Name: Twee algoritmes voor High-throughput en multi-parametrische Kwantificering van Drosophila Neuromusculaire Junction morfologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Leer twee geautomatiseerde algoritmen voor high-throughput kwantificering van Drosophila neuromusculaire junctie-morfologie. Deze methode versnelt objectieve analyse van synapsontwikkeling in neurobiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij erkennen het Weense Drosophila Resource Center en Bloomington Drosophila voorraad centrum (NIH P40OD018537) voor het leveren van Drosophila stammen. Wij danken Jack Fransen uit de Microscopische Imaging Center voor deskundige ondersteuning in de beeldvorming. Deze studie werd ondersteund door VIDI en TOP-subsidies (917-96-346, 912-12-109) uit Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO), door twee DCN / Radboud Universitair Medisch Centrum PhD beurzen, door de Duitse mentale retardatie Network gefinancierd door de NGFN + programma van het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) en door het FP7 grootschalige geïntegreerde netwerk Gencodys van de Europese Unie (HEALTH-241.995) naar AS. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, het besluit te publiceren, of de bereiding van het manuscript.

1. Eisen Voorafgaand aan Beeldverwerking <ol><li> Voeren Drosophila open boek preparaten derde instar dwalen larven (L3), zoals eerder beschreven 19. </li><li> Co-immunolabel Drosophila NMJ terminals met een combinatie van twee markers: Dlg-1 of Hrp met Brp voor analyse &quot;Drosophila NMJ Morfologie&quot; en Syt of Csp met Brp voor analyse &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfologie&quot; 20. OPMERKING: Antilichamen van dezelfde soort kan worden gecombineerd door het voorafgaand merken van een met een antilichaam-conjugatiekit zoals Zenon Alexa Labeling Kits 17. </li><li> Afbeelding NMJ terminals behulp van een microscoop naar keuze, bijvoorbeeld fluorescentie (met of zonder apotome) of confocale microscopie. <ol><li> Het verwerven van een 2-kanaals afbeeldingsstapel van de NMJ terminal. <ol><li> Pas de microscoop instellingen op een wijze dat kanaal 1verwerft NMJ terminal immunologisch met Dlg-1 (of Hrp, Syt CSP) en het kanaal 2 NMJ terminal immunologisch met Brp. </li><li> Eventueel analyseren éénkanaals afbeeldingen (synapsen immunologisch met een antilichaam) met de macro&#39;s. Afbeelding NMJs immunolabeled op unieke wijze met Dlg-1 of Hrp voor analyse met &quot;Drosophila NMJ Morfometrie&quot; of Syt of Csp voor &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometrie&quot;. LET OP: Het is niet mogelijk om synapsen immunostained met enige anti-Brp analyseren. </li></ol></li><li> Exporteer de verkregen beelden als individuele&#39; .tiff bestanden. Keren de kanaalvolgorde voorafgaand aan het uitvoeren van de macro zoniet verkregen zoals aangegeven. </li></ol></li></ol> 2. Software en installatie <ol><li> Download de macro&#39;s: &quot;Drosophila NMJ Morfometrie&quot; en &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometrie&quot; van de volgende website: https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 21. </li><li> Beweeg de cursor naar de map &quot;Macro&#39;s update 1&quot;, en klik op de verschijning optie &quot;view&quot;. Een lijst met de inhoud van deze map zal verschijnen. De map bevat de macro&#39;s &quot;Drosophila NMJ Morfometrie&quot; en &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometrie&quot;. OPMERKING: De macro&#39;s zijn compatibel met Fiji-versies 1.4, die ook is voorzien in dezelfde map. De macro kan niet draaien op recente versies. Gelieve gebruik maken van de meegeleverde versie 1.4. Het is onproblematisch om deze versie te starten, zelfs op computers met een meer recent Fiji versie beschikbaar. </li><li> Klik op &quot;Download all&quot;. De inhoud van de map wordt gedownload naar de computer als een zip-bestand. Pak het gedownloade bestand. </li><li> Kopieer de Drosophila _NMJ_Morphometrics.ijm en Drosophila _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm bestanden naar Fiji.app/plugins/ directory. Bij het opnieuw opstarten van het programma, zal de macro&#39;s verschijnen aan de onderkant van de Pluginsdrop-down menu. </li></ol> 3. Run Sub-macro &quot;Converteren naar Stack&quot; to Z-projecties en Hyperstacks van de NMJ afbeeldingen te maken <ol><li> Start de grafische interface door het selecteren van Plugins in de werkbalk en kies &quot;Drosophila NMJ Morfometrie&quot; in het dropdown-menu. </li><li> Definieer de &quot;Unique File String&quot; instelling in de grafische interface van de macro&#39;s. LET OP: De microscoop software maakt gebruik van een identificatie handtekening aan vliegtuigen en kanalen te organiseren bij het opslaan van stapels als afzonderlijke&#39; .tiff bestanden. De ingevoerde unieke bestand tekenreeks instelling nodig heeft om de handtekening toegewezen door de software op het eerste vlak van het eerste kanaal te specificeren (belangrijk: laagste gebied en het kanaalnummer dient te worden aangegeven). </li><li> Selecteer alleen de sub-macro &quot;Convert te stapelen&quot; en klik op &quot;OK&quot; en selecteer de map waarin de beelden zich bevinden. Als een van de belangrijkste directory met meerdere submappen is geselecteerd, worden alle individuele&#39; tiff-bestanden binnende belangrijkste directory en submap die overeenkomen met de unieke bestandsnaam reeks criteria zal worden verwerkt. <ol><li> Als de z-stack slechts één kanaal bevat het selectievakje &quot;kanaal slechts 1&quot;. </li></ol></li><li> Merk op dat twee nieuwe bestanden NMJ afbeelding per standaard genoemd als stack_image_name en flatstack_image_name zal verschijnen. Bewaar alleen deze stack en flatstack voor verdere analyse. De .tiff file-serie kan worden verwijderd op dit punt, het minimaliseren van de benodigde opslagcapaciteit en het vermijden van mogelijke oorzaken van fouten. </li></ol> 4. Run Sub-macro &quot;Definieer ROI&quot; om de NMJ Terminal Interessante Baken <ol><li> Start de grafische interface van de &quot;Drosophila NMJ Morfometrie&quot;. </li><li> Selecteer alleen het selectievakje &quot;Definieer ROI&quot; en druk op &quot;OK&quot; en selecteer de belangrijkste directory waar de beelden recht flatstack_name worden opgeslagen en druk op &quot;Select&quot;. De sub-macro &quot;Definieer ROI&quot; automatisch doorzoekt alle submappenbinnen de geselecteerde belangrijkste directory. </li><li> Als de eerste projectie geopend, selecteert u de &quot;Freehand selecties&quot; tool in de werkbalk. Met behulp van de muis een selectie die uitsluitend bevat de complete NMJ terminal van rente te trekken en klik op &quot;OK&quot; in het venster &quot;Definieer terminal&quot;. De macro zal doorgaan met de volgende projectie. </li><li> Bakenen de volgende ROI en herhaal tot alle ROI&#39;s zijn gedefinieerd. De ROI image bestand met de naam &quot;roi_image_name&quot;, worden opgeslagen in dezelfde map als de eerder gegenereerde stack en projectie beelden voor elk van de bewerkte beelden. De uitgang van deze sub-macro is een binair beeld van de ROI in witte letters op een zwarte achtergrond. </li></ol> 5. Run Sub-macro &quot;Analyseren&quot; om NMJ Terminal Features kwantificeren <ol><li> Ga naar de werkbalk, selecteer &quot;Plugins&quot; en gebruik: &quot;Drosophila _NMJ_Morphometrics&quot; bij de analyse synapsen immunologisch met anti-Dlg-1 of anti-Hrp (kanaal 1) tezamenmet anti-Brp (2 kanalen) of &quot;Drosophila _NMJ_Bouton_Morphometrics&quot; bij de analyse synapsen immunologisch met anti-Syt of anti-Csp (kanaal 1) met Brp (kanaal 2). <ol><li> Wanneer men afbeeldingskanaal stacks te analyseren (de u-profiel Dlg-1 of HRP voor &quot;Drosophila_ NMJ_Morphometrics&quot; of Syt of Csp voor &quot;Drosophila _NMJ__Bouton_Morphometrics&quot;) het selectievakje &quot;kanaal slechts 1&quot;. </li></ol></li><li> Pas de schaal correspondeert met de beelden te analyseren. Als een pixel in het beeld correspondeert met 2,5 urn, geven Scale-Pixels = 1, schaal-afstand in um = 2,5. Indien beide instellingen gelaten op 0, de NMJ oppervlakte, omtrek, lengte en langste scheutlengtes wordt uitgedrukt in aantal pixels. </li></ol><ol start="3"><li> Pas indien nodig de standaard analyse instellingen van de macro. Voer aanpassingen alleen als de sub-macro &quot;Analyse&quot; (deze paragraaf met onbevredigende resultaten, en determined beter instellingen in hoofdstuk 6) heeft run geweest. </li><li> Vink de selectievakjes &quot;Analyse&quot; en &quot;Wacht&quot; en druk op &quot;OK&quot;. <ol><li> Selecteer de &quot;Wacht&quot; in te schakelen bij het uitvoeren van de sub-macro &quot;Analyseer&quot; op 2 kanaal. Anders fouten in actieve zone te tellen kan plaatsvinden vanwege de beperkte capaciteit computer. </li></ol></li><li> Als een nieuw venster &quot;Kies een Directory&quot; wordt geopend, selecteert u de map waar de afbeeldingen zich bevinden en druk op &quot;select&quot;. De macro zal analyseren van alle beelden die zijn opgeslagen in de belangrijkste directory en, indien van toepassing, de daaropvolgende mappen (met behulp van de drie bestanden van het uitvoeren van de vorige sub-macros: stack_image_name, flatstack_image_name en roi_image_name). De macro-processen elke afbeelding afzonderlijk en achter elkaar. Dit kan enkele minuten per beeld stack te nemen (afhankelijk van de computer capaciteit). </li><li> Na het uitvoeren van de macro, mee dat er een nieuw beeld bestand met de naam res_image_name voor elk geanalyseerd synaps opgeslagen zullen crea zijnted in de bovenliggende map te openen. De kwantitatieve metingen zullen worden opgeslagen als &quot;results.txt&quot; bestand. </li><li> Inspecteer alle resultaat afbeeldingen op te sporen en uit te sluiten van foto&#39;s met segmentatie fouten. Mogelijke segmentatie fouten worden beschreven in Tabel 3, samen met advies hoe de instellingen aan te passen om deze te omzeilen. Resultaatbeelden dergelijke segmentatie fouten als voorbeelden in figuur 4. OPMERKING: Bij het uitvoeren van de macro met de standaardinstellingen waargenomen in de user interface, er was een nauwkeurigheid van ongeveer 95% bij macro assessment werd vergeleken met handmatige evaluatie 17. </li></ol> 6. Stel de Macro-instellingen om de afbeeldingen <ol start="1"><li> Wanneer meer dan 5% van de beelden is segmentatie fouten laten zien, verken de verschillende algoritmes om te bepalen / kies de meest geschikte macro-instellingen voor de beelden. </li><li> Passen rollende bal straalwaarde LET OP: De rollende bal radiusfunctie trekt de achtergrond van het beeld. Deze functie is van cruciaal belang bij het werken met beelden die op fluorescentie microscopen en / of wanneer de beelden hebben een hoge achtergrondruis. Het aftrekken van de achtergrond zal helpen auto-drempelwaarden stappen van de macro om adequate segmentatie van de NMJ terminals te produceren. <ol><li> Selecteer drie NMJ Z-projecties (flatstack_image_name beelden gegenereerd door sub-macro &quot;Convert to stack&quot;) die representatief zijn voor het beeld dataset zijn. </li><li> In de werkbalk, selecteer Afbeelding | Kleur | Split kanalen. Twee beelden worden gemaakt, die een kanaal 1 en het andere kanaal 2. </li><li> Uitsluitend het beeld die tot 1 open kanaal, corresponderend met Dlg-1, Hrp, Syt of Csp immunokleuring en beeld Brp kanaal ontdoen door het sluiten van het beeld. </li><li> Voer het filter &quot;Aftrekken achtergrond&quot; door &quot;Process&quot; in de werkbalk gevolgd door &quot;Aftrekken Background ...&quot; in het dropdown-menu. </li><li> Klik op het voorbeeld checkbox in het popup-venster en stel de rollende bal radius op de waarde die het contrast tussen de synaps en de achtergrond toenemen als in het paneel (Figuur 5A). OPMERKING: Zie figuur 5 voor een voorbeeld. In Figure5A, delen van de synaps tonen dezelfde grijswaarden als achtergrond, terwijl in figuur 5A hierna &#39;rolling ball radius&#39; ingesteld op 500 genereert een sterke contrast tussen de synaps en de achtergrond. </li><li> Wanneer de juiste waarde voor de rollende bal radius is gedefinieerd, voert u de &quot;Aftrekken achtergrond&quot; algoritme van de geselecteerde Z-projecties met dezelfde rollende bal radius waarde en sla ze op (in welke directory). OPMERKING: De rollende bal radius van 8-bits of RGB afbeeldingen moeten tenminste even groot is als de straal van de grootste object in het beeld dat geen deel uitmaakt van het veld voor. 16-bits en 32-bits afbeeldingen de straal worden inversely evenredig met de beeldpuntwaarde bereik 22. </li></ol></li><li> Bepaal de verschillende auto-drempels die gebruikt zullen worden <ol><li> Open de Z-projecties opgeslagen in de vorige stap (6.2.6) en kies Afbeelding | Aanpassen | AutoThreshold | Probeer ze alle. </li><li> Als een binaire thresholded resultaat zal verschijnen met alle verschillende auto-drempel algoritmen, bepalen wat de meest geschikte algoritme voor de beelden. <ol><li> Bij het uitvoeren van de macro later, wijzigt de drempel in de macro-instellingen dienovereenkomstig. </li><li> Gebruik strengere drempelwaarden zoals &quot;RenyiEntrophy&quot; of &quot;momenten&quot; als de NMJ omtrek drempel en meer tolerante drempels zoals &quot;Li&quot; naar de NMJ skelet bepalen en &quot;Huang&quot; actieve zones bepalen. Wanneer beelden zijn zeer scherp met weinig tot geen achtergrond, gebruik &quot;Huang&quot; als&quot; NMJ outline drempel. Anders delen van de synaps zou kunnen missen nabeeld segmentatie. </li><li> Zie Figuur 5B een voorbeeld. Geschikte segmentatie van de synaps wordt verkregen met automatische drempels benadrukt door groene vakjes. Voorbeelden van geschikte niet-drempels door rood vakjes (raadpleeg synapsen bij sterke vergroting). In het laatste, ofwel delen van de synaps ontbreken of delen van de achtergrond opgenomen. Zie referentie 23 voor meer informatie. </li></ol></li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Bepaal de maximale grootte van de kleine deeltjes LET OP: Deze functie zal alle deeltjes gedetecteerd door de NMJ omtrek drempel en Skeleton drempel die kleiner zijn dan de gedefinieerde waarde in de &quot;kleine deeltjes instelling&quot; van de analyse zijn uit te sluiten. Deze waarde wordt in pixels. Deze functie dient als een ruisfilter en is zeer nuttig wanneer hoge niet-uniforme achtergrond (zoals kristallen / stof) aanwezig in de verkregen beelden zijn. <ol><li> Open de Z-projecties opgeslagen in stap 6.2.6. en stelde weegschaal aantal pixels via Analyse detecteren | Set Scale. Gelden de volgende instellingen: afstand pixels = 1, bekende afstand = 1, pixel aspect ratio = 1 eenheid lengte = pixel en druk op &quot;OK&quot;. Klik op de &quot;Oval selectie&quot; tool in de werkbalk. </li><li> Met behulp van de muis trek een selectie nauw rond enkele deeltjes die aanwezig zijn in de immunokleuring zijn, maar behoren niet tot de NMJ. Druk op Ctrl + m voor een Windows-gebruiker of cmd + m voor Mac-gebruikers. Een resultaat venster geopend, waarin de oppervlakte van het gekozen aantal pixels deeltjes. </li><li> Herhaal de vorige stap meerdere malen met verschillende artefacten in de beelden naar de grootste vervuilende deeltje / artefact gebied te bepalen. Dit zal de waarde in de instelling in te stellen bij het uitvoeren van de macro later. Bij het uitvoeren van de instelling &quot;kleine deeltjes Size&quot; als de kleinste deeltjesgrootte waargenomen pus een marge van 25% macro. </li><li> Zie Figuur 5D voor een voorbeeld. Het grootste kristal detecterened heeft een oppervlakte van 112 pixels. De instelling &quot;Kleine deeltjes grootte&quot;, bij het verwerken van dit beeld met de macro, moet worden ingesteld tot 125 - 150. </li></ol></li></ol><ol start="5"><li> Bepaal minimum bouton grootte LET OP: Deze functie zal alle boutons gedetecteerd door de NMJ omtrek drempel die kleiner zijn dan de gedefinieerde waarde uit de analyse zijn uit te sluiten. Deze waarde wordt in pixels. <ol><li> Volgt dezelfde stappen zoals beschreven in paragraaf 6.4, maar in dit geval trek een selectie rond het kleinste boutons in de NMJ terminal. Kies het kleinste oppervlakte die overeenkomt met het kleinste Bouton van de gemeten Ones. Dit is de waarde van het minimum Bouton grootte-instelling in te stellen bij het uitvoeren van de macro later. </li></ol></li></ol><ol start="6"><li> Definieer &quot;Find maxima noise tolerance&quot; waarde <ol><li> Gebruik de Z-hyperstacks geselecteerd in sectie 6.2.1. </li><li> In de werkbalk, selecteer Afbeelding | Kleur | Split kanalen om crea2 te bereiken (voor kanaal 1 en kanaal 2) en houdt het beeld dat overeenkomt met het Brp open goot. Gooi het andere kanaal te sluiten. </li><li> Ga naar het tabblad plugins in het pop-up menu, selecteer Process | Maximum (3D), en wanneer de maximum_image_name verschijnt (die kan een paar minuten duren), sluit het oorspronkelijke beeld stack. </li><li> Selecteer de maximale ... image_name (het verkregen beeld stack) en kies Plugins | proces | Minimum (3D), sluit de Maximum ... image_name stack. </li><li> In de werkbalk, selecteer Process | Vind maxima .... Een nieuw venster &quot;Find maxima ...&quot; wordt geopend. Klik op het selectievakje &quot;Preview punt selectie ...&quot; en vul de &quot;Noise tolerance&quot; doos met de standaard macro-instelling 50. De maxima punten in het beeld als kruisjes aangegeven. <ol><li> Verhoog de &quot;Noise tolerance&quot; prijs als de waarneming van een overmaat geannoteerde actieve zones, dus kruisingen die niet bovenop actieve zones die infocus op de gekozen stapel vliegtuig of onjuiste actieve zones die worden gedetecteerd op de achtergrond. <ol><li> Aan de andere kant, als observeren van onvolledig actieve zones geannoteerde, dwz actieve zones in focus niet wordt bestempeld herkend, verminderen de &quot;Noise tolerance&quot; waarde. Blijf proberen verschillende waarden volgen van deze procedure tot de kruisen op de juiste wijze actieve zones etikettering in focus. Vul het &quot;Find maxima noise tolerance&quot; met deze waarde. </li><li> Zie figuur 5C een voorbeeld. Te veel actieve zones worden gedetecteerd. In figuur 5C&#39; alleen de actieve zones in focus gedetecteerd. </li></ol></li></ol></li><li> Voer de sub-macro &quot;Analyseer&quot; in de representatieve beelden geselecteerd in stap 5.1, met de in de alle voorgaande stappen instellingen. </li></ol></li><li> Passen Brp-puncta onder- en bovengrens <ol><li> Merk op dat een nieuw bestand zal verschijnen nadat u de macro overeenkomstig stap 6,6, genaamd 2_active_zone_stack_image_name. In dit beeld stapel de werkzame zones van de &quot;Find maxima&quot; -functie gedetecteerd worden aangegeven met witte stippen in elk vlak. </li><li> Open dit bestand door te slepen en het in de werkbalk en kies Afbeelding | stapel | Zproject | Projectie type = Sum plakjes. Een projectie van de 2_active_zone_stack_image_name wordt verkregen. </li><li> Selecteer Afbeelding | Aanpassen | Drempel. Een nieuw venster &quot;Threshold&quot; wordt geopend. Schuif de bovenste balk met een drempelwaarde, waar alle gewenste brandpunten / Brp-positieve vlekken worden gevisualiseerd in het rood te kiezen. OPMERKING: Als de drempel te laag is ingesteld, zal een overmaat aan actieve zones worden geteld. Indien te hoog, zal een fractie van de werkzame zones worden gemist. <ol><li> Zie figuur 5E voor een voorbeeld. Als drempel wordt ingesteld op 400, zijn de meeste van de actieve zones (gesymboliseerd als 1 pixel foci) niet in de segmentatie, omdat ze niet in het rood (figuur 5E). Als drempelwaarde wordt ingesteld op een waarde van 50 de werkzame zones zijn rood (figuur 5E). </li></ol></li><li> Definieer deze waarde minimumdrempel. Laat &quot;Upper puncta drempel&quot; op de maximale waarde. </li><li> Voer de sub-macro &quot;Analyseer&quot; in de representatieve beelden met de in alle voorgaande stappen van deze sectie instellingen. Kritisch evalueren van het resulterende beeld bestanden en zorg ervoor dat de segmentatie naar behoren wordt gedaan. Indien dit niet het geval passen de instellingen voor de aard van de segmentatie fouten (figuur 4, tabel 3). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lin, Y. C., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+synapse+and+dendrite+maintenance+and+their+disruption+in+psychiatric+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).</li>
<li>van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+epigenetic+networks+in+intellectual+disabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities.</a> Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).</li>
<li>Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+vulnerability+of+synapses+and+circuits+associated+with+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders.</a> J Neurochem. 126, 165-182 (2013).</li>
<li>Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+dendritic+structure+on+firing+pattern+in+model+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons.</a> Nature. 382, 363-366 (1996).</li>
<li>Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+form+to+function%3A+calcium+compartmentalization+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).</li>
<li>Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+action+potentials+in+dendrites+depends+on+dendritic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology.</a> J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).</li>
<li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22, 383-388 (2012).</li>
<li>Mehnert, K. I., Cantera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+the+morphology+of+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila.</a> Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).</li>
<li>Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).</li>
<li>Ruiz-Canada, C., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+on+the+use+of+the+Drosophila+embryonic%2Flarval+neuromuscular+junction+as+a+model+system+to+study+synapse+development+and+function%2C+and+a+brief+summary+of+pathfinding+and+target+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).</li>
<li>Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).</li>
<li>Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gain-of-function+screen+for+genes+controlling+motor+axon+guidance+and+synaptogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila.</a> Curr Biol. 11, 417-430 (2001).</li>
<li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li>
<li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34, 729-741 (2002).</li>
<li>Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+suppressors+of+Drosophila+NSF2+neuromuscular+junction+overgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth.</a> Genetics. 170, 779-792 (2005).</li>
<li>Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highwire+restrains+synaptic+growth+by+attenuating+a+MAP+kinase+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal.</a> Neuron. 51, 57-69 (2006).</li>
<li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Fiji-Based+Algorithm+That+Systematically+Quantifies+Nine+Synaptic+Parameters+Provides+Insights+into+Drosophila+NMJ+Morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry.</a> PLoS Comput Biol. 12, e1004823(2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Dubos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+depletion+of+intellectual+disability+and+Parkinsonism+candidate+gene+ATP6AP2+in+fly+and+mouse+induces+cognitive+impairment+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration.</a> Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).</li>
<li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNijhof%2C+B+%22Drosophila+NMJ+Morphometrics%22">Drosophila NMJ Morphometrics</a>. , figshare 
 
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.
">https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.
</a> (2017).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+IJ+1.46%22">ImageJ User Guide IJ 1.46</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html</a> (2014).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+IJ+1.46%22">ImageJ User Guide IJ 1.46</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://fiji.sc/Auto_Threshold">http://fiji.sc/Auto_Threshold</a> (2014).</li>
<li>Pielage, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+presynaptic+giant+ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+of+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58, 195-209 (2008).</li>
<li>Koch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ankyrin+2+is+required+for+synaptic+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability.</a> Neuron. 58, 210-222 (2008).</li>
<li>Iqbal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+and+heterozygous+disruptions+of+ANK3%3A+at+the+crossroads+of+neurodevelopmental+and+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders.</a> Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).</li>
<li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).</li>
<li>Wan, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highwire+regulates+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Highwire regulates synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 26, 313-329 (2000).</li>
<li>Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+maturation+and+maintenance+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).</li>
<li>Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-type+specific+functions+of+DNT1%2C+DNT2+and+Spz+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PLoS One. 8, e75902(2013).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

&quot;Drosophila NMJ Morfometrie&quot; en &quot;Drosophila NMJ bouton Morfometrie&quot; zijn krachtige instrumenten voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de evaluatie van synaps morfologie. Handmatige evaluatie van NMJ parameters omslachtig; wordt geschat dat de macro&#39;s een ervaren onderzoeker zou besparen tot 15 min / NMJ besteed aan handmatige afbeelding segmentatie. Met 1-2 tientallen synapsen geëvalueerd per aandoening of genotype, vat dit al snel tot aanzienlijke hoeveelheden opgeslagen tijd, zelfs in kleinschalige studies. Bij het uitvoeren van grote schermen, de versterking van het gebruik van high throughput analyse, in vergelijking met handmatige beoordeling en kwantificering, kan enorm zijn. Naast de toegenomen doorvoer macro&#39;s bieden gemakkelijk objectieve analyse; ze sluiten persoonlijke vooroordelen die anders verblind experimenten en interpersoonlijke verschillen die optreden wanneer meerdere onderzoekers die betrokken zijn bij de analyse vereisen. Ten slotte is de macro&#39;s zorgen voor een gevoelig en nauwkeurig eenALYSE NMJ kenmerken, waardoor de identificatie van synaptische regulatoren die leiden plaats subtieler dramatische NMJ gebreken en tot nu toe gebleven ondergewaardeerd door het oog van de onderzoeker. Gedetailleerde informatie over de validatie procedures en de algoritmes gebruikt in de macro&#39;s zijn te vinden in de publicatie Nijhof et al. 17. De functionaliteit van de macro&#39;s is gevalideerd om adequaat te meten morfologische kenmerken van Drosophila melanogaster NMJs bij spier 4. Vervolgens werd aangetoond dat de macro&#39;s waren ook geschikt voor synapsen naar andere spieren te analyseren in dit organisme. Het is waarschijnlijk dat de macro kan ook worden gebruikt om morfologische parameters van NMJ met gelijke opbouw in andere soorten, met inbegrip van andere soorten Drosophila en andere insecten te meten. Zelfs NMJs heel ver in de evolutie, bijvoorbeeld NMJs van muizen, tonen een vrij gelijkaardig structurele conformatie 29. De macro&#39;s zijn niet getest op NMJ preparaten uit andere soorten, maar potentiële gebruikers worden aangemoedigd om de macro&#39;s te testen voor dergelijke doeleinden. Het is zeer belangrijk dat de gebruiker de verschillende auto-drempels en algoritmes verkent te definiëren / kies de meest geschikte macro-instellingen voor de beelden. Met deze instellingen wordt een nauwkeurigheid van ongeveer 95% bereikt wanneer macro assessment werd vergeleken met handmatige beoordeling. de macro-instellingen aan te passen aan de juiste segment 100% van de beelden kan een zeer moeizaam of zelfs onmogelijk procedure. Daarom wordt de uitsluiting van de beelden niet goed gesegmenteerd aanbevolen als hun aantallen lager zijn dan 5%. Blijkbaar, als de kwaliteit van de beelden is laag, de macro&#39;s zullen hogere verhoudingen van onbevredigende segmentatie te genereren. Lage kwaliteit beelden zullen op dezelfde manier beïnvloeden handmatige evaluatie en kan daarom niet worden gekoppeld aan de prestaties van de macro&#39;s. Toch de macro&#39;s zijn nogal robuust als ze zijn ontworpen voor hetTussen gegenereerd op een hoog gehalte microscoop (een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop die beeldvorming van grote aantallen monsters mogelijk maakt) 17. Een kritisch punt is dat de gebruiker visueel inspecteert alle resultaat beelden gegenereerd door de macro&#39;s. Dit zal toelaten op te sporen en uit te sluiten van foto&#39;s met onbevredigende segmentatie. In hoofdstuk 6 van dit protocol, wordt de gebruiker geleid hoe u de instellingen voor het correct beeld segmentatie aan te passen bij het uitvoeren van de sub-macro &quot;Analyseren&quot;. Om snel vertrouwd te maken met de eisen van de macro&#39;s en hoe de macro-instellingen een map met de naam &quot;Examples_adjusting macro-instellingen&quot; aan te passen is opgenomen in de macro repository https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Dertien submappen, elk met voorbeelden beelden verkregen op verschillende platforms microscoop (hoog gehalte / confocale / fluorescentie microscopen) en verschillende immunokleuring, voorzien. Een PDF getiteld “Voorbeelden gids” is opgenomen in dezelfdemap waar die nodig zijn voor elk voorbeeld instellingen worden voorzien, samen met een tekstdocument het verstrekken van de verwachte resultaten en de resultaten images. De macro&#39;s zijn ontworpen om afbeeldingen die zijn opgeslagen te verwerken als .tiff gescheiden bestanden, toch sommige gebruikers misschien hebben hun foto&#39;s in een ander formaat opgeslagen. De volgende website https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 bevat een map met de naam &quot;Drosophila NMJ&quot; waar drie voorbeeld-bestanden (Voorbeeld 1-3) en het document &quot;Voorbeelden Guide&quot; met gedetailleerde instructies hoe beelden in de macro importeren zo niet als .tiff gescheiden bestanden die zijn opgeslagen kan ook worden gevonden in dezelfde map. Together, &quot;Drosophila NMJ Morfometrie&quot; en &quot;Drosophila NMJ bouton Morfometrie&quot; macro&#39;s te kwantificeren tien verschillende NMJ kenmerken: NMJ gebied, NMJ perimeter, aantal boutons, NMJ Bouton gebied, NMJ lengte, NMJ langste tak lengte, het aantal islaNDS, aantal vertakkingen, het aantal vertakkingspunten en het aantal actieve zones. Dit zorgt voor een groot voordeel ten opzichte van tot nu toe beschikbare tools die slechts één of enkele synaptische functies 30, 31 kunnen beoordelen. Multiparametrische kwantitatieve analyse draagt een groot potentieel voor nieuwe ontdekkingen, bijvoorbeeld om nieuwe regulatoren die een tot vele aspecten van de synaps biologie controle te identificeren. Het biedt ook de vereiste resolutie van genen die precies coregulate dezelfde of overlappende NMJ kenmerken en dus zal rijden op gemeenschappelijke moleculaire pathways bepalen. Tenslotte opent de mogelijkheid om te onderzoeken hoe verschillende synaptische parameters correleren met elkaar onverstoorde staat 17 en welke genen zorgen deze gecoördineerde morfometrische correlaties. Bij elkaar genomen, dit protocol laat zien hoe u de twee macro&#39;s gebruiken &quot;Drosophila NMJ Morfometrie&quot; en&quot;Drosophila NMJ Bouton Morfologie&quot;, die objectief en gevoelige kwantificatie van tien morfologische NMJ functies uitvoeren in een high-throughput manier.

Cognitieve stoornissen zoals verstandelijke beperking, autisme spectrum stoornis en schizofrenie worden vaak gekenmerkt door abnormale synaptische functie 1, 2, 3. Synaps morfologie en functie zijn nauw verweven; morfologische defecten synaptische defecten veroorzaken en, omgekeerd, zullen afwijkende synaptische transmissie beïnvloeden synaptische rijping en morfologie 4, 5, 6. Een aantal model organismen zijn gebruikt om beter te begrijpen synaps biologie en licht werpen op hoe synaptische wijzigingen van invloed zijn hersenfunctie bij gezondheid en ziekte 7, 8, 9. De Drosophila NMJ is een uitgebreid bestudeerd en gevestigde in vivo model voor glutamaat synapse biologie 10, 11. In de afgelopen decennia is dit model gebruikt voor fysiologische en gen gerichte studies, alsook voor grootschalige genetische screens, teneinde morfologische verschillen tussen NMS detecteren. In het bijzonder naar voren genetische screens veel cruciale regulatoren en de mechanismen die ten grondslag liggen synaps ontwikkeling geïdentificeerd en de functie 12, 13, 14, 15, 16. De meeste van deze schermen gebruikt visuele beoordeling van NMJ terminal morfologie en kwalitatieve detectie van de synaptische afwijkingen of semi-kwantitatieve scoring van enkele morfologische kenmerken. Dientengevolge zijn vrij subtiel synaptische morfologische abnormaliteiten die niet duidelijk voor het blote oog gemakkelijk gemist. Om te kunnen kwantitatieve verschillen en is uitgebreid op te sporenNMJ moet nauwkeurig worden geëvalueerd door een systematische kwantificering van de morfologische parameters van belang. Het meten van NMJ functies handmatig is omslachtig, vooral wanneer er meerdere NMJ kenmerken van rente en / of bij het uitvoeren van grootschalige genetische screenings. Om multiparametrische, high-throughput morfologische analyses ondersteunen en objectieve kwantificatie te bereiken twee macros &quot;Drosophila NMJ Morfologie&quot; en &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfologie&quot; ontwikkeld 17. Beide macro&#39;s worden uitgevoerd in de open source software voor beeldanalyse Fiji 18, en kan kwantificeren zowel confocale en nonconfocal beelden. &quot;Drosophila NMJ Morfologie&quot; maatregelen NMJ terminals immunostained de postsynaptische markeurschijf large-1 (Dlg-1) of het presynaptische mierikswortelperoxidase (HRP), co-gelabeld met de actieve zone marker bruchpilot (Brp). Het kwantificeert negen morfologische Parameters (hieronder verder beschreven) NMJ gebied NMJ omtrek aantal boutons, NMJ lengte NMJ langste tak lengte, aantal eilanden, aantal vertakkingen, het aantal vertakkingspunten en het aantal actieve zones in de synaptische terminal (figuur 1) . Hoewel een algoritme voor het bepalen van het aantal boutons aanwezig is in deze macro, het niet voldoen aan de criteria voor de nauwkeurigheid 17. Het aantal boutons goed te kunnen beoordelen, is het noodzakelijk om de &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfologie&quot; macro die speciaal is ontworpen om boutons behulp NMJ preparaten immunologisch gekleurd met anti-synaptotagmin (Syt) of anti-cysteïne snaar proteïne (CSP) kwantificeren gebruiken, en co-immunologisch met Brp. De &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfologie&quot; macro meten van de volgende parameters: aantal boutons, NMJ bouton gebied NMJ lengte NMJ langste tak lengte, aantal eilanden, aantal vertakkingen, het aantal vertakkingspunten en het aantal actieve Zones (Figuur 2). Macro&#39;s bestaan uit 3 sub-macros: (I) &quot;Convert stapelen&quot; identificeert alle beschikbare beeldbestanden en creëert Z-hyperstacks en maximale intensiteit projecties van beide kanalen. Als output zal deze macro twee nieuwe bestanden per synaps genaamd &quot;stack_image_name&quot; en &quot;flatstack_image_name&quot; te genereren. II) &quot;Definieer ROI&quot; opeenvolgend open alle maximale projectiebeelden &quot;flatstack_image_name&quot; en reiken het verzoek het interessegebied (ROI) waarin de specifieke synaptische terminal plaats aanwezig is handmatig opgeven. Dit werd uitgevoerd om uitsluiting van synapsen verbinden met aangrenzende spieren en / of andere vormen van synaptische terminals (bijvoorbeeld 1 s) die aanwezig kunnen zijn in de beelden 11 toe. (III) &quot;Analyze&quot; geldt volledig geautomatiseerde analyse om alle delen van de beelden binnen de grenzen van de ROI. Als&quot;Results.txt&quot; waar alle numerieke meting geannoteerd en &quot;res_image_name.tif&quot; wanneer de onderliggende segmentatie door de macro worden toegelicht: Door deze stap wordt de gebruiker beide bestanden te plaatsen. Tijdens beeldanalyse drie structuren zijn afgeleid van elk synaptische terminal: de NMJ overzicht, de NMJ skelet en het aantal Brp-positieve actieve zones. De NMJ omtrek wordt gebruikt om de NMJ stippellijn de omtrek te bepalen en een daaropvolgende afscheiding keerpunt biedt het aantal boutons. Uit het skelet worden vijf NMJ kenmerken afgeleid: de totale NMJ lengte, de som van de lengte van het langste pad dat twee eindpunten (langste scheutlengtes), het aantal niet-verbonden compartimenten per NMJ (aangeduid als &quot;eilanden&quot; ), het aantal vertakkingen en het aantal vertakkingspunten (een aftakpunt verbindt drie of meer vertakkingen). Het aantal actieve zones wordt bepaald in de Brp-kanaal door het tellenBRP-positieve vlekken. De geannoteerde NMJ omtrek (gele lijn), de NMJ skelet (blauwe lijn) en het aantal Brp-positieve actieve zones (aangegeven met witte foci) worden in een resultaat beeld en de metingen van de parameters worden bewerkt om een ​​(. txt) uitvoerbestand (figuur 3). Drosophila NMJ Morfometrie&quot; en &#39;Drosophila NMJ Bouton Morfometrie&#39; werden voor het eerst beschreven en uitgebreid gevalideerd door Nijhof et al. 17. Dit handschrift richt zich op de methodologie om NMJ morfologie te analyseren met behulp van de macro&#39;s &#39;Drosophila NMJ Morfometrie&#39; en &#39;Drosophila NMJ Bouton Morfometrie&#39;. niettemin, voorafgaand aan macro-ondersteunde analyses NMJ ontledingen en immunokleuring uitgevoerd moeten worden. Dit zijn essentiële stappen, en de combinatie van merkers voor immunohistochemie moet geschikt macro analyses worden. Deze stappen worden kort vermeld in sectie 1 van het protocol en richt de gebruiker referenties beschrijven in detail de protocollen voor deze procedures uit te voeren.

<table><tbody><tr><td>Immunostaining</td><td></td><td></td><td>Verdunning</td></tr><tr><td>Muis anti-discs large 1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AFFN-DLG1-4D6</td><td>1/25 (geconjugeerd met behulp van de Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)</td></tr><tr><td>Konijn anti-horseradish peroxidase</td><td>Jackson IR</td><td>323-005-021</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Konijn anti-Synaptotagmin</td><td>Gift van Hugo Bellen</td><td></td><td>Jan-00</td></tr><tr><td>Muis anti-Cysteine string protein</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>DCSP-1(ab49)</td><td>1/10 (geconjugeerd met behulp van de Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)&nbsp;</td></tr><tr><td>Muis anti-Bruchpilot</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Jan-50</td></tr><tr><td>Geit anti-muis Alexa Fluor 488</td><td>Life technologies</td><td>A11029</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Geit anti-konijn Alexa Fluor 568</td><td>Life technologies</td><td>A11011</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 568 Muis IgG1 Labeling Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Z25006</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Materiaal</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop of fluorescentiemicroscoop</td><td>Leica SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio imager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Mac of Pc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiaal</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

twee algoritmes voor high-throughput en multi-parametrische kwantificering van<em&gt; drosophila</em&gt; neuromusculaire junction morfologie

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptische morfologie nauw gerelateerd aan synaptische werkzaamheid en vaak morfologische afwijkingen synaps uiteindelijk tot synaptische defecten. De Drosophila larvale neuromusculaire junctie (NMJ), een gevestigde model voor glutamaat synapsen, is uitgebreid bestudeerd voor decennia. Identificatie van mutaties die NMJ morfologische gebreken bleek een repertoire van genen die synaps ontwikkeling en functie te reguleren. Veel van deze werden geïdentificeerd in grootschalige studies die gericht zijn op de kwalitatieve aanpak van morfologische afwijkingen van de Drosophila NMJ detecteren. Een nadeel van kwalitatieve analyses is dat veel subtiele spelers dragen tot NMJ morfologie waarschijnlijk onopgemerkt. Overwegende dat de kwantitatieve analyses zijn nodig om de subtielere morfologische verschillen op te sporen, zoals analyses zijn nog niet vaak uitgevoerd, omdat ze zijn omslachtig. Dit protocol beschrijft uitvoerig twee beeldanalyse algoritmen &quot;Drosophila </em&gt; NMJ Morfometrie&quot; en &#39;Drosophila NMJ Bouton Morfometrie&#39;, verkrijgbaar als Fiji-compatibel macro&#39;s, voor de kwantitatieve, nauwkeurige en objectieve morfometrische analyse van de Drosophila NMJ. Deze methodiek is ontwikkeld om NMJ terminals immunolabeled met de meest gebruikte markers analyseren Dlg-1 en . brp Daarnaast zijn ruimere toepassing op andere merkers zoals Hrp CSP en Syt wordt in dit protocol macro&#39;s kunnen negen morfologische NMJ eigenschappen bepalen. NMJ gebied NMJ omtrek aantal boutons, NMJ lengte NMJ langste tak lengte, aantal eilanden, aantal vertakkingen, het aantal vertakkingspunten en het aantal actieve zones in de NMJ terminal.

Twee beeldanalyse algoritmen, &quot;Drosophila NMJ Morfologie&quot; en &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfologie&quot; zijn gemaakt, automatisch kwantificeren negen morfologische kenmerken van de Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ).

Twee algoritmes voor High-throughput en multi-parametrische Kwantificering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromusculaire Junction morfologie

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Het algemene doel van deze procedure is om morfologische kenmerken van de Drosophila-neuromusculaire junctie automatisch te kwantificeren met behulp van macros voor morfometrische software. Deze methode kan helpen bij het identificeren van regulatoren van synapsontwikkeling, een belangrijke vraag in de neurobiologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de automatische kwantificering van meerdere NMJ-kenmerken.Dit maakt objectieve analyse van NMJ-morfologie op grote schaal mogelijk. We besloten deze methodologie te ontwikkelen om NMJ-morfologie in een groot aantal ziektemodellen te onderzoeken. We dachten na over manieren om hun persoonlijke verschillen te voorkomen en om het kwantificeringsproces aanzienlijk te versnellen.Visuele demonstratie van deze methode is erg nuttig. Geschikte macro-instellingen zijn cruciaal en sommige stappen kunnen moeilijk zijn voor nieuwe gebruikers, vooral als ze niet bekend zijn met VT-software. Voor dit protocol genereert u beeldstacks van NMJ's en slaat u deze op als individuele TIFF-bestanden, waarbij kanaal één DLG1-kleuring, of een soortgelijke marker, toont en kanaal twee BRP-kleuring toont.Om te beginnen, maakt u C-projecties en hyperstacks van de NMJ-beeldbestanden. Open de plugin-opties en selecteer Drosophila NMJ Morphometrics. Identificeer nu de unieke bestandsstring die de microscoop aan de beeldserie heeft toegewezen bij het opslaan als TIFF.Dit zal aan het einde van de beeldnaam staan. Kopieer en plak de gegeven string naar het laagste vlak en het kanaalnummer in het unieke bestandsstring-instellingsvenster. Selecteer vervolgens de submacro convert to stack en kies de directory of map waar de afbeeldingen zich bevinden.Voor elk beeldbestand worden twee nieuwe bestanden gemaakt met de standaardnamen stack en flat stack, gevolgd door de originele beeldnaam. De originele bestanden kunnen vervolgens worden verwijderd om opslagruimte te besparen. Selecteer vervolgens vanuit de Drosophila NMJ Morphometrics-interface de submacro definieer ROI en kies de directory van het beeldbestand.Zodra de eerste projectie opent, selecteert u het gereedschap voor vrije selectie. Gebruik vervolgens de muis om een gebied te definiëren dat een complete NMJ-terminal van belang bevat. Klik eenmaal geselecteerd op OK in het venster voor het definiëren van de terminal.Ga hiermee verder totdat de NMJ-terminals in alle projecties zijn gedefinieerd. De macro zet het proces automatisch voort. Voor elk beeldbestand wordt één nieuw bestand gemaakt met de standaardnamen ROI gevolgd door de originele beeldnaam.Om de NMJ-kenmerken te kwantificeren, gaat u eerst naar de Drosophila NMJ Morphometrics-interface en stelt u de schaal in. Als bijvoorbeeld één pixel in het beeld overeenkomt met 0,72 micrometer, stelt u de schaalpixels in op één en de schaalafstand op 0,072. Selecteer vervolgens de submacro analyseer en schakel, als er twee kanaalbeelden zijn, ook gewicht in.Druk op OK en selecteer, wanneer gevraagd, de directory van het beeldbestand. De verwerkingstijd kan enkele minuten per synaps zijn. Na de analyse worden nieuwe beeldbestanden voor elke geanalyseerde synaps opgeslagen in de oudermap en zijn de kwantitatieve metingen de resultaten.txt-bestand. Inspecteer alle beelden en sluit foto's met segmentati fouten uit. Bijvoorbeeld, delen van de synaptische terminal mogen niet in de gele omtrek zijn opgenomen.Delen van de achtergrond kunnen in de synaptische terminal zijn opgenomen. Een blauwe skeletlijn kan zich uitstrekken voorbij de synaptische terminal. Er kunnen te veel actieve zones zijn, of sommige actieve zones kunnen onopgemerkt blijven.Als meer dan 5% van de beelden segmentati fouten hebben, onderzoek verschillende analysealgoritmen om de beeldverwerking te verbeteren. De komende video-onderdelen beschrijven hoe u veel van deze macro-analyse-instellingen kunt definiëren. Om de waarde van de rolling ball radius voor de macro aan te passen, selecteert u drie NMJ Z-projecties die representatief zijn voor de beeldgegevensset.Verwijder de naam van het resultatenres-beeld en de naam van het stack-bestand met twee actieve zones, eerder gemaakt door de submacro analyseer. Open de stack-bestandsnamen voor elk geselecteerd beeld en selecteer vervolgens in de werkbalk kanalen splitsen om een afbeelding van kanaal één en een afbeelding van kanaal twee te maken en sla deze bestanden op. Open het beeld dat behoort bij kanaal één, wat in dit geval overeenkomt met DLG één immunolabeling.Voer nu het filter achtergrondraduktie uit, dat onder het tabblad proces te vinden is. Stel de rolling ball radius in op een waarde die het contrast tussen de synaps en de achtergrond verhoogt. Maak een Z-projectie met een projectietype als max intensiteit en sla het beeld op.Voer vervolgens de achtergrondraduktie-algoritme uit met de nieuwe rolling ball radius op alle Z-projecties en sla de resultaten op. Om de beste automatische drempels voor de macro te bepalen, opent u de opgeslagen C-projecties en voert u automatische drempel in met de optie alles proberen. Vind uit de resulterende beelden de meest geschikte algoritme voor de beelden en ga verder met het gebruik van die drempelinstelling bij het uitvoeren van de macro voor verdere beelden.Het definiëren van de verschillende automatische drempels is cruciaal voor correcte beeldsegmentatie door de macro. Om deze reden is het belangrijk om vertrouwd te zijn met de 16 automatische drempelopties die de software biedt om acht van de signageparameters correct te kwantificeren. Druk op de plus-knop om in te zoomen op het resultaatbeeld van de automatische drempel.De algoritmenamen bevinden zich onder elk resultaatbeeld. In dit voorbeeld is de beste automatische drempelalgoritme voor de instelling NMJ-omtrekdrempel Huang. Voor de skeletdrempel is de beste instelling Li en de beste instelling voor de actieve zonedrempel is Huang.Om de fijne maxima-ruistolerantiewaarde voor de macro te definiëren, keert u terug naar de oorspronkelijke representatieve NMJ-beelden. Open het BRP-kanaal. Ga naar het tabblad plugins in het pop-upmenu en selecteer maximum 3D.Na een korte tijd zal een nieuw beeld verschijnen, sluit vervolgens het originele beeld. Gebruik vervolgens de minimum 3D-opdracht. Sluit vervolgens het maximum van C2-stacks synaps één beeld en selecteer het nieuw gemaakte

two-algorithms-for-high-throughput-multi-parametric-quantification

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

De Drosophila neuromusculaire verbinding (NMJ) wordt gebruikt als model om de morfologie en functie van synapsen te bestuderen. Deze video beschrijft belangrijke kenmerken die onderzoekers kwantificeren om de NMJ te karakteriseren. Het voorbeeldprotocol demonstreert een software die de kwantificering automatisch kan uitvoeren.

Drosophila Neuromusculaire junction (NMJ) kwantificering: een methode om synaptische morfologie en functie te beoordelen

Morfologie, grootte en locatie van intracellulaire organellen zijn evolutionair geconserveerd en lijken hun functie direct te beïnvloeden. Het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze processen is een belangrijk doel geworden van de moderne biologie. Hier laten we zien hoe deze studies kunnen worden vergemakkelijkt door de toepassing van kwantitatieve technieken.

Waarom kwantificering Matters: karakterisering van fenotypes bij de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction

Hier beschrijven we een eenvoudige en breed toegankelijke methode om segmentale zenuwen in Drosophila larven te beschadigen om neurodegeneratie van motorische neuronen bij de neuromusculaire verbinding (NMJ) van derde instar larven te visualiseren en te kwantificeren.

Een eenvoudige neurologische mechanische letselmethode om te bestuderen<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

Het vermogen om neuromusculaire verbindingscomponenten nauwkeurig te detecteren is cruciaal bij het evalueren van wijzigingen in de architectuur vanwege pathologische of ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we een volledige beschrijving van een eenvoudige methode om hoogwaardige beelden te verkrijgen van neuromusculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve metingen uit te voeren.

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

We beschrijven een dissectietechniek die de architectuur van de neuromusculaire overgang behoudt en een gedetailleerde immunocytochemische studie van motorneuronen in het volwassen Drosophila-been mogelijk maakt.

Dissectie en immunohistochemie van het Drosophila adult been om veranderingen op de neuromusculaire overgang voor een geïdentificeerd motorneuron te detecteren

Dit protocol beschrijft een methode voor morfometrische analyse van neuromusculaire juncties door gecombineerde confocale en STED-microscopie die wordt gebruikt om pathologische veranderingen in muismodellen van SMA- en ColQ-gerelateerd CMS te kwantificeren.

Karakterisering van neuromusculaire juncties bij muizen door gecombineerde confocale en superresolutiemicroscopie

Dit rapport biedt een nieuwe procedure voor de voorbereiding van monsters voor het visualiseren van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven . Deze methode is effectiever in het voorkomen van het krullen van de monsters in vergelijking met de traditionele methode en is met name nuttig voor de ultrastructurele analyse van de neuromusculaire junctie van Drosophila .

Optimalisatie van het monstervoorbereidingsproces voor transmissie-elektronenmicroscopie van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.

Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren

Lokale injecties van een mitochondriale kleurstof, labelen terminale Schwann-celmitochondriën in vivo voor confocale microscopie. Deze methode maakt gebruik van proof of concept aangetoond in skeletspierweefsel van muizen met gezonde of zieke spieren om een hoogresolutie mitochondriale visualisatie te bieden.

Methoden voor in situ kwantificering van mitochondriale morfologie in spier- en terminale Schwann-cellen van muizen

Leer twee geautomatiseerde algoritmen voor high-throughput kwantificering van Drosophila neuromusculaire junctie-morfologie. Deze methode versnelt objectieve analyse van synapsontwikkeling in neurobiologisch onderzoek.

Twee algoritmes voor High-throughput en multi-parametrische Kwantificering van

Meer video's verkennen