De bereiding van niet-menselijke primaten Brain Tissue voor Pre-embedding immunohistochemie en elektronenmicroscopie

Het algemene doel van dit experiment is om betrouwbare pre-embedding immunokleuring van niet-primaat hersenweefsel te verkrijgen voor elektronenmicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van neuroanatomie, zoals de synaptische incidentie van een bepaalde innervatie in een nauwkeurige hersenstructuur. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en goedkope methode is om specifieke innervaties te labelen die geschikt zijn voor elektronenmicroscopie.

Begin met het overbrengen van 50 micron dikke secties van acrolein gefixeerd niet-menselijk primaatbrein met het gewenste gebied naar een 12-wells plaat met PBS. Was de vrij zwevende secties drie keer gedurende vijf minuten in PBS bij kamertemperatuur, en incubeer vervolgens de secties in vers bereide natriumborohydride-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Schud zachtjes zonder deksel.

Na het verstrijken van de 30 minuten, aspireer het natriumborohydride en voeg PBS toe aan elke put. Plaats de plaat op een schommeler en schud krachtig gedurende 10 minuten. Herhaal het wassen nog twee keer of totdat er geen reactiegas meer overblijft.

Blokkeer de secties door incubatie in een oplossing van 2% normaal serum en 0,5% koude visgelatine verdund in PBS gedurende een uur bij kamertemperatuur met zachtjes schudden. Zodra de incubatietijd is verstreken, incubeer de secties in primaire antilichaamoplossing met zachtjes schudden overnacht bij kamertemperatuur. De volgende dag, na het wassen van de secties zoals voorheen, incubeer de secties in secundaire antilichaamoplossing gedurende anderhalf uur bij kamertemperatuur met zachtjes schudden.

Na het wassen van de secties zoals voorheen, incubeer in avidine-biotine-peroxidase of ABC-oplossing gedurende een uur met schommelen. Bereid vervolgens een verse oplossing van 0,05% 3, 3'Diaminobenzidine met 0,005% waterstofperoxide verdund in TBS. Na het wassen, incubeer secties in de DAB-oplossing gedurende drie tot zeven minuten met zachtjes schommelen.

Zodra het bruine precipitaat de gewenste kleur heeft ontwikkeld, stopt u de reactie door twee keer snel te wassen in koud TBS, en vervolgens door een reeks getimede TBS en PB-wasbeurten. Breng de plaat met de DAB-gekleurde secties over naar de ventilatiekap. Breng de secties over in een zes-wells plaat gevuld met PB en plat de secties volledig door voorzichtig het PB uit de plaat te pipetteren, en voeg vervolgens druppel voor druppel osmiumtetraoxide-oplossing toe om de platgedrukte secties niet te verstoren.

Bedek de plaat met aluminiumfolie om de secties te beschermen tegen licht en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder roeren. Tijdens de osmificatie, bereid waterafstotend epoxyhars voor door geschikte hoeveelheden van elk component van de epoxyharsmix toe te voegen aan een grote plastic beker. Roer met een houten stok of plastic pipet tot een homogene bruine kleur is verkregen, en breng vervolgens gelijke hoeveelheden hars over in aluminium bekers van geschikte grootte voor het aantal secties dat moet worden verwerkt en laat het rusten.

Zodra de osmificatieperiode is verstreken, was de secties drie keer in PB gedurende 10 minuten met laag snelheid roeren. Na het wassen, dehydrateer de secties in de volgende reeks gegradueerde ethanol gedurende twee minuten per keer. Breng vervolgens de secties over naar glazen vials gevuld met propyleenoxide en incubeer in propyleenoxide drie keer gedurende twee minuten per keer om het dehydratatieproces te voltooien.

Breng vervolgens de secties voorzichtig, een voor een, over in de aluminium bekers, en vermijd zoveel mogelijk contact met lucht. Plaats de secties plat in eerder gemengd waterafstotend epoxyhars en incubeer ze een nacht onder de ventilatiekap bij kamertemperatuur. De volgende dag, bedek glazen slides en plastic deksels met minerale olie, en verzacht vervolgens de hars door de aluminium bekers te incuberen bij 60 graden Celsius gedurende maximaal 12 tot 15 minuten.

Plaats de secties voorzichtig plat op de ingevette kant van de glazen slide. Plaats het ingevette deksel en duw voorzichtig alle resterende lucht eruit. Incubeer de slides gedurende 48 uur bij 60 graden Celsius.

Na 48 uur verwijdert u het plastic deksel, waardoor de sectie in hars wordt ingekapseld. Begin met het gebruik van een verrekijker om de regio van belang te lokaliseren en gebruik vervolgens een scalpel om een klein vierhoekig stukje weefsel van ongeveer één milliliter in kwadraat te snijden. Maal vervolgens de punt van een harsblok af en plak het vierhoekige weefselstukje erop.

Na het drogen, plaatst u het harsblok in het ultramicrotoomdek in verticale positie en gebruikt u een scherp scheermesje om geleidelijk elke kant van het harsblok te snijden om een trapezium met gladde zijden te vormen. Plaats vervolgens het dek in horizontale positie en draai de blok totdat de langste kant van het trapezium naar beneden staat. Plaats een diamant trimgereedschap of een glazen mes in de daarvoor bestemde ruimte.

Stel de ultramicrotoom in om secties van 300 micron te snijden met een snelheid van één millimeter per seconde. Pas het mes aan om verticaal parallel te zijn aan het vierhoekige stukje en om een zeer kleine horizontale hoek van ongeveer één graad te vertonen en trim de oppervlakte van het vierhoekige stukje totdat het weefsel begint te verschijnen. Schakel nu over naar een ultra 45-graads diamantmes uitgerust met een boot gevuld met gedistilleerd water om secties van 80 micron dik te snijden.

Maak de secties glad door ze te bestrijken met een stuk absorberend papier bevochtigd met xyleen zonder het wateroppervlak aan te raken, en verzamel seriële secties op lege 150 mesh koperroosters. Plaats de roosters in een roosteropslagdoos en bereid vervolgens een een-op-een oplossing van loodcitratstockoplossing en gedistilleerd water voor en filter door een 0,2 micron spuitfilter. Bedek de fles met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen.

Plaats elke rooster op een