Name: Langdurige incubatie van Acute neuronaal weefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Leer een methode voor langdurige incubatie van acuut neuronweefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging. Deze techniek behoudt weefselviabiliteit meer dan 24 uur en vermindert het aantal benodigde dieren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Colin Symons en James Wright voor technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door een seed funding grant (WSU) aan Y.B. en het innovatiebureau van Western Sydney University. M.C. wordt ondersteund door een ARC fellowship (DECRA).

De onderstaande protocol beschrijft de bereiding van C57BL / 6 en C3H / He (retinally ontaarden) muis neuronaal weefsel, maar soortgelijke technieken kunnen worden toegepast op andere soorten. Alle dieren waren gezond en behandeld met standaard condities van temperatuur, vochtigheid, 12 uur licht / donker-cyclus, vrije toegang tot voedsel en water, en zonder enige bedoeling van stress stimuli. Alle experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met Western Sydney University Dierverzorging en ethische commissie en op basis van het gebruik van dieren en richtlijnen zorg (Animal Research Authority # A9452, # A10396 en # A8967). 1. Brain Slice Voorbereiding <ol><li> Verdoven het dier door inhalatie van isofluraan (5%) en onthoofden met een knaagdier guillotine. Verwijder de hersenen snel, zoals eerder beschreven 9 en plaats deze in ijskoude fysiologische oplossing (aCSF) bevattende (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCI, 1 MgCl2, 1,25 NaH 2PO 4, 2 CaCl2, 25NaHCO3, 25 dextrose, en verzadigd met carbogeen (95% O2 / 5% CO 2 mengsel, 310 mOsm, pH 7,4). </li><li> Snijd de hersenen plakjes, in de regio van belang, 300 micrometer dik met een trillende microtoom. </li><li> Transfer plakken naar een custom-built incubatiesysteem die nauw bewaakt en controleert pH-waarden (pH 7,2-7,4), carbogen flow, en de temperatuur zoals eerder beschreven 10, 11. </li><li> Stel aanvankelijke kamertemperatuur tot 35 ° C gedurende 15-30 min en vervolgens langzaam verlagen tot 15-16 ° C zoals getoond in figuur 1C. incubeer daarna segmenten in het incubatiesysteem totdat het nodig is, hetzij voor elektrofysiologie en beeldvorming. LET OP: Als plakjes worden om te worden gebruikt voor het calcium-imaging, volgt u onderstaande stappen voor het koelen van het weefsel onder de RT. </li></ol> 2. retinale Wholemount Voorbereiding en Inner grensmembraan Removal <ol><li> Bereid retinale wholemounts onder zowel normalelaboratorium lichtomstandigheden of donker rood / infrarood licht. </li><li> Euthanaseren van dieren door cervicale dislocatie en meteen ophelderen ogen. Maak een kleine snede langs de ora serrata, en plaats in een van beide Ames media, of aCSF bevatten (mm): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glucose, 0,5 L-glutamine, en verzadigen met carbogeen (95% O2 / 5% CO 2 mengsel; ~ 300 mOsm; pH 7,4) bij kamertemperatuur. </li><li> Onmiddellijk verwijderen van het hoornvlies, de lens en het glasvocht door te snijden langs de ora serrata met een kleine schaar en het verwijderen van de lens en het glasvocht met een pincet. Plaats weefsel in het incubatiesysteem bij KT. OPMERKING: Retinale weefsel kan worden gehandhaafd in de oogschelp na langzame temperatuurverlaging tot 15-16 ° C, gedurende&gt; 24 uur bij het incubatiesysteem totdat het nodig is. </li><li> Om het ILM te verwijderen, de overdracht van de eye-cup met het netvlies van een kleine glazen pot met 30 U / ml papaïne, 1 mM L-cystine, 0,5 mM EDTA en 0,005% DNase in Earl&#39;s-Balanced Salt Solution (BSS) bij 37 ° C gedurende 20 min. Toepassen 95% O2 / 5% CO 2 aan de oplossing door het deksel maar niet bubble. Bij gebruik van weefsel van jonge dieren (&lt;6 weken), vul de oplossing van halve sterkte. <ol><li> Stop enzymatische digestie, door het plaatsen van het weefsel in een ovomucoïde (10 mg / ml) en BSA (10 mg / ml) gedurende 10 min in Earl&#39;s BSS. Wassen weefsel grondig met aCSF vóór de overdracht naar het incubatiesysteem en vermindering temperatuur 15-16 ° C. </li></ol></li><li> Handhaving van retinale weefsel in de eye-cup totdat het nodig is. Voor overdracht naar de microscoop, isoleren het netvlies van de oogschelp en in 4 stukken gesneden met een scheermesje. Als de gehele retina wordt vereist, maakt vier kleine sneden in de periferie van het netvlies om deze te plat. LET OP: Voor grafische experimenten, lading met calcium-kleurstoffen vóór de overdracht naar de incubatie-systeem, zie hieronder. </li></ol> 3. Handhaving van weefsel in de Incubator <ol><li&gt; Plaats weefsel in de belangrijkste kamer die probes voor pH- en temperatuurmetingen (Figuur 1A, B). </li><li> Circuleren aCSF via een tweede kamer (UVC kamer, gebouwd zoals eerder beschreven 12) gescheiden van de hoofdkamer en blootgesteld aan 1,1 W UVC-licht (254 nm, 5W / 2P sterilisator UV lamp) om bacteriën zwevend in de oplossing uitstralen (fig 1A). Controle UVC licht timing via een programmeerbare timer met behulp van een willekeurige functie die ON draait soms variërend tussen 15 en 26 min elke 15-30 min om oververhitting van de aCSF voorkomen. </li><li> Stel het debiet in het UVC kamer naar 12 ml / min zoals eerder beschreven 12. Bedek de UVC kamer met aluminiumfolie om UVC verlichting buiten de kamer, die neuronaal weefsel kunnen beschadigen te voorkomen. NB: Voor donker aangepaste netvlies weefsel, breng dan een op maat gemaakt deksel op de belangrijkste kamer aan het licht uit te sluiten. </li><li> Gebruik een peristaltische pomp Circulate de oplossing (aCSF) door de twee kamers en een Peltier thermo koude platenkoeler ofwel koelen of verhitten hoofdkamer de gewenste temperaturen in het traject van 0-50 ° C. Voor een optimale weefsel incubatie, gebruik 15-16 ° C op levensvatbaarheid op lange termijn. </li></ol> 4. Calcium Dye Loading <ol><li> Selecteer calcium kleurstoffen op basis van de voorkeur van de individuele onderzoeker. Hier gebruiken we Fura-02:00, Fluo-08:00 of Fluo-04:00. Echter kan deze methode worden toegepast op andere kleurstoffen ook: los calcium kleurstoffen in DMSO om een 1 mM oplossing en 1% blokcopolymeren (bijvoorbeeld pluronzuur-127) tot een eindvolume van 50 ul en ultrasone trillingen gedurende 10 min. </li><li> oplossing aCSF voegen tot een eindconcentratie van 10 uM, 0,01% blokcopolymeren voor hersencoupes en 20 uM (retina), 0,02% blokcopolymeren het netvlies. In retina (papaïne behandelde) en hersenschijfjes van jonge dieren, belasting op het bad gedurende 45 minuten bij 37 ° C (Fura-2 AM) of bij kamertemperatuur (Fluo-04:00; Fluo-08:00). <ol><li> Voor volwassen dieren (&gt; 12 weken) pipetteer de kleurstoffen (50 ui) direct op de hersencoupes en houdt het 75 min betere penetratie van de kleurstof toe in de diepe lagen. </li><li> Om voldoende zuurstofvoorziening van de ondergedompelde plak tijdens kleurstof incubatie te verzekeren, bereiden een glas laadruimte met een gesloten deksel (ronde pot met een diameter van 2,5 cm, 3,5 cm hoog) met calcium kleurstoffen verdund in 2,5 ml aCSF. Zuurstof continu met 95% O2 / 5% CO2. Doe niet bubble. </li></ol></li><li> Na dye laden, wassen van het weefsel met aCSF en transfer naar het incubatiesysteem langzaam de temperatuur verlagen tot 15-16 ° C tot experimenteel gebruik. </li></ol> 5. Elektrofysiologische Recordings en Imaging <ol><li> Plaats weefsel in een ondergedompelde opname kamer onder een microscoop, en perfuseren zuurstofrijk aCSF met een stroomsnelheid van 4-5 ml / min of bij kamertemperatuur (~ 22 ° C) of fysiologische temperatuur (~ 35 ° C). Hold het weefsel op zijn plaats met een custom made &#39;&#39; harp &#39;&#39;, gemaakt van nylon of gouddraad uitgerekt en gelijmd in een U-vormig stuk goud of platina draad. </li><li> Voor elektrofysiologie: <ol><li> Bereid opname pipetten van 1,5 mm (1,19 mm ID) borosilicaatglas met behulp van een micropipet trekker tot een uiteindelijke weerstand van 5-6 MQ bereiken. </li><li> Vul de pipet met 3-4 pi van interne oplossing zoals eerder beschreven 13 en visualiseren cellen onder infrarood Differentieel Interferentie Contrast (DIC-IR) met een CCD camera. De intracellulaire oplossing moet zorgvuldig worden aangepast aan elk experiment experimentele resultaten te bereiken. </li><li> Positie pipet, met behoud positieve druk aangebracht via een afzuigopening op de pipet houder, op het membraan van een cel met een micromanipulator. Aangezien de ILM heeft van het netvlies is verwijderd, is geen voorafgaande membraan afschrapen vereist. Zodra de pipet op de cel, zachtjes negatiefdruk om de pipet een gigaohm afdichting te bereiken. scheuren dan de celmembraan met een korte hoeveelheid negatieve druk. </li><li> Helen cel stroom- of spanning-clamp middels standaardtechnieken zoals passend. </li></ol></li><li> Calcium-beeldvorming: <ol><li> Voor ratiometrische beeldvorming van Fura-2, maken gebruik van een ultra-high speed golflengte switcher om excitatie golflengten van 340 nm en 380 nm te bieden. Pass uitgestraalde licht van afzonderlijke cellen door middel van een emissie filter van 510 ± 20 nm, en vast te leggen met een hoge gevoeligheid, high-speed digitale camera. </li><li> Voor een enkele golflengte excitatie van Fluo-4, filter excitatie licht door een 460-490 nm band pass filter en het uitgezonden licht door een 515-550 nm banddoorlaatfilter. Voor de snelste en meest gevoelige opname gebruik maken van een high speed digitale camera zodanig. Acquire afbeeldingen. </li><li> Meet veranderingen in fluorescentie als functie van de tijd, hetzij op een enkele golflengte (Fluo-4) of met de golflengte verhoudingWerkwijze (Fura-2), zoals eerder beschreven 8, 14. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).</li>
<li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/microelectrodes_ch10.pdf">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li>
<li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+cell-permeant+6-nitrodibenzofuranyl-caged+IP3%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+photobiol+sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3.</a> Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).</li>
<li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+Extrasynaptic+Factors+Governing+Glutamatergic+Retinal+Waves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves.</a> Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).</li>
<li>Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+Calcium+Imaging+Methods+in+Wholemount+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina.</a> J Vis Exp. (92), e51396(2014).</li>
<li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Ca2%2B+dynamics+in+cone+photoreceptor+axon+terminals+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina.</a> J Vis Exp. (99), e52588(2015).</li>
<li>Velte, T. J., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials+in+the+dendrites+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells.</a> J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).</li>
<li>Cameron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+AM+dyes+following+prolonged+incubation+in+acute+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue.</a> PLoS ONE. 11 (5), (2016).</li>
<li>Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptation+of+spike+backpropagation+delays+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li>
<li>Breen, P. P., Buskila, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braincubator%3A+An+incubation+system+to+extend+brain+slice+lifespan+for+use+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology.</a> Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).</li>
<li>Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).</li>
<li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+viability+of+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Extending the viability of acute brain slices.</a> Sci Rep. 4, 4-10 (2014).</li>
<li>Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reactive+nitric+oxide+production+by+astrocytes+in+mouse+neocortical+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices.</a> Glia. 52 (3), 169-176 (2005).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li>
<li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9(2007).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , Methuen. London, UK. (1959).</li>
</ol>

Yossi Buskila en Paul Breen verklaren dat ze mede-eigenaren zijn van PAYO Scientific Pty Ltd, een bedrijf dat gespecialiseerd is in het bouwen van incubatiesystemen voor acuut zenuwweefsel. Alle andere auteurs rapporteren geen financiële belangen of mogelijke belangenconflicten met betrekking tot de huidige studie.

Dit artikel beschrijft een incubatie methode om de levensvatbaarheid van zenuwweefsel acute verlengen beeldvorming en elektrofysiologische experimenten, waarbij het aantal dieren nodig experimentele doelen voltooien verminderen. Twee belangrijke processen regelen de verslechtering van neuronaal weefsel in de tijd: i) verhoogde bacteriën niveaus, en de daarmee gepaard gaande toename van bacterieel endotoxine vrijgegeven, en ii) excitotoxiciteit die de traumatische snijden procedure 10 volgt. Als a...

Elektrofysiologie en functionele beeldvorming (calcium, voltage gevoelige kleurstoffen) zijn twee van de meest gebruikte experimentele technieken in de neurowetenschappen. Brain slice voorbereidingen en netvlies wholemount, die hier zal worden behandeld, een middel van het onderzoeken van elektrofysiologische eigenschappen en synaptische connectiviteit zonder besmetting door verdoving of spierverslappers. Brain plakjes en retinale wholemount behouden hun structurele integriteit, in tegenstelling tot culturen of celhomogenaten, waardoor de studie van specifieke circuits en de hersenen netwerken 1. Opnames van geïsoleerde weefsel voordelen ten opzichte van in vivo opnames bewegingen in verband met de hartslag en de ademhaling worden geëlimineerd. Bovendien maakt directe visualisatie specifieke klassen van cellen worden gericht en lokale behandeling met farmacologische gereedschappen 2, 3. Patch-clamp opnamen en calcium dye-loading in retinale wholemount wordt bemoeilijkt door het bestaan ​​van de Inner beperken Membrane (ILM), die de retinale ganglioncellen (RGC) laag bedekt en voorkomt dat directe toegang tot de cellen. Typisch wordt dit membraan weggeschraapt met een glazen pipet om rechtstreekse toepassing van een patch pipet en de vorming van een gigaohm zegel op een enkele cel toe. Daarnaast hebben bad toegepast calcium kleurstoffen niet ILM overschrijden en moeten ofwel geïnjecteerd onder dit membraan 4, retrograad transport na injectie in de oogzenuw 5 geëlektroporeerde of door het weefsel 6. Bovendien, als het gebruik van een knaagdier model van retinitis pigmentosa, de rd / rd muis, het ILM is dikker en ondoordringbaar. Hier maken we gebruik van een techniek om de ILM te verwijderen met enzymatische afbraak 7, zowel alomtegenwoordige calcium dye-loading, en directe toegang tot retinale ganglion cellen voor patch-clamp recordi toestaanngs 8. Succesvolle opname van ofwel hersencoupes of retinale wholemount afhankelijk dissectie en incubatie van levensvatbare neuronaal weefsel. Kenmerkend wordt weefsel geëxtraheerd op de ochtend van het experiment en geïncubeerd in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) totdat het wordt gebruikt voor opnamen. Gewoonlijk weefsel blijft nog gedurende 6-8 uur, met significante afbraak na deze tijdskader. Zowel hersencoupes en wholemount retina preparaten meestal bij meer dan weefsel kan worden opgenomen binnen deze korte periode. Daarom wordt vaak weefsel die aan het einde van de dag en de dissectie opnieuw voltooid op opeenvolgende dagen. Dit betekent dat een ander dier wordt benut en ~ 2 uur over de instellingen en dissectie / kleuring herhaald. Het volgende protocol beschrijft een werkwijze voor het verlengen van de levensduur van neuronaal weefsel voor meer dan 24 uur, wat betekent dat minder dieren worden gebruikt, en meer experimentele tijd beschikbaar. Levensvatbaarheid van het weefsel wzoals beoordeeld door middel van het opnemen van elektrofysiologische eigenschappen en calcium dynamiek, en deze eigenschappen waren niet te onderscheiden tussen &lt;4 uur en&gt; 24 uur postdissection. Deze resultaten geven aan dat niet alleen eencellige eigenschappen intact en functioneel na verlengde incubatie, maar netwerkactiviteit, zoals beoordeeld door calcium-imaging en elektrofysiologische opnames, onveranderd&gt; 24 uur postdissection. Bovendien tonen wij dat calcium kleurstoffen in cellen blijven gedurende langere tijd zonder enige nadelige effecten. De toepassing van dit protocol toont aan dat de functionele activiteit van neuronen in acute neuronaal weefsel kan worden gehandhaafd gedurende lange perioden, zodra de externe omgeving sterk gereguleerd. Zoals levensvatbaarheid van het weefsel varieert sterk tussen laboratoria door incubatie verschillende protocollen, deze methode wordt een gouden standaard voor het ideale parameters die moeten worden toegepast op de variabiliteit te verminderen in de gezondheid van acute neuRonal weefsel.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington&nbsp;</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>20% solution in DMSO&nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&nbsp;&nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&nbsp;&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating blade microtome&nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>Uitgerust met Leica&rsquo;s Vibrocheck&trade; meetapparaat&nbsp;</td></tr><tr><td>Antivibration table</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Stage Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>High speed wavelength switcher</td><td>Sutter instrument</td><td>Lambda DG-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&reg; System</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Low Profile Open Bath Chambers</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td><td>TE Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

langdurige incubatie van acute neuronaal weefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute voorbereidingen zenuwweefsel, de hersenen plakjes en netvlies wholemount, kan meestal alleen worden gehandhaafd voor 6-8 uur na dissectie. Dit beperkt de experimentele tijd en verhoogt het aantal dieren die worden gebruikt per studie. Deze beperking specifiek effect protocollen zoals calcium imaging dat langdurige voorincubatie met bad toegepaste kleurstoffen vereisen. Exponentiële bacteriegroei binnen 3-4 uur na het snijden stevig gecorreleerd met een afname van de gezondheid weefsel. Deze studie beschrijft een werkwijze voor het beperken van de verspreiding van bacteriën in acute preparaten levensvatbare neuronale weefsels gedurende lange perioden (&gt; 24 uur) zonder de noodzaak voor antibiotica, steriele procedures of weefselcultuur medium dat groeifactoren handhaven. Op door het extracellulaire fluïdum door UV-bestraling en het houden van het weefsel in een aangepaste houdkamer bij 15-16 ° C, het weefsel vertoont geen verschil in elektrofysiologische eigenschappen of calcium signaling door middel van intracellulaire calcium kleurstoffen bij&gt; 24 uur postdissection. Deze methoden zullen niet alleen experimentele tijd te verlengen voor de gebruikers van acute neuronaal weefsel, maar het aantal benodigde dieren experimentele doelen beslag neemt, en een gouden standaard voor acute neuronaal weefsel incubatie stellen.

Strakke regulatie van de bacteriële verontreiniging en de temperatuur van de aCSF tijdens incubatie essentieel om neuronaal weefsel haalbaarheid ervan. Dit kan worden geoptimaliseerd door bestraling met UVC-licht en de temperatuur van de aCSF op 15-16 ° C (figuur 1). Bovendien is de aCSF parameters stempel (APS Figuur 1C) verschaft de experimentator een verslag van de omgevingsomstandigheden (pH en temp.) Biedt dus een gouden standaard voor parameters al...

Na verwijdering uit het lichaam, is neuronaal weefsel sterk beïnvloed door omgevingsfactoren, waardoor eventuele degradatie van het weefsel na 6-8 uur. Met behulp van een unieke incubatie werkwijze, die nauw bewaakt en regelt de extracellulaire omgeving van het weefsel, kan levensvatbaarheid van het weefsel aanzienlijk worden verlengd&gt; 24 uur.

Langdurige incubatie van Acute neuronaal weefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Het algemene doel van deze techniek is om neuronaal weefsel gedurende langere perioden te behouden zonder significante weefseldegeneratie. Met behulp van deze methode kunnen elektrofysiologische registraties en calciumimaging meer dan 24 uur na de weefselextractie worden uitgevoerd. Deze methode zal de levensvatbaarheid van acuut geëxtraheerd neuronaal weefsel aanzienlijk verhogen en deze levensvatbaarheid gedurende meer dan 24 uur handhaven, waarmee een nieuwe gouden standaard voor acute weefselincubatie wordt gezet.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de experimentele tijd waarin het weefsel kan worden benut aanzienlijk wordt verlengd. Dit vermindert het aantal benodigde dieren en maximaliseert de hoeveelheid gegevens die uit elk experiment kan worden verkregen. De Braincubator is een geautomatiseerd systeem dat de weefseltemperatuur handhaaft en bacteriële proliferatie in de extracellulaire vloeistof voorkomt.Dit biedt een strikt gecontroleerde omgeving voor het weefsel. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Orsolya Kekesi en Alba Bellot-Saez, PhD-studenten uit mijn laboratorium. Bereid voor de preparatie van hersensecties 300-micrometer dikke hersensecties voor die het gebied van interesse bevatten met behulp van een vibratoom.Breng de coupes vervolgens over naar een op maat gemaakt incubatiesysteem met een gecontroleerde carbogenstroom, pH-waarden en temperatuur. Stel de initiële temperatuur van de kamer in op 35 °C gedurende 15 tot 30 minuten en verlaag deze vervolgens langzaam naar 15 °C. Incubeer de coupes daarna in het incubatiesysteem tot aan de elektrofysiologische registratie of beeldvorming.Voor de preparatie van een retinal whole mount worden de ogen onmiddellijk geënucleerd uit een geëuthanaseerd dier. Maak een kleine incisie langs de ora serrata en plaats de ogen in Ames'media of aCSF met een toevoer van carbogen bij kamertemperatuur. Verwijder daarna onmiddellijk het hoornvlies, de lens en het glasvocht door met een klein schaartje langs de ora serrata te knippen en deze met een pincet te verwijderen.Plaats het weefsel bij kamertemperatuur in het incubatiesysteem. Om de binnenste limiterende membraan te verwijderen, wordt de oogcup met het netvlies overgebracht naar een klein glazen potje met papaine, L-cysteïne, EDTA en DNase bij 37 °C gedurende 20 minuten. Voeg carbogen toe aan de oplossing via het deksel, maar zonder te borrelen.Stop de enzymatische digestie door het weefsel gedurende 10 minuten in een ovomucoïde- en BSA-oplossing in Earle's BSS te plaatsen. Was het weefsel vervolgens grondig met aCSF. Breng het weefsel daarna over naar het incubatiesysteem en verlaag de temperatuur tot ongeveer 15 tot 16 °C.Breng vervolgens het retinawevsel over naar de microscoop. Isoleer de retina uit de oogkom en snijd deze met een scheermesje in vier stukken. Indien de volledige retina vereist is, maak dan vier kleine sneetjes in de periferie van de retina zodat deze plat kan liggen.Dit weefsel kan nu worden overgebracht naar de microscoop voor elektrofysiologie of bewaard worden in de Braincubator. Het weefsel wordt in de hoofdkamer bewaard, waarin de probes voor pH- en temperatuurmetingen zich bevinden. Een tweede kamer is geïsoleerd van de hoofdkamer en wordt blootgesteld aan 1,1 watt UVC-licht om bacteriën in de oplossing te bestralen.Gebruik een peristaltische pomp om aCSF door de twee kamers te laten circuleren, en een Peltier-thermo-elektrische koelplaat om de hoofdkamer te koelen of te verwarmen. Los in deze procedure calciumkleurstof op in DMSO om een oplossing van 1 mM te maken. Voeg 1% pluroniczuur F-127 toe aan het mengsel om een eindvolume van 50 µL te bereiken.Sonicate het vervolgens gedurende 10 minuten. Bereid een glazen laadkamer voor met calciumluminescentiekleurstof verdund in 2,5 milliliters aCSF om een eindconcentratie van 10 micromolar te bereiken voor hersensneden, en 20 micromolar voor retina. Incubeer het monster voor retina en hersensneden van jonge dieren gedurende 45 minuten in het bad.Pipetteer bij volwassen dieren 25 microliters kleurstof direct op de hersensectie en laat dit 75 minuten inwerken om een betere penetratie van de kleurstof in de diepere lagen mogelijk te maken. Om een adequate oxygenatie van het ondergedompelde weefsel tijdens de incubatie van de kleurstof te garanderen, wordt het weefsel continu geoxygeniseerd met carbogen via het deksel, maar zonder te borrelen. Was het weefsel na het laden van de kleurstof met aCSF en breng het over naar het incubatiesysteem.Verlaag de temperatuur langzaam tot ongeveer 15 tot 16 °C tot aan het gebruik. Plaats voor de registratie het weefsel in een ondergedompelde registratiekamer onder een microscoop en perfuseer het met zuurstofrijke aCSF met een stroomsnelheid van 4 tot 5 ml per minuut. Fixeer het weefsel met behulp van een op maat gemaakte harp.Bereid vervolgens enkele registratiepipetten voor met een micropipet-puller om een uiteindelijke weerstand van vijf tot zes megaohm te bereiken. Vul een pipet met drie tot vier µL interne oplossing en plaats de oplossing vervolgens op ijs. Visualiseer daarna de cellen met een CCD-camera onder IR-DIC.Positioneer de pipet op het celmembraan met behulp van een micromanipulator. Handhaaf een positieve druk via een zuigpoort op de pipethouder. Zodra de pipet op de cel rust, wordt er een lichte negatieve druk op de pipet uitgeoefend om een gigaohm-seal te verkrijgen.Ruptureer vervolgens het celmembraan met een korte negatieve druk. Start daarna met de whole-cell current- of voltage-clamp-registratie. Gebruik voor ratiometrische beeldvorming van Fura-2 een ultrasnelle golflengteschakelaar om excitatiegolflengten van 340 nanometers en 380 nanometers te leveren.Vang vervolgens het uitgezonden licht op via een emissiefilter met een digitale camera met hoge gevoeligheid en hoge snelheid. Voor een enkele excitatiegolflengte van Fluo-4 wordt het excitatielicht gefilterd via een banddoorlaatfilter van 460 tot 490 nanometer, en het uitgezonden licht via een banddoorlaatfilter van 515 tot 550 nanometer. Na digestie kunnen retinale ganglioncellen en verplaatste amacrinecellen duidelijk worden gevisualiseerd onder DIC-verlichting, en kunnen deze worden geselecteerd voor patchclamp-metingen zonder voorafgaand afschrapen van het innerlijk begrenzend membraan.Hier worden representatieve current clamp-registraties van een retinale ganglioncel getoond. Depolarisatie van de cel via de patchpipet veroorzaakte dosisafhankelijke generatie van actiepotentialen, wat duidt op de viabiliteit van de cellen na papaine-behandeling. Verwijdering van het innerlijk limiterend membraan maakte tevens alomtegenwoordige kleuring van de ganglioncellaag met Fura-2 AM mogelijk. De cellen reageerden op de applicatie van 30 millimol kaliumchloride met een sterke stijging van de intracellulaire calciumconcentratie, zoals blijkt uit een toename in de 342 naar 380 nanometer ratio ten opzichte van F0. Na applicatie van kaliumchloride keerden de calciumspiegels na stimulatie terug naar de basislijn.En de cellen konden vervolgens worden gestimuleerd om een respons van een vergelijkbare amplitude te produceren. Bovendien waren deze responsen niet te onderscheiden tussen retina die minder dan vier uur en langer dan 24 uur na dissectie was geregistreerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat acuut neuraal weefsel kwetsbaar is voor omgevingsinvloeden.Daarom is een strikte regulering van aCSF, door nauwgezet toezicht op de pH, temperatuur en bacteriële niveaus, essentieel voor het behoud van de cellulaire activiteit en de integriteit van het netwerk. Deze procedure kan worden gebruikt om neuronaal weefsel meer dan 24 uur te behouden zonder dat aseptische technieken of het gebruik van cultuurmedia met groeifactoren of antibiotica, die de fysiologie kunnen beïnvloeden, noodzakelijk zijn. We hopen dat deze methode de gouden standaard zal vormen voor de ideale parameters om de levensvatbaarheid van het weefsel te maximaliseren.Dit vermindert de variabiliteit in de gezondheid van het weefsel zelf en vermindert daarmee de experimentele variabiliteit. Door het papain-protocol te gebruiken om het inner limiting membrane van het netvlies te verteren, is het mogelijk om een alomtegenwoordige kleuring met calciumkleurstoffen te bereiken. Dit protocol kan ook worden gebruikt om intracellular recordings op meerdere locaties te verkrijgen van neuronen uit de ganglioncellaag.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u weefsel gedurende meer dan 24 uur levensvatbaar houdt voor beeldvormings- en elektrofysiologische experimenten. Vergeet niet dat werken met ultraviolet licht gevaarlijk kan zijn. Voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van een beschermende oogbescherming, moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

prolonged-incubation-acute-neuronal-tissue-for-electrophysiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We zien hoe veranderingen in de intracellulaire vrije calciumconcentratie en synaptische werkzaamheid kan gelijktijdig monitoren in een ganglion bereiding...

Volgen van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie en Synaptic werkzaamheid in de Mollusc<em&gt; Aplysia</em

This video demonstrates a method for prolonged incubation of neuronal tissue of the retina. Eyecups containing retina are obtained from a mouse eye; the inner limiting membrane (ILM) is enzymatically digested to expose the neuronal cells of the retina, and either the treated eyecup or the isolated retina is transferred to a specialized incubator for prolonged incubation at a low temperature.

A Technique for the Prolonged Incubation of Neuronal Tissue of the Retina

This video demonstrates a protocol for whole-cell patch-clamp recording and two-photon calcium imaging in brain hippocampal slices. This method allows to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of different neuronal types in acute brain slices.

Establishing a Whole-Cell Configuration for Two-Photon Calcium Imaging of Brain Slices

This video demonstrates a technique for measuring neuronal activity in mouse brain slices using calcium imaging and electrophysiological recordings. By perfusing the tissue with potassium ions and recording intracellular calcium changes through high-speed digital imaging, this method reveals real-time neuronal responses.

Measuring Neural Activity in a Mouse Brain Slice after Prolonged Incubation

Procedures worden beschreven om gelijktijdige opnamen van membraanpotentiaal of stroom en veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie uit te voeren. Suprachiasmatische nucleus-neuronen worden gevuld met de calciumindicator bis-fura-2 met behulp van een patch clamp-elektrode in de whole cell patch clamp-configuratie.

Gelijktijdige elektrofysiologisch registratie en calciumbeeldvorming van neuronen in de suprachiasmatische kern

We beschrijven de combinatie van focale UV-geïnduceerde foto-activatie van neuro-actieve verbindingen met whole-cell patch-clamp en multi-foton beeldvorming van intracellulaire natrium transiënten in dendrieten en de stekels van de hippocampus neuronen in acute weefsel plakjes van de hersenen van muizen.

Multi-foton intracellulaire Natrium Imaging In combinatie met UV-gemedieerde Focal uncaging van glutamaat in CA1 pyramidale neuronen

Het enterische zenuwstelsel (EZS) is een netwerk van neuronen en gliacellen in de darmwand dat intestinale reflexen controleert. Dit protocol beschrijft methoden voor het opnemen van de activiteit van enterische neuronen en gliacellen in levende bereidingen van EZS met behulp van Ca2+ beeldvorming.

In Situ Ca 2+ Beeldvorming van het enterische zenuwstelsel

Presenteren we een methode geheel-cel patch-clamp opnamen en twee-foton imaging om vast te leggen van Ca2 + transiënten in neuronale dendrites in acute hersenen segmenten combineren.

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Hier beschrijven we de essentiële stappen voor geheel-cel patch-clamp opnamen gemaakt van substantia gelatinosa (SG) neuronen in het ruggenmerg in vitro segment. Met deze methode kunt de eigenschappen van het intrinsieke membraan, synaptische transmissie en morfologische karakterisering van SG neuronen worden bestudeerd.

Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa

Microglia, de resident immuuncellen van de hersenen, reageren snel met de morfologische veranderingen voor wijzigingen van hun omgeving. Dit protocol wordt beschreven hoe u twee-foton microscopie te bestuderen van de aantrekkingskracht van microglial processen naar serotonine of ATP in acute hersenen plakjes van muizen.

Twee-foton beeldvorming van Microglial processen attractie naar ATP of serotonine in Acute hersenen plakjes

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

Leer een methode voor langdurige incubatie van acuut neuronweefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging. Deze techniek behoudt weefselviabiliteit meer dan 24 uur en vermindert het aantal benodigde dieren.

Langdurige incubatie van Acute neuronaal weefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging

Meer video's verkennen