Twee algoritmes voor High-throughput en multi-parametrische Kwantificering van Drosophila Neuromusculaire Junction morfologie
3 mei 2017
Twee beeldanalyse algoritmen, "Drosophila NMJ Morfologie" en "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" zijn gemaakt, automatisch kwantificeren negen morfologische kenmerken van de Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ).
Het algemene doel van deze procedure is om morfologische kenmerken van de Drosophila-neuromusculaire junctie automatisch te kwantificeren met behulp van macros voor morfometrische software. Deze methode kan helpen bij het identificeren van regulatoren van synapsontwikkeling, een belangrijke vraag in de neurobiologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de automatische kwantificering van meerdere NMJ-kenmerken.
Dit maakt objectieve analyse van NMJ-morfologie op grote schaal mogelijk. We besloten deze methodologie te ontwikkelen om NMJ-morfologie in een groot aantal ziektemodellen te onderzoeken. We dachten na over manieren om hun persoonlijke verschillen te voorkomen en om het kwantificeringsproces aanzienlijk te versnellen.
Visuele demonstratie van deze methode is erg nuttig. Geschikte macro-instellingen zijn cruciaal en sommige stappen kunnen moeilijk zijn voor nieuwe gebruikers, vooral als ze niet bekend zijn met VT-software. Voor dit protocol genereert u beeldstacks van NMJ's en slaat u deze op als individuele TIFF-bestanden, waarbij kanaal één DLG1-kleuring, of een soortgelijke marker, toont en kanaal twee BRP-kleuring toont.
Om te beginnen, maakt u C-projecties en hyperstacks van de NMJ-beeldbestanden. Open de plugin-opties en selecteer Drosophila NMJ Morphometrics. Identificeer nu de unieke bestandsstring die de microscoop aan de beeldserie heeft toegewezen bij het opslaan als TIFF.
Dit zal aan het einde van de beeldnaam staan. Kopieer en plak de gegeven string naar het laagste vlak en het kanaalnummer in het unieke bestandsstring-instellingsvenster. Selecteer vervolgens de submacro convert to stack en kies de directory of map waar de afbeeldingen zich bevinden.
Voor elk beeldbestand worden twee nieuwe bestanden gemaakt met de standaardnamen stack en flat stack, gevolgd door de originele beeldnaam. De originele bestanden kunnen vervolgens worden verwijderd om opslagruimte te besparen. Selecteer vervolgens vanuit de Drosophila NMJ Morphometrics-interface de submacro definieer ROI en kies de directory van het beeldbestand.
Zodra de eerste projectie opent, selecteert u het gereedschap voor vrije selectie. Gebruik vervolgens de muis om een gebied te definiëren dat een complete NMJ-terminal van belang bevat. Klik eenmaal geselecteerd op OK in het venster voor het definiëren van de terminal.
Ga hiermee verder totdat de NMJ-terminals in alle projecties zijn gedefinieerd. De macro zet het proces automatisch voort. Voor elk beeldbestand wordt één nieuw bestand gemaakt met de standaardnamen ROI gevolgd door de originele beeldnaam.
Om de NMJ-kenmerken te kwantificeren, gaat u eerst naar de Drosophila NMJ Morphometrics-interface en stelt u de schaal in. Als bijvoorbeeld één pixel in het beeld overeenkomt met 0,72 micrometer, stelt u de schaalpixels in op één en de schaalafstand op 0,072. Selecteer vervolgens de submacro analyseer en schakel, als er twee kanaalbeelden zijn, ook gewicht in.
Druk op OK en selecteer, wanneer gevraagd, de directory van het beeldbestand. De verwerkingstijd kan enkele minuten per synaps zijn. Na de analyse worden nieuwe beeldbestanden voor elke geanalyseerde synaps opgeslagen in de oudermap en zijn de kwantitatieve metingen de resultaten.
txt-bestand. Inspecteer alle beelden en sluit foto's met segmentati fouten uit. Bijvoorbeeld, delen van de synaptische terminal mogen niet in de gele omtrek zijn opgenomen.
Delen van de achtergrond kunnen in de synaptische terminal zijn opgenomen. Een blauwe skeletlijn kan zich uitstrekken voorbij de synaptische terminal. Er kunnen te veel actieve zones zijn, of sommige actieve zones kunnen onopgemerkt blijven.
Als meer dan 5% van de beelden segmentati fouten hebben, onderzoek verschillende analysealgoritmen om de beeldverwerking te verbeteren. De komende video-onderdelen beschrijven hoe u veel van deze macro-analyse-instellingen kunt definiëren. Om de waarde van de rolling ball radius voor de macro aan te passen, selecteert u drie NMJ Z-projecties die representatief zijn voor de beeldgegevensset.
Verwijder de naam van het resultatenres-beeld en de naam van het stack-bestand met twee actieve zones, eerder gemaakt door de submacro analyseer. Open de stack-bestandsnamen voor elk geselecteerd beeld en selecteer vervolgens in de werkbalk kanalen splitsen om een afbeelding van kanaal één en een afbeelding van kanaal twee te maken en sla deze bestanden op. Open het beeld dat behoort bij kanaal één, wat in dit geval overeenkomt met DLG één immunolabeling.
Voer nu het filter achtergrondraduktie uit, dat onder het tabblad proces te vinden is. Stel de rolling ball radius in op een waarde die het contrast tussen de synaps en de achtergrond verhoogt. Maak een Z-projectie met een projectietype als max intensiteit en sla het beeld op.
Voer vervolgens de achtergrondraduktie-algoritme uit met de nieuwe rolling ball radius op alle Z-projecties en sla de resultaten op. Om de beste automatische drempels voor de macro te bepalen, opent u de opgeslagen C-projecties en voert u automatische drempel in met de optie alles proberen. Vind uit de resulterende beelden de meest geschikte algoritme voor de beelden en ga verder met het gebruik van die drempelinstelling bij het uitvoeren van de macro voor verdere beelden.
Het definiëren van de verschillende automatische drempels is cruciaal voor correcte beeldsegmentatie door de macro. Om deze reden is het belangrijk om vertrouwd te zijn met de 16 automatische drempelopties die de software biedt om acht van de signageparameters correct te kwantificeren. Druk op de plus-knop om in te zoomen op het resultaatbeeld van de automatische drempel.
De algoritmenamen bevinden zich onder elk resultaatbeeld. In dit voorbeeld is de beste automatische drempelalgoritme voor de instelling NMJ-omtrekdrempel Huang. Voor de skeletdrempel is de beste instelling Li en de beste instelling voor de actieve zonedrempel is Huang.
Om de fijne maxima-ruistolerantiewaarde voor de macro te definiëren, keert u terug naar de oorspronkelijke representatieve NMJ-beelden. Open het BRP-kanaal. Ga naar het tabblad plugins in het pop-upmenu en selecteer maximum 3D.
Na een korte tijd zal een nieuw beeld verschijnen, sluit vervolgens het originele beeld. Gebruik vervolgens de minimum 3D-opdracht. Sluit vervolgens het maximum van C2-stacks synaps één beeld en selecteer het nieuw gemaakte
Overzicht
Dit artikel presenteert twee algoritmen voor beeldanalyse, "Drosophila NMJ Morfometrie" en "Drosophila NMJ Bouton Morfometrie," ontworpen om automatisch negen morfologische kenmerken van de Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ) te kwantificeren. De methodologie is bedoeld om het onderzoek naar NMJ-morfologie in verschillende ziektemodellen te vergemakkelijken.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurobiologie
- Beeldanalyse
- Synapse-ontwikkeling
Achtergrond
- De studie richt zich op de Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ).
- Het begrijpen van NMJ-morfologie is cruciaal voor het identificeren van regulatoren van synapsontwikkeling.
- Geautomatiseerde kwantificering verbetert de efficiëntie van morfologische analyse.
- Visuele demonstraties helpen bij het begrijpen van de methodologie.
Doel van het onderzoek
- Om algoritmen te ontwikkelen voor automatische kwantificering van NMJ-kenmerken.
- Om hoogdoorvoeranalyse van NMJ-morfologie mogelijk te maken.
- Om persoonlijke verschillen in kwantificering te verminderen.
Gebruikte methoden
- Beeldstacks van NMJ's werden gegenereerd en opgeslagen als TIFF-bestanden.
- Macro's werden gemaakt om het kwantificeringsproces te automatiseren.
- Gebieden van belang (ROI's) werden gedefinieerd voor NMJ-terminals.
- Automatische drempels en ruistolerantie-instellingen werden geoptimaliseerd voor nauwkeurige segmentatie.
Belangrijkste resultaten
- Nieuwe beeldbestanden met kwantitatieve metingen werden gegenereerd na analyse.
- Segmentati fouten werden geïdentificeerd en aangepakt door algoritme-aanpassingen.
- Optimale instellingen voor automatische drempels werden bepaald voor nauwkeurige kenmerkkwantificering.
Conclusies
- De ontwikkelde algoritmen verbeteren de analyse van NMJ-morfologie aanzienlijk.
- Automatische methoden leveren objectieve en reproduceerbare resultaten op.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verschillende ziektemodellen om synapsontwikkeling te bestuderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Automated, high-throughput quantification of synaptic morphology enables objective assessment of synaptic regulators in disease models, reducing variability and accelerating target validation in neurobiology. This approach supports predictive confidence by providing reproducible, multi-parametric readouts that clarify structure-function relationships at glutamatergic synapses. It addresses a key bottleneck in preclinical discovery where subtle morphological changes may be missed by qualitative methods, thereby improving mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying NMJ area, perimeter, bouton number, and active zones to assess synaptic integrity.
- Operational Value: Automates measurement of nine morphological features, reducing manual effort and increasing throughput for large-scale mutant or RNAi screens.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by detecting subtle morphological defects in disease models that may predict functional synaptic dysfunction.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative outputs (e.g., NMJ length, branch points) suitable for compound screening and dose-response analysis.
- Reproducibility: Uses Fiji-compatible macros with optimized thresholds and noise tolerance settings to ensure consistent segmentation across image sets.
- Scalability: Enables analysis of 50 synapses per hour, supporting platform reuse in discovery workflows requiring high-content imaging.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applied to mutant genotypes (e.g., ankyrin two, Rab3, high wire) to validate known synaptic defects, demonstrating utility in preclinical model characterization.
- Translational Continuity: Links morphological metrics (e.g., active zone count, branching) to synaptic function, supporting biomarker alignment in neurodevelopmental disorder models.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides objective morphometric thresholds to inform go/no-go decisions based on structural rescue or deterioration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by converting raw imaging data into quantifiable synaptic phenotypes that feed into lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via automated quantification of NMJ morphology to clarify gene function in synapse development pathways.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts (bouton number, NMJ area, active zones) enabling reliable compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates multi-parametric data (nine features) that allow statistical comparison across conditions and support data-driven prioritization.
- Translational Research: Connects structural NMJ metrics to functional outcomes in disease models, enabling continuity from discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Fiji-compatible macros represent a reusable imaging analysis capability applicable across multiple projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through objective, multi-parametric morphometric profiling.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across users and labs via macro-driven automation and defined threshold settings.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing quantification time per synapse (~15 minutes saved) and enabling larger cohort screening.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by identifying subtle morphological modifiers that may be missed in qualitative screens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and Fiji/ImageJ macro environments for proper setup and execution.
- Dependent on high-quality immunolabeled NMJ images (Dlg-1, Brp) with consistent staining and segmentation to avoid artifacts.
- Necessitates cross-team standardization of macro settings (rolling ball radius, auto thresholds, noise tolerance) for reproducible results across sites.
- Adaptation to other markers (Hrp, Csp, Syt) requires validation of signal specificity and threshold optimization per channel.
- Practical limitation: Segmentation errors (>5%) require iterative algorithm adjustment, adding setup time before large-scale deployment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
4:50
Macro Settings: Rolling Ball Radius Value and Auto-threshold
7:26
Macro Settings: Maxima Noise Tolerance Value, and Brp-puncta Thresholds
10:16
Results: Validating the Marco by Recapitulating Known NMJ Defects
11:38
Conclusion
1:03
Creating NMJ Images with Defined Features
