Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

Het algemene doel van deze verbeterde multiplexmethode is om het aantal proteïnemonsters dat tegelijkertijd kan worden geanalyseerd te verhogen, terwijl de monsterfout en instrumenttijd worden verminderd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van veroudering, neurodegeneratieve ziekten, andere leeftijdsgerelateerde ziekten en kanker die verband houden met pathogenese, progressie, diagnose, prognose en therapeutische doelwitten. Het grote voordeel van deze techniek is dat een uitgebreid momentopname van eiwitveranderingen over vele omstandigheden kan worden gegenereerd.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de ziekte van Alzheimer bij muismodellen, kan deze ook worden toegepast op weefselmonsters van patiënten met de ziekte van Alzheimer of een reeks andere aandoeningen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode het een uitdaging vinden omdat er in een korte tijdsperiode meerdere monsters tegelijkertijd moeten worden verwerkt. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we ons realiseerden dat acetylering kon worden gecombineerd met isoberische tagging voor eiwitnitratie, wat ons motiveerde om de techniek wereldwijd voor alle peptiden te laten werken.

Deze studie zal hersen-, hart- en leverweefsel van een muismodel voor de ziekte van Alzheimer en wildtype controles analyseren. Breng 60 tot 90 milligram van elk weefselmonster over naar een lyseringsbuis en voeg 500 microliter PBS met acht molair ureum toe. Homogeniseer de monsters met behulp van een mechanische homogenisator.

Verwijder het weefselhamomgenaat uit de lyseringsbuis en breng het over naar een microcentrifugebuis. Spoel de lyseringsbuis af met 100 tot 500 microliter PBS met acht molair ureum en combineer de spoelvloeistof met het weefselhamomgenaat. Centrifugeer het weefselhamomgenaat gedurende 15 minuten.

Kluit het supernatant van elk monster. Na het uitvoeren van de BCA-test om de eiwitconcentratie te bepalen, voeg 100 microgram eiwit van elk monster toe aan afzonderlijk gelabelde microcentrifugebuizen. Voeg dithiothreitol toe aan elk monster.

En incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Voeg iodoacetamide, IAM, toe aan elk monster en incubeer gedurende twee uur in het donker op ijs. Voeg vervolgens L-cysteïne toe aan elk monster en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Na 30 minuten voeg je trisbuffer met calciumchloride toe om ureum te verdunnen tot een eindconcentratie van twee molair. Voeg L1 tosilimitotofenylethylcholer methylketon-behandeld trypsine toe aan elk monster. En incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.

Op de volgende dag doodt u de eiwitvertering door het monster in vloeibare stikstof te flashvriezen en bewaart u het op min 80 graden Celsius tot verdere verwerking. Vóór dimethyleringslabeling worden de peptidemonsters ontzilt, zoals beschreven in het tekstprotocol, en gedroogd door vacuümcentrifugering. Om de dimethyleringslabelingprocedure te beginnen, giet de peptiden in 1%azijnzuur opgelost in HPLC of nanopure grade water.

Verwijder een deel van 50 microgram van elk monster naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Bewaar de rest van de gereconstitueerde peptiden op min 80 graden Celsius voor toekomstige experimenten. In de volgende stappen is het van cruciaal belang om reagentia snel toe te voegen, zodat de chemische reacties die mogelijk zijn, gedurende dezelfde tijd voor alle monsters plaatsvinden.

Voeg acht microliter van een 60 millimolair formaldehyde-oplossing toe aan de monsters voor labeling met lichte dimethylering. Voeg acht microliter van een 60 millimolair koolstof 13 deuterium-gelabelde formaldehyde-oplossing toe aan de monsters voor labeling met zware dimethylering. Voeg acht microliter van 24 millimolair natriumcyanoborohydride toe aan de monsters gelabeld met lichte dimethylering.

Voeg acht microliters van 24 millimolair natriumcyanoboroduderide toe aan de monsters gelabeld met zware dimethylering. Vortex de monsters en schud ze vervolgens zachtjes op een buisjesschudder gedurende ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur. Doodt de reacties door 16 microliters 1%ammoniak gedurende vijf minuten toe te voegen.

Heracidificeer de reactiemengsels door acht microliter van 5%mierenzuur toe te voegen. Combineer de lichte en zware gedimethyleerde peptiden om in totaal zes monsters te genereren. Voer monsterontzilting uit zoals beschreven in het tekstprotocol.

En droog de monsters door vacuümcentrifugering. Om isobarische tagging van de gedimethyleerde monsters te beginnen, giet u eerst 100 microgram gedimethyleerde peptiden en triethylammoniumbicarbonaat of TEAB-buffer. Bereid vervolgens isobare reagentia volgens het protocol van de fabrikant van de isobare taggingkit.

Voeg het juiste volume toe, in dit geval 41 microliter van de gesolubiliseerde isobare taggingreagens, aan elk van de peptidemonsters en vortex gedurende ongeveer 10 seconden. Schud de monsters op een microcentrifugebuisjesschudder gedurende ongeveer een uur bij kamertemperatuur. Om de reacties te doden, voeg je 8 microliters hydroxylamine toe aan elk monster.

En incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Meng de zes gelabelde monsters tot een enkele mix en ontzilt. Bereid de peptiden voor op vloeistofchromatografie door de peptiden op te lossen in water voor massaspectrometrie met 0,1%mierenzuur.

Voeg de gereconstitueerde peptiden toe aan een microcentrifugebuis met een 0,65 micrometerfilter. En centrifugeer gedurende één minuut bij 12.000 keer g. Verwijder en gooi het filter weg.

Breng gefilterde peptiden over naar een autosampler-vial. Injecteer zes microliter van elk monster van de sterke kationenuitwisselingsfractie op een vangkolom. Pak twee centimeter met koolstof 18-materiaal.

Voer de analytische scheiding en data-acquisitie-massaspectrometriemethoden uit. Een 12-plex cPilot-analyse van hersen-, hart- en leverweefsel van een muismodel voor de ziekte van Alzheimer en wildtype controles werd uitgevoerd. Precursorgegevens toonden lichte en zware gedimethyleerde peptiden weergegeven door de pieken bij m