Het analyseren van dendrietmorfologie in Kolommen en Lagen
23 maart 2017
Hier laten we zien hoe dendritische routering van Drosophila merg neuronen in de kolommen en lagen te analyseren. De werkstroom een dual-beeldvorming techniek om de beeldkwaliteit en computerhulpmiddelen voor opsporing, registratie dendritische assen aan de hand kolommatrix en voor de analyse van dendritische structuren in 3D te verbeteren.
Het algemene doel van dit protocol is om de dendritische route van volwassen drosophila medulla-neuronen in kolommen en lagen te analyseren om dendritische patronen te karakteriseren, celtypen te bepalen op basis van morfologie en mutanten te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de neurowetenschappen, inclusief het in kaart brengen van de hersencircuits en het begrijpen van de bedradingsmechanisme van de dendriet. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de dendritische eigenschappen in driedimensionale ruimte doorgeven, waardoor het begrip van de dendritische bedradingslogica en functies wordt verbeterd.
Het doel van deze procedure is om twee beeldstacks van de belangrijke neuronen in twee orthogonale, horizontale en frontale oriëntaties te verkrijgen. Gebruik de standaardtechnieken, kleed gesneden vlieghersens in met konijnen anti-GFP en een antilichaam dat primaire antilichamen op fotoreceptoraxonen labelt. Label vervolgens de primaire antilichamen met fluorescente secundaire antilichamen en maak de hersenen helder in 70% glycerol en 1X PBS.
Om de hersenen in de horizontale oriëntatie te monteren, breng een glycerol-heldere hersenen over in een druppel van 20 microliter antifade montagemedium die centraal op de microscoopplaat wordt gedeponeerd. Bevestig vervolgens op een dekglas kleine stukken klei op de vier hoeken om te voorkomen dat het dekglas de hersenen verplettert. Positioneer nu onder een dissectiemicroscoop de hersenen in de ventrale omhoog positie.
Gebruik het convexe dorsale oppervlak van de hersenen als oriëntatiepunt om de oriëntatie van de hersenmonster te identificeren. Dit geeft een horizontaal beeld van het neuron. Bevestig vervolgens het dekglas.
Gebruik een confocale microscoop, idealiter uitgerust met GaAsP-detectoren, om de horizontale weergave van de beeldstack te verkrijgen met een objectief met hoge numerieke opening en een digitale zoom van 2,5. Verkrijg minimaal 180 optische secties, met 512 vierkante pixels en een stapgrootte van 2 micron. Verwijder na het nemen van de eerste beeldstack het dekglas van de plaat en plaats de hersenen opnieuw in de anterieure omhoog positie die een frontale weergave biedt.
Maak vervolgens met dezelfde techniek een nieuwe beeldstack van de frontale weergave van dezelfde neuronen die in de horizontale weergave zijn afgebeeld. Zorg ervoor dat u ook de locatie van het belangrijke neuron ten opzichte van de medulla neuropal registreert. Het identificeren van dezelfde neuronen is mogelijk onder lagere vergroting.
Als het signaal verloren gaat omdat het weefsel diep is, beeld dan alleen de ventrale helft van uw hersenen af. Controleer ook of het monster is verplaatst tijdens het verwerven van beelden door de beeldstacks te bekijken. Beelddeconvolutie en beeldcombinatie worden gedetailleerd beschreven in het tekstprotocol.
Het doel van deze procedure is om neurieten te traceren en referentiepunten toe te wijzen voor registratie. Open eerst het gecombineerde beeldbestand. Ga vervolgens naar bewerken.
Vervolgens toon displayaanpassing en schakel het fotoreceptorkanaal uit, dat rood is. Visualiseer vervolgens het beeld in de surpass-modus. Als de computer is uitgerust met een stereograafsysteem, schakel stereo in en gebruik de quad-buffermodus om 3D-beelden te visualiseren.
Voeg nieuwe filamenten toe, ga naar surpass, vervolgens naar filamenten en klik op het tabblad met de naam automatische creatie overslaan, handmatig bewerken. Klik vervolgens op de teken-tab en selecteer AutoDepth. Selecteer vervolgens instellingen.
Schakel de lijnoptie in en voer het juiste pixelnummer in voor betere visualisatie. Schakel vervolgens dendrieten, beginpunt en vertakkingspunt weer en stel de renderkwaliteit in op 100%. Selecteer nu de teken-tab en begin met het traceren van neurieten. Begin met het axon, ga dan naar de dendrieten.
Het axon en de dendrieten van de trans medulla-neuronen moeten gemakkelijk te onderscheiden zijn. Na het traceren van de neurieten, ga terug naar instellingen en schakel zowel beginpunt als vertakkingspunt uit. Ga vervolgens naar surpass en exporteer.
Selecteer object en sla het filament op als een inventor-bestand. De volgende stap is om referentiepunten toe te wijzen. Selecteer om te beginnen show displayaanpassing en schakel beide beeldkanalen in.
Ga vervolgens naar surpass en vervolgens naar meting. Schakel onder het tabblad bewerken het specifieke kanaal in en selecteer in dit geval het fotoreceptorkanaal. Wijs vervolgens referentiepunten toe voor de bovenste laag.
Selecteer surpass, vervolgens meetpunten en markeer het begin van de m1-laag als bovenste laag. Gebruik de clipping-vlakfunctie om de punttoewijzing te vergemakkelijken. De volgorde van de punten is equatoriaal, anterieure equatoriaal, anterieure, anterieure ventrale, ventrale, posterieure ventrale, posterieure, posterieure equatoriaal en centrum.
Om het centrale fotoreceptor te vinden, is het degene die is geassocieerd met de meeste dendritische processen. Wijs vervolgens de referentiepunten toe voor de R8 en R7-lagen met behulp van dezelfde techniek. Na het definiëren van elke set referentiepunten, exporteer de coördinaten.
Selecteer statistieken, vervolgens gedetailleerd, specifieke waarden en positie. Selecteer vervolgens statistieken exporteren op tabblad weergave naar bestand en sla de coördinaten op als een CSV-bestand. Open vervolgens de drie CSV-bestanden in een spreadsheeteditor.
Kopieer en plak de coördinaten van de 27 referentiepunten in een nieuw bestand, volg de volgorde van top, R8 en vervolgens R7. Volg vervolgens het tekstprotocol voor rigid body en TPS niet-lineaire registratiestandaardisatie naar de rechter ventrale configuratie bij de berekening van dendritische vertakking en terminatiefrequenties. Uiteindelijk worden de gegevens gebruikt om verschillende informatieve grafieken te maken. Met behulp van de dubbele weergavebeeldvormingsprocedure die hier wordt gepresenteerd, werd een vlieg hersenen met schaarse gelabelde tm 20-neuronen in twee orthogonale richtingen afgebeeld.
Beeldrecombinatie verbetert de axiale resolutie. Het gecombineerde beeld heeft een betere resolutie dan die van de horizontale weergave en frontale weergave beelden. Na raadpleging van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om de dendritische routing van neuronen in de medulla van volwassen Drosophila in kolommen en lagen te analyseren. Er wordt gebruikgemaakt van dual-view imaging-technieken en computationele hulpmiddelen om de beeldkwaliteit te verbeteren en dendritische structuren in een 3D-ruimte te analyseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Neuroanatomie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Dendritische routering is cruciaal voor het begrijpen van hersencircuits.
- Het karakteriseren van dendritische patronen helpt bij het bepalen van celtypen.
- Het identificeren van mutanten kan inzicht verschaffen in de neurale functie.
- 3D-analyse verbetert het begrip van de logica achter de dendritische bedrading.
Doel van de studie
- Om de dendritische routering in neuronen van de medulla van Drosophila te analyseren.
- Om dendritische patronen te karakteriseren en celtypen te bepalen.
- Om mutanten te identificeren die de dendritische morfologie beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Verkrijg twee beeldstacks van neuronen in orthogonale oriëntaties.
- Kleur gedissecteerde vliegenhersenen met specifieke antilichamen.
- Label primaire antilichamen met fluorescente secundaire antilichamen.
- Maak de hersenen transparant met glycerol en PBS voor beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Verbeterde beeldvormingstechnieken verbeteren de analyse van de dendritische structuur.
- 3D-mapping onthult de complexe bedrading van dendrieten.
- Karakterisering van celtypen op basis van morfologie wordt gerealiseerd.
- Identificatie van mutanten biedt inzicht in de neurale ontwikkeling.
Conclusies
- Deze methode draagt aanzienlijk bij aan het begrip van dendritische routering.
- Het vergemakkelijkt de in kaartbrenging van hersenfuncties in Drosophila.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek inzetten voor bredere toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Dit protocol maakt high-resolution 3D-analyse van de dendritische architectuur in gedefinieerde neurale circuits mogelijk, wat target-validatie in de neurofarmacologie ondersteunt door structurele fenotypes te koppelen aan genetische perturbaties. Door de laagspecifieke terminatie en planaire projectie van dendritische arbors te kwantificeren, biedt het mechanistische risicoreductie voor CNS-drug discovery via een verbeterd voorspellend vertrouwen in neurale circuitmodellen. De workflow faciliteert de identificatie van celtype-specifieke defecten, wat bijdraagt aan de afstemming van translationele biomarkers en de verfijning van preklinische modellen voor neuropsychiatrische indicaties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door dendritische morfologie te correleren met genetische of farmacologische manipulaties in gedefinieerde neuronale subtypen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie via kwantitatieve beoordeling van dendritische vertakkings- en terminatiefrequenties als functionele readouts.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in targets door structuur-functierelaties vast te stellen in neurale circuits van de medulla die relevant zijn voor geconserveerde neurodevelopmentale pathways.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare 3D-dendritische traceringen die zijn geregistreerd aan een referentie-kolumnair raamwerk voor een consistente morfologische scoring.
- Kwantitatieve output: Levert laagspecifieke terminatiefrequenties en planaire projectiemetrieken die high-content analyse van dendritische patroonvorming mogelijk maken.
- Platformnut: Maakt gebruik van open-source MIPAV- en MATLAB-toolboxes, wat schaalbaarheid en reproduceerbaarheid tussen laboratoria ondersteunt in screeningcampagnes gericht op neuroanatomie.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Koppel dendritische defecten aan specifieke lagen (bijv. m1–m3 voor tm20 versus m2/m5 voor tm2), wat afstemming mogelijk maakt met translationele biomarkers van circuitdysfunctie.
- Preklinische continuïteit: Biedt een ziekterelevant systeem voor het evalueren van genetische mutanten die de neuronale bedrading beïnvloeden, ter ondersteuning van risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt defecten in de bedradingslogica in neuro-ontwikkelingsmodellen, waardoor ambiguïteit in target-engagementstudies wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door beeldgegevens om te zetten in kwantificeerbare dendritische kenmerken, die dienen als input voor de fasen van lead-identificatie en preklinische validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing via 3D-dendritische tracing en laagspecifieke analyse om neuronale identiteit en circuitlogica te verduidelijken.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk door referentiegebaseerde registratie en geautomatiseerde tracing van dendritische vertakkingen over verschillende genetische achtergronden.
- Analytics: Leidt vertakkings- en beëindigingsfrequenties af als kwantitatieve read-outs voor het vergelijken van condities in mutant- versus wild-type analyses.
- Translational Research: Verbindt dendritische laagvoorkeuren met vermeende homologen in de vertebraten-cortex, wat de translationele continuïteit tussen soorten ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare imaging- en analysepipeline voor systematische fenotypering van neuronale mutanten in discovery-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij neuronale fenotypering door ruimtelijk opgeloste data over de dendritische architectuur te leveren.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door recombinatie van beelden vanuit twee perspectieven en gestandaardiseerde toewijzing van referentiepunten over de verschillende lagen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door objectieve, op morfologie gebaseerde stratificatie van neuronale subtypen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van de structurele getrouwheid van dendritische modellen in ziekterelevante systemen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie, 3D-beeldregistratie en analyse van neuronale morfologie.
- Afhankelijk van objectieven met een hoge NA, GaAsP-detectoren en computationele platforms die MIPAV en MATLAB-gebaseerde tracing ondersteunen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor consistente kleurings-, clearing- en beeldvormingsprotocollen over laboratoria heen.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan wijziging van referentiekaders en laagdefinities vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten signaalverlies in diepe weefsels en gevoeligheid voor beweging van het monster tijdens dual-view acquisitie.
