Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

Het algemene doel van deze verbeterde multiplexmethode is om het aantal eiwitmonsters dat gelijktijdig kan worden geanalyseerd te verhogen, terwijl de monsterfout en de instrumenttijd worden verminderd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen op het gebied van veroudering, neurodegeneratieve ziekten, andere ouderdomsgerelateerde ziekten en kanker die verband houden met pathogenese, progressie, diagnose, prognose en therapeutische doelwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er een uitgebreid overzicht van eiwitveranderingen over vele condities kan worden gegenereerd.

Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de ziekte van Alzheimer in een muismodel, kan deze ook worden toegepast op weefselmonsters van patiënten met Alzheimer of een scala aan andere aandoeningen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode dit uitdagend vinden, omdat er meerdere monsters gelijktijdig binnen een kort tijdsbestek verwerkt moeten worden. We kwamen 처음elijk op het idee voor deze methode toen we beseften dat acetylering gecombineerd kon worden met isobare tagging voor proteïnitratie, wat ons motiveerde om de techniek wereldwijd voor alle peptiden werkend te maken.

Deze studie zal hersen-, hart- en leverweefsels analyseren van een muismodel voor de ziekte van Alzheimer en wild-type controles. Breng 60 tot 90 mg van elk weefselmonster over naar een lysebuis en voeg 500 µL PBS met 8 M ureum toe. Homogeniseer de monsters met een mechanische homogenisator.

Verwijder het weefselhomogenaat uit de lysisbuis en breng dit over in een microcentrifugebuis. Spoel de lysisbuis met 100 tot 500 µL PBS met acht molar ureum en voeg de spoeloplossing toe aan het weefselhomogenaat. Centrifugeer het weefselhomogenaat gedurende 15 minuten.

Verzamel het supernatant van elk monster. Voeg na het uitvoeren van de BCA-assay om de eiwitconcentratie te bepalen, 100 micrograms eiwit van elk monster toe aan individueel gelabelde microcentrifugebuisjes. Voeg dithiothreitol toe aan elk monster.

Incubeer vervolgens gedurende twee uur bij 37 °C. Voeg iodoacetamide (IAM) toe aan elk monster en incubeer twee uur op ijs in het donker. Voeg daarna L-cysteïne toe aan elk monster en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg na 30 minuten trisbuffer met calciumchloride toe om de ureum te verdunnen tot een eindconcentratie van twee molar. Voeg L1 tosilimitotophenylethylcholer methylketon-behandelde trypsine toe aan elk monster. Incubeer dit gedurende 24 uur bij 37 °C.

Stop de volgende dag de eiwitvertering door het monster snel te bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar dit bij -80 °C tot verdere verwerking. Voorafgaand aan de dimethyleringslabeling worden de peptide-monsters ontzout, zoals beschreven in het tekstprotocol, en gedroogd door vacuümcentrifugatie. Om de dimethyleringslabelingprocedure te starten, worden de peptiden gereconstitueerd in 1% azijnzuur opgelost in HPLC- of nanopure-water.

Breng een gedeelte van 50 µg van elk monster over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Bewaar de resterende gereconstitueerde peptiden bij -80 °C voor toekomstige experimenten. In de stappen die nu worden gedemonstreerd, is het essentieel om de reagentia snel toe te voegen, zodat de chemische activeringsreacties voor alle monsters gedurende dezelfde tijd plaatsvinden.

Voeg acht µL van een 60 mM formaldehydsolution toe aan de monsters voor labeling met lichte dimethylering. Voeg acht µL van een 60 mM koolstof 13 deuterium gelabelde formaldehydsolution toe aan de monsters voor labeling met zware dimethylering. Voeg acht µL 24 mM natriumcyanoborohydride toe aan de monsters die met lichte dimethylering zijn gelabeld.

Voeg acht microliter 24 millimolair natriumcyanoboro-hydride toe aan de monsters die zijn gelabeld met zware dimethylering. Vortex de monsters en schud ze vervolgens voorzichtig op een buisenschudmachine gedurende ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur. Stop de reacties door 16 microliter 1% ammoniak toe te voegen gedurende vijf minuten.

Zuur de reactiemengsels opnieuw aan door acht µL 5% mierenzuur toe te voegen. Combineer de licht en zwaar dimethylated peptides om in totaal zes monsters te verkrijgen. Voer de ontzouting van de monsters uit zoals beschreven in het tekstprotocol.

En droog de monsters door middel van vacuümcentrifugatie. Om te beginnen met de isobarische labeling van de dimethylated monsters, reconstitueer eerst 100 µg dimethylated peptiden in triethylammoniumbicarbonaat, of TEAB-buffer. Bereid vervolgens de isobarische reagentia volgens het protocol van de fabrikant van de isobarische labelingkit.

Voeg het juiste volume, in dit geval 41 µL van het opgeloste isobarische taggingsreagens, toe aan elk van de peptideproeven en vortex dit ongeveer 10 seconden. Schud de monsters ongeveer één uur bij kamertemperatuur op een microcentrifugebuisjes-schudder. Voeg om de reacties te stoppen 8 µL hydroxylamine toe aan elk monster.

Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg de zes gelabelde monsters samen tot één mengsel en ontzout dit. Bereid de peptiden voor op vloeistofchromatografie door de peptiden te resuspenderen in water van massaspectrometrie-kwaliteit met 0,1% mierenzuur.

Voeg de gereconstitueerde peptiden toe aan een microcentrifugebuis met een 0,65 µm filter. Centrifugeer gedurende één minuut bij 12.000 ×g. Verwijder het filter en gooi dit weg.

Breng de gefilterde peptiden over naar een autosampler-vial. Injecteer zes µL van elk sterk kationuitwisselingsfractiemonster op een trapkolom. Pak deze tot twee centimeter met C18-materiaal.

Voer de methoden uit voor analytische scheiding en data-acquisitie met de massaspectrometer. Er werd een 12-plex cPilot-analyse uitgevoerd op hersen-, hart- en leverweefsels van een muismodel voor de ziekte van Alzheimer en wildtype controles. Precursor-data toonden lichte en zware gedimethyleerde peptiden aan, vertegenwoordigd door de pieken bij m/z 643,854 en 647,875.

Deze peptiden werden geselecteerd, onafhankelijk geïsoleerd en gefragmenteerd met botsingsgeïnduceerde dissociatie om deze spectra te genereren. De zoekresultaten gaven aan dat de pieken toebehoorden aan een peptide van het eiwit fosfoglyceraatkinase één. Deze pieken werden verder geïsoleerd voor tandem-massaspectrometrie met hogere-energiebotsingsdissociatie en de reporter-ionen zijn waargenomen zoals getoond.

Beide sets driedubbele massaspectrometrie-spectra zijn nodig om informatie over de 12 monsters te verkrijgen. In dit voorbeeld zijn de ionverhoudingen tussen de Alzheimerziekte en de wild-type controle vergelijkbaar over de twee biologische replica's voor hersen-, lever- en hartweefsels. De fold change-waarden voor elke vergelijking suggereren dat de spiegels van fosfoglyceraatkinase 1 in de hersenen en het hart hoger zijn bij muizen met Alzheimerziekte, maar lager in de lever.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer vijf uur worden uitgevoerd mits correct uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om zorgvuldig om te gaan met de monsters. Om de diepte en dekking per dag te vergroten, kunnen scheidingsmethoden zoals sterke kationuitwisseling of fractionering bij een hoge pH in deze procedure worden geïntegreerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u sample-multiplexing kunt verbeteren met C-Pilot.