidate+reference+measurement+procedure+for+quantification+of+amyloid-beta+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid.</a> Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).</li>
<li>Li, W., Cohen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+endogenous+analytes+in+biofluid+without+a+true+blank+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix.</a> Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).</li>
<li>Perret-Liaudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+collection+tubes%3A+a+critical+issue+for+Alzheimer+disease+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis.</a> Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).</li>
<li>Lewczuk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).</li>
<li>Pannee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+measurement+procedure+for+CSF+amyloid+beta+%28A%CE%B2%291-42+and+the+CSF+A%CE%B21-42+%2FA%CE%B21-40+ratio+-+a+cross-validation+study+against+amyloid+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (Aβ)1-42 and the CSF Aβ1-42 /Aβ1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET.</a> J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).</li>
<li>Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceability+to+a+common+standard+for+protein+measurements+by+immunoassay+for+in-vitro+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes.</a> Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).</li>
<li>Vesper, H. W., Thienpont, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceability+in+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Traceability in laboratory medicine.</a> Clin Chem. 55 (6), 1067-1075 (2009).</li>
</ol>

JP en EP rapporteren geen onthullingen. HZ heeft dienst gedaan in de adviesraden van Roche Diagnostics, Eli Lilly en Pharmasum Therapeutics. KB heeft gediend als consultant of in de adviesraden voor Fujirebio Europe, IBL International en Roche Diagnostics. HZ en KB zijn mede-oprichters van Brain Biomarker Solutions in Gothenburg AB, een GU Venture-gebaseerde platformonderneming aan de Universiteit van Göteborg.

Voor de beschreven werkwijze, in plaats van een surrogaat matrix gebruikten we de surrogaat analyt benadering 13, 14, 15, 16, die ijking in menselijke CSF maakt. Het surrogaat analyt benadering omvat twee verschillende isotopisch gelabelde standaards. On (15 NAβ 142) wordt gebruikt om de kalibratiekromme in menselijk CSF genereren, terwijl andere (13 CAβ 1...

Ziekte van Alzheimer (AD) is de meest voorkomende vorm van dementie en treft ongeveer 35 miljoen mensen wereldwijd 1. De neuropathologische kenmerken van de ziekte algemeen aangenomen in de kern van de pathogenese van AD te liggen zijn intracellulaire tangles van hypergefosforyleerd tau-eiwit 2 en extracellulaire plaques bestaande uit geaggregeerde amyloid-beta (Aß) peptiden 3. In lijn hiermee heeft de beoordeling van plaque pathologie in vivo door biomarkers onlangs opgenomen in het onderzoek diagnostische criteria voor AD 4. Voor CSF metingen van AB 1-42, verschillende immunoassays zijn beschikbaar en worden gebruikt in vele klinische laboratoria 5. De concentratie van Ap 1-42 in CSF is in AD patiënten ongeveer 50% lager dan in het cognitief normale ouderen, als gevolg van de afzetting van het peptide in plaques in de brain 6, 7. Deze biomarkers zijn voornamelijk geanalyseerd met immunoassays (bijvoorbeeld op antilichaam gebaseerde technieken), maar deze assays worden beïnvloed door matrixeffecten 8. Het gebruik van immunoassays op verschillende technologische platforms en het gebrek aan standaardisatie assay 9, 10 maakt de invoering van globale cut-off concentraties moeilijk 11, 12. Een analytisch gevalideerd RMP zou de uniforme kalibratie van verschillende assay platforms toe te staan, idealiter resulteert in een betere vergelijkbaarheid tussen de analytische platforms en in een betere controle van de factoren die bijdragen aan de totale meting variabiliteit. De absolute kwantificering van Aß 1-42 met behulp van de ontwikkelde LC-MS / MS methode overwint veel van de kwesties in verband met antilichamen gebaseerde techniques. De methode, vermeld als een RMP door het Gemengd Comité voor Traceerbaarheid in Laboratory Medicine (JCTLM databank identificatienummer C11RMP9), zullen worden gebruikt om de absolute concentratie van Aß 1-42 te bepalen in een Certified Reference Material (CRM) te harmoniseren CSF AB 1 -42 metingen over technieken en analyse-platforms. De beschreven workflow moet relevant zijn voor de ontwikkeling van kandidaat referentiemethoden voor peptiden en eiwitten in andere gebieden van de geneeskunde.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431102</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.310</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96</td><td>Eppendorf</td><td>951032905</td><td></td></tr><tr><td>Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom</td><td>Micronic</td><td>MPW32071BC3</td><td>Buizen gebruikt voor het verzamelen van SPE-eluaat, maar andere verzamelapparaten kunnen worden gebruikt, zoals 96-wells platen.</td></tr><tr><td>Micronic Split TPE Capcluster voor 96 individuele buizen</td><td>Micronic</td><td>MP53026</td><td>Kappen voor Micronic-buizen.</td></tr><tr><td>Micronic Loborack-96 wit met hoge deksel gebarcodeerd</td><td>Micronic</td><td>MPW51015BC3</td><td>Houder voor Micronic-buizen.</td></tr><tr><td>Biohit Optifit tips 1.2 mL</td><td>Sartorius</td><td>791210</td><td>Wordt gebruikt om helemaal tot de bodem van de LoBind deepwell platen (96-wells) te reiken. Andere smalle tips kunnen ook werken.</td></tr><tr><td>Waters Oasis MCX 96-well &micro;Elution Plate</td><td>Waters</td><td>186001830BA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Waters Plate manifold reservoir tray</td><td>Waters</td><td>WAT058942</td><td></td></tr><tr><td>Waters Extraction Plate Manifold voor Oasis 96-Well Plates</td><td>Waters</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxide oplossing, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17X</td><td></td></tr><tr><td>ortho-Fosforzuur 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td><td>Merck Millipore</td><td>1005731000</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinehydrochloride, 500 g</td><td>Thermo Scientific</td><td>24110</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Met gebundelde Dionex Ultimate 3000 LC &amp; autosampler.</td></tr><tr><td>Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)</td><td>Dionex</td><td>066640</td><td></td></tr><tr><td>Bovien Serum Albumine, gelyofiliseerd poeder, geschikt voor (voor moleculaire biologie), niet-acetyleerd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Amyloid (1-42), Ultra Puur, TFA</td><td>rPeptide</td><td>A-1002-2</td><td></td></tr><tr><td>15N Beta-Amyloid (1-42), Uniform gelabeld</td><td>rPeptide</td><td>A-1102-2</td><td></td></tr><tr><td>13C Beta-Amyloid (1-42), Uniform gelabeld</td><td>rPeptide</td><td>A-1106-2</td><td></td></tr><tr><td>Microplate shakers, TiMix 2</td><td>Edmund Bühler</td><td>6110 000</td><td></td></tr></tbody></table>

absolute kwantificering van aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; in csf met behulp van een massaspectrometrische reference measurement procedure

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

De ziekte van Alzheimer (AD) is de meest voorkomende neurodegeneratieve ziekte onder ouderen en is verantwoordelijk voor 60-80% van alle gevallen van dementie. Momenteel is de diagnose van AD gebaseerd op cognitieve tests en onderzoek van de mentale toestand, maar het peptide amyoïde-beta (Aβ) in hersenvocht (CSF) wordt steeds vaker gebruikt in klinische onderzoeken en omgevingen. Zoals voor de meeste eiwit- en peptide biomarkers, wordt kwantificering uitgevoerd met behulp van op antilichamen gebaseerde technieken, zoals enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Echter, intra- en inter-laboratorium variabelen in deze tests belemmeren het gebruik ervan als diagnostisch marker in de klinische routine.
Een antilichaam-onafhankelijke Referentie Meet Procedure (RMP) werd ontwikkeld op basis van solid-phase extractie (SPE) en vloeistofchromatografie (LC)-tandem massaspectrometrie (MS/MS), waarbij stabiele, isotoop-gelabelde Aβ peptiden werden gebruikt als interne standaarden, waardoor absolute kwantificering mogelijk werd. Een high-resolution quadrupole-orbitrap hybride instrument werd gebruikt voor de metingen. De methode maakt kwantificering mogelijk van CSF Aβ1-42 tussen 150-4.000 pg/mL.

De plaat opstelling in figuur 1 wordt gebruikt voor een volledige plaat van monsters. Als er minder onbekende monsters moeten worden geanalyseerd, de tweede kalibrator, RF, en QC sets moet worden geplaatst na de eerste helft van de onbekende monsters. Zoals blijkt uit figuur 2, de kalibrators dicht bij de regressielijn met lage standaarddeviaties. Deze methode heeft een lager kwantificering va...

Een referentiemetingsprocedure voor de absolute kwantificering van Aβ1-42 in menselijk CSF op basis van extractie in vaste fase en vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie wordt beschreven.

Absolute kwantificering van Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; In CSF met behulp van een Massaspectrometrische Reference Measurement Procedure

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

Het algemene doel van deze referentiemethode is het harmoniseren van metingen van bèta-amyloïde in menselijk CSF. Deze methode kan helpen bij het standaardiseren van assays voor de meting van CSF Aβ42, wat een biomarker is voor centrale amyloïde pathologie en een neuropathologisch kenmerk van de ziekte van Alzheimer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze grondig is gevalideerd en geen antilichamen gebruikt voor de kwantificering van Aβ42.De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van de ziekte van Alzheimer, omdat deze kan worden gebruikt om assays te harmoniseren en de introductie van algemene afkapwaarden in klinische studies te faciliteren. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de amyloïde pathologie bij mensen, kan ze ook worden toegepast op andere zoogdieren, zoals transgene muizen en niet-menselijke primaten, om nieuwe geneesmiddelen te ontwikkelen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode tegen problemen aanlopen, aangezien AVR 142 zeer hydrofoob is en gemakkelijk kan hechten aan oppervlakken zoals pipetpunten en buisjes.Voeg eerst 40 µL N15 a beta peptide toe aan 0,46 mL 20% acetonitril en 4% geconcentreerde ammon

absolute-quantification-a1-42-csf-using-mass-spectrometric-reference

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Samuels, D. J., et al. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the use of liquid chromatography–mass spectrometry to identify and quantify intracellular metabolites from S. aureus. It outlines the steps involved in metabolite extraction, peptide normalization, liquid chromatography, and mass spectrometric analysis.

A Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-Based Approach for Analyzing Metabolites from S. aureus

Dit artikel beschrijft de toepassing van cryoanalytical elektronenmicroscopie aan de kwantitatieve meting van het totale gehalte aan calcium en distributie op subcellulaire resolutie in fysiologisch gedefinieerde biologische monsters.

Meting van totale Calcium in Neuronen door Electron Probe X-stralen micro analyse

Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. Gebruik te maken van de normale fasen vloeistofchromatografie gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometrie met polariteit schakelen en een snelle duty cycle, beschrijven we een protocol bij de polaire metabole samenstelling van biologisch materiaal met een hoge gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie te analyseren.

Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

Dit protocol beschrijft hoe absolute kwantificeringsanalyses van doeleiwitten binnen complexe biologische monsters kunnen worden uitgevoerd met behulp van geselecteerde reactiebewaking. Het werd gebruikt om eiwitten van de muis macrofaag chemotaxis signaleringsroute nauwkeurig te kwantificeren. Selectie van doelpeptiden, ontwikkeling van analyses en kwalitatieve en kwantitatieve analyses worden in detail beschreven.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Grootte-exclusiechromatografie gekoppeld aan inductief gekoppelde plasma - massaspectrometrie (ICP-MS) is een krachtig hulpmiddel om veranderingen in de abundantie van metalloproteïnen direct uit biologische monsters te meten. Hier beschrijven we een reeks metalloproteïne-standaarden die worden gebruikt om de moleculaire massa en de hoeveelheid metaal geassocieerd met onbekende eiwitten te schatten.

Normen voor Quantitative Metalloproteomic analyse met behulp van Size Exclusion ICP-MS

We beschrijven een high-throughput, multiplex en gerichte proteomische cerebrospinale vloeistof (CSF) test ontwikkeld met potentieel voor klinische toepassing. De test kan kwantificeren potentiële markers en risicofactoren voor neurodegeneratie zoals de apolipoproteïne E varianten (E2, E3 en E4), en de allelische expressie te meten.

Een High Throughput, multiplexverzending en Gerichte Proteomic CSF Assay te kwantificeren neurodegeneratieve Biomarkers en apolipoproteïne E isovormen Status

Hier presenteren wij onbevooroordeelde kwantificering van site-specific eiwit acetylation en/of succinylation bezetting (stoichiometrie) van een volledige Proteoom door middel van een analyse van de ratiometric van endogene aangebrachte wijzigingen na kwantitatieve chemische acylering met behulp van stabiele isotoop-geëtiketteerden anhydriden. In combinatie met de Spectrometrie van de massa van de gevoelige gegevens-onafhankelijke acquisitie, worden nauwkeurige site bezetting metingen verkregen.

Kwantificering van Site-specific eiwit Lysine Acetylation en Succinylation stoichiometrie met behulp van spectrometrie van de massa van het gegevens-onafhankelijke overname

Eiwitsynthese is een kritisch biologisch proces voor cellen. In de hersenen is het vereist voor adaptieve wijzigingen. Meting van de tarieven van de eiwitsynthese in de intacte hersenen vereist zorgvuldige methodologische overwegingen. Hier presenteren we de L-[1-14C]-Leucine kwantitatieve autoradiografische methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese in vivo.

Kwantitatieve autoradiografische methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese in vivo

Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Verhoogde ruggenmergvloeistof eiwit niveaus kunnen ofwel het resultaat van diffusie van plasma eiwit over een veranderde bloed-hersen barrière of intrathecale synthese. Een geoptimaliseerd testprotocol wordt in dit artikel gepresenteerd dat helpt om beide gevallen te discrimineren en kwantitatieve metingen van intrathecaal gesynthetiseerde eiwitten verschaft.

Kwantitatieve meting van Intrathecaal gesynthetiseerde eiwitten bij muizen

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Leer de absolute kwantificering van Aβ 1-42 in cerebrospinaal vocht met behulp van massaspectrometrie. Deze gevalideerde methode zonder antilichamen standaardiseert metingen voor Alzheimer-onderzoek en klinische trials.

Absolute kwantificering van Aß

Meer video's verkennen