Met behulp van In Vitro Live-cel Imaging om te verkennen chemotherapeutica geleverd door lipide gebaseerde nanodeeltjes
1 november 2017
Live-cel imaging is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van dynamische processen. Het onderzoek van vaste cellen biedt alleen statische afbeeldingen, die tot verkeerde interpretaties en verwarring over het proces leiden kunnen. Dit werk presenteert een methode om te studeren opname, drug release en intracellulaire lokalisatie van liposomaal nanodeeltjes in levende cellen.
Het algemene doel van deze live-cell imaging-techniek is om cellulaire processen, zoals de opname en distributie van chemotherapeutica, te volgen zonder dat fixatie nodig is. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het kankeronderzoek, zoals de wijze waarop chemotherapeutica, zowel in vrije vorm als ingekapseld in nanodeeltjes, worden opgenomen door tumorcellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we levende cellen afbeelden, waardoor fixatie-artefacten worden voorkomen en een dynamische evaluatie in real-time mogelijk is.
We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we observeerden dat nanodeeltjes afbraken tijdens de fixatie, wat leidde tot een verkeerde interpretatie van de geneesmiddelentoediening. Om de beeldvormingskamer te assembleren, plaatst u een dekglas van 25 millimeter in het onderste deel van de kamer en schroeft u het bovenste deel in het onderste deel. Draai dit niet te strak aan, omdat het glas kan breken.
Autoclaveer de gehele kamer. Om de cellen uit te platen, haalt u de beeldvormingskamer in een laminaire flowkast uit de sterilisatiezak. Draai de kamer voorzichtig vast en plaats deze in een Petrischaal.
Coat het glas van de beeldvormingskamer met één milliliter 0,1% steriele gelatine gedurende 20 minuten bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Nadat het medium uit de kweekflessen is verwijderd, worden de cellen eenmaal gewassen met 1x PBS en vervolgens losgemaakt met 0,25% trypsine. Inactiveer de trypsine door celkweekmedium toe te voegen.
Verzamel vervolgens de cellen en centrifugeer deze bij 1.100 G gedurende vijf minuten. Resuspendeer de pellet in vijf milliliter celkweekmedium. Nadat de cellen zijn geteld zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt de gelatine geaspireerd en worden de cellen uitgeplaat in een verdunning die een maximale bedekking van 70 procent binnen 24 uur mogelijk maakt.
Laat de cellen 24 uur hechten bij vijf procent koolstofdioxide en 37 °C. Beoordeel de cellen onder een microscoop op confluentie, cellulaire morfologie en contaminatie. Zet vervolgens de confocale microscoop, het fluorescentielicht en de computer aan.
Sluit de lensverwarmer aan op het objectief en stel deze in op 35 graden. Bereid de incubatie-unit voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de incubatie-unit op de microscopentafel en sluit de in- en uitstroombuis voor koolstofdioxide aan.
Open de hoofdkraan voor koolstofdioxide en schakel de koolstofdioxidecontroller in. Controleer of de controller is ingesteld op 5% koolstofdioxide. Juiste celkweekcondities zoals temperatuur, CO2, pH, vochtigheid en steriliteit zijn cruciaal voor langdurige celbeeldvorming.
Daarom moet elke incubator correct worden getest. Stel de temperatuur van de kamer in op 37 °C. Laat de incubatie-eenheid de geselecteerde temperatuur en het koolstofdioxidepercentage bereiken.
Haal de beeldunithuizing uit de hoofdincubator voor kooldioxide en transporteer de huizing in een Petrischaal naar de microscopieruimte. Plaats de beeldunithuizing in een op maat gemaakte objecthouder met een diameter van 35 millimeter en sluit de huizing met een op maat gemaakt afdichtingsdeksel. Open de incubatie-eenheid en vervang, terwijl u zo snel mogelijk werkt om afkoeling van de cellen te voorkomen, het rode vlak door de beeldunithuizing en sluit de eenheid vervolgens.
Zorg ervoor dat er geen kabels tussen de tafel en de microscoop beklemd zitten. Laat het apparaat 30 minuten acclimatiseren. Open vervolgens de software en schakel de laser in.
Maak een nieuwe database aan door op "New" te klikken onder het tabblad File. Geef de database een naam en sla deze op. Stel de configuratie in door op "Config" te klikken onder het tabblad Acquire.
Selecteer "Channel Mode" en "Single Track" om één fluorofoor te evalueren. Selecteer "Multi Track" voor meerdere fluoroforen. Kies vervolgens de juiste band-pass filters die passen bij de fluorofoor.
Selecteer het brightfield-kanaal in een van de tracks. De scanning is een compromis tussen het fluorescentiesignaal van de verbindingen en de beeldkwaliteit. Overbelichting, fotobleking, de signaal-ruisverhouding, de kwaliteit van de cellen en de toegevoegde verbindingen zijn allemaal factoren die de resultaten kunnen beïnvloeden en die correct getest moeten worden.
Stel de scancontrole in door op "Scan" te klikken onder het tabblad Acquire. Klik vervolgens op "Mode" om de framegrootte, de scansnelheid, de scanrichting en het scangemiddelde in te stellen. Klik op "Channels" om het Pinhole, de Gain en Offset, en het laservermogen in te stellen.
Sla deze instellingen op door op "Config" in het tabblad Configuration te klikken en sla ze op in de configuratiedatabase. Stel de time-lapse in door op "Muti TimeX" in het tabblad Macro te klikken. Klik op Single Location.
Pas de opgeslagen configuratie toe door op "Single Track" te klikken en scroll naar de gewenste configuratie in de configuratiedatabase. Stel het tijdsinterval en het aantal scans in. Laad de configuratie door op "Load Conf" te klikken.
Geef de time-lapse een naam in de Base File Name en selecteer de database door op Image Data Base te klikken om de time-lapse op te slaan. Stel een tijdelijke map in door op Temporary Image Folder te klikken. Open vervolgens de incubatie-eenheid, til de beeldvormingsring op, voeg een druppel Immersion Oil toe aan het objectief en sluit de eenheid zo snel mogelijk. Stel de focus in en selecteer een positie in de beeldvormingskamer.
Verdun in de laminaire flowkast het vrije geneesmiddel of de nanodeeltjes tot een concentratie van 5 µg/mL geneesmiddel of 0,05 µmol lipiden in celkweekmedium. Filtreer dit door een 0,22 micron spuitfilter indien het geneesmiddel of de nanodeeltjes niet steriel zijn. Open de incubatiekamer en til het plafonddeksel op.
Verwijder vervolgens het medium van de cellen, voeg één milliliter van het verdunde geneesmiddel of de nanodeeltjes toe en sluit de unit zo snel mogelijk. Focus op de cellen en maak een snelle scan door op "Single" te klikken in het tabblad Scan Control. Wanneer het brightfield-beeld scherpstelde cellen toont, start u de time-lapse door op "Start Time" te klikken in de Multi TimeX Macro.
Het aantal herhalingen en de resterende tijd worden weergegeven in de Macro en in de beelden. Controleer regelmatig of de cellen nog steeds in focus zijn, of gebruik de Autofocus. Het programma slaat de time-lapse automatisch op in de database.
Sluit de database niet terwijl het programma wordt uitgevoerd. Dit is een time-lapse van drie uur van cellen die zijn blootgesteld aan vrije Doxorubicine. Observeer de opname en onmiddellijke translocatie van rood fluorescerende Doxorubicine naar de nucleus.
Hier worden de cellen drie uur lang geïncubeerd met ingekapseld Doxorubicin. Het fluorescentiesignaal is veel lager en bevindt zich in het cytoplasma. In de nucleus is het signaal nauwelijks zichtbaar.
Door deze time-lapsefilms te importeren in Image J, kan een interessegebied (region of interest) rond de kern worden getekend en kan de pixeldichtheid worden gemeten. De hier gepresenteerde grafiek toont het verschil in nucleaire opname over de tijd in cellen die zijn geïncubeerd met respectievelijk vrije of ingekapselde Doxorubicin. Hier zijn cellen afgebeeld die zijn geïncubeerd met ingekapselde Doxorubicin, weergegeven in het rood.
Het paarse signaal representeert de drager en lysosomen zijn gekleurd met een groene Live Cell-marker. Een vergelijking tussen beide celtypen laat een verschil zien in de distributie van de lysosomen. Lysosomen in B16BL6-cellen zijn verspreid over het gehele cytoplasma.
Hoewel lysosomen in BLM-cellen zich dicht bij de nucleus bevinden, vertonen beide cellijnen een hoge colocalisatie van rode en paarse signalen in lysosomen, wat erop wijst dat doxorubicine en de drager ervan in deze organellen gevangen zitten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de opname van chemotherapeutica en andere fluorescerende markers in levende cellen gedurende enkele uren of zelfs dagen kunt afbeelden.
Overzicht
Deze studie presenteert een live-cell imaging techniek om de opname en distributie van chemotherapeutica in real-time te visualiseren. Door fixatie-artefacten te vermijden, maakt de methode een nauwkeurige observatie van drugdelivery-processen in levende cellen mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- Live-cell imaging biedt dynamische inzichten in cellulaire processen.
- Imaging van gefixeerde cellen kan leiden tot misinterpretatie van mechanismen voor geneesmiddelentoediening.
- Nanodeeltjes kunnen tijdens de fixatie degraderen, wat de analyse compliceert.
- Real-time imaging is essentieel voor het begrijpen van geneesmiddelinteracties bij kankertherapie.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode om de opname van chemotherapeutica in levende cellen te volgen.
- Het evalueren van de distributie van nanodeeltjes zonder fixatie-artefacten.
- Het verbeteren van het begrip van mechanismen voor geneesmiddelentoediening in tumorcellen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een beeldkamer voor live-cell observatie.
- Celkweek onder gecontroleerde omstandigheden (temperatuur, CO2, vochtigheid).
- Gebruik van confocale microscopie om cellulaire processen te monitoren.
- Time-lapse imaging om dynamische veranderingen in de loop van de tijd vast te leggen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van medicijnopname en -distributie in real-time.
- De voordelen van live-cell imaging ten opzichte van methoden met gefixeerde cellen zijn aangetoond.
- Inzicht geboden in het gedrag van nanodeeltjes in levende cellen.
- Mogelijkheid geboden tot het observeren van cellulaire reacties op blootstelling aan medicijnen.
Conclusies
- Live-cell imaging is een waardevol instrument voor het bestuderen van mechanismen voor geneesmiddelentoediening.
- De methode vermindert het risico op misinterpretatie dat gepaard gaat met fixatie.
- Toekomstige toepassingen kunnen strategieën voor de behandeling van kanker verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Live-cell imaging maakt real-time tracking van de opname en intracellulaire trafficking van chemotherapeutische nanodeeltjes mogelijk, waardoor een kritisch gat in de ontwikkeling van oncologische geneesmiddelen wordt gedicht waar fixatie-artefacten dynamische afgifte van het geneesmiddel en nucleaire translocatiegebeurtenissen maskeren. Deze benadering ondersteunt mechanistische risicoreductie door kwantitatieve, tijdopgeloste gegevens te verschaffen over de kinetiek van de afgifte van het geneesmiddel en de subcellulaire lokalisatie, wat direct bijdraagt aan lead-optimalisatie en de selectie van preklinische kandidaten. Door het lot van lipide-gebaseerde nanodragers in levende tumorcellen te visualiseren, verhoogt deze methode het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase, waardoor uitval in een later stadium door verkeerd begrepen werkingsmechanismen wordt verminderd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt directe observatie mogelijk van de afgifte van chemotherapeutische middelen uit nanodragers en de daaropvolgende nucleaire translocatie, waardoor de mechanistische link tussen aflevering en biologische activiteit wordt verduidelijkt.
- Operationele waarde: Elimineert fixatie-geïnduceerde artefacten die de integriteit van nanodeeltjes en de distributie van geneesmiddelen vervormen, wat een nauwkeurige interpretatie van opname- en afgifteprofielen waarborgt.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve fluorescentie-intensiteitsmetingen in de tijd, waardoor een vergelijking kan worden gemaakt tussen de kinetiek van vrije versus ingekapselde geneesmiddelen in een fysiologisch relevante context.
- Operationele waarde: Vestigt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar platform voor het evalueren van op nanodeeltjes gebaseerde systemen voor geneesmiddelafgifte onder live-cellcondities, wat de schaalbaarheid van assays en hergebruik tussen projecten ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppel de degradatie van nanodragers en de afgifte van geneesmiddelen aan lysosomale colocalisatie en nucleaire accumulatie, wat een translationele biomarker biedt voor de intracellulaire beschikbaarheid van het geneesmiddel.
- Operationele waarde: Faciliteert go/no-go-beslissingen door te visualiseren of ingekapselde geneesmiddelen een voldoende nucleaire afgifte bereiken om de verwachte farmacologische effecten teweeg te brengen, waardoor de mechanistische onzekerheid in preklinische modellen wordt verminderd.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, waarbij real-time visualisatie van medicijnvrijgave en subcellulaire distributie informatie verschaft over structuur-activiteitsrelaties en de optimalisatie van het nanodragerontwerp voorafgaand aan preklinische efficiëntietesten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot de stabiliteit van nanodragers, geneesmiddelafgiftekinetiek en intracellulaire transportroutes door directe observatie mogelijk te maken van de translocatie van doxorubicine van het cytoplasma naar de nucleus.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve resultaten van geneesmiddelopname en nucleaire accumulatie over de tijd, wat een directe vergelijking van formulatievariabelen onder identieke levende-celcondities mogelijk maakt.
- Analytiek: Biedt time-lapse fluorescentie-intensiteitsgegevens van gedefinieerde regio's van interesse (bijv. nucleus, lysosomen), waardoor statistische vergelijking van de efficiëntie van geneesmiddelafgifte tussen vrije en in nanodeeltjes ingekapselde agentia mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt het gedrag van nanodragers in levende cellen met stroomafwaartse farmacologische uitkomsten door lysosomale transportpatronen te correleren met de nucleaire beschikbaarheid van het geneesmiddel, wat beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van biomarkers ondersteunt.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Vertegenwoordigt een modulaire imaging-capaciteit die toepasbaar is op meerdere nanodeeltjesplatforms en chemotherapeutische agentia, waardoor redundante methodeontwikkeling wordt verminderd en mechanistische screening voor de gehele portfolio mogelijk wordt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in het drugmechanisme door real-time drugafgifte en nucleaire translocatie te onthullen, waardoor ambiguïteit bij target-engagement en pathway-activatie wordt verminderd.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde kamerpreparatie, omgevingscontroles en beeldparameters, waardoor variabiliteit in longitudinale live-cellstudies wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door niet-functionele nanodragers vroegtijdig te identificeren, wat investeringen in afgiftesystemen voorkomt die er niet in slagen het actieve drug af te geven op de plaats van actie.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van nanodragerkandidaten mogelijk op basis van aangetoonde intracellulaire drugafgifte en nucleaire levering, waardoor voortgang in overeenstemming wordt gebracht met mechanistische validiteit.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in live-cell imaging, confocale microscopie en time-lapse acquisitie om de celviabiliteit en signaalintegriteit over langere perioden te behouden.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder temperatuur- en CO2-gecontroleerde incubatie-eenheden, confocale lasers en gevoelige detectoren voor het volgen van nanodeeltjes met een laag signaal.
- Vereist cross-team standaardisatie van celpreparatie, medicijndosering en imaging-protocollen om de vergelijkbaarheid tussen studies en locaties te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan verschillende cellijnen, nanodeeltjesgroottes en fluorescerende labels, aangezien signaal-ruisverhoudingen en fototoxiciteitsdrempels variëren afhankelijk van de experimentele condities.
- Praktische beperkingen omvatten risico's op fotobleking tijdens langdurige imaging en de noodzaak voor zorgvuldige optimalisatie van laservermogen en scansnelheid om de signaalkwaliteit af te wegen tegen de gezondheid van de cellen.
