Het gebruik van een β-lactamase gebaseerde Conductimetric Biosensor Assay voor het detecteren van biomoleculaire interacties

Het algemene doel van deze Conductimetrische Biosensor Assay is het detecteren van biomoleculaire interacties, met behulp van de hybride beta-lactamase-technologie. We beschrijven een methode om antilichaam-antigeen interacties te detecteren, met behulp van een chimeer beta-lactamase-eiwit. Het principe van deze methode berust op het detecteren van binding door het meten van de protonafgifte van de beta-lactamase-activiteit.

Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele immunosensoren is het gebruik van een chimeer beta-lactamase, waardoor goedkopere en snellere sensorische analyses mogelijk zijn door gebruik te maken van een hybride eiwit om de analyten te detecteren. De procedure wordt gedemonstreerd door Mathieu Dondelinger, een afgestudeerde onderzoeker. Begin deze procedure met de bereiding van het eiwitmonster en de oplossing zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid de herbruikbare elektrode voor door de uiteinden twee minuten lang in putjes van een 96-wells plaat te dompelen die elk 300 microliter elektrodevoorbereidingsoplossing bevatten, met zacht mengen bij kamertemperatuur.

Herhaal deze stap drie keer. Spoel vervolgens de elektroden door de uiteinden twee minuten lang in putjes van een 96-wells plaat te dompelen die elk 300 microliter gedistilleerd water bevatten, met zacht mengen bij kamertemperatuur. Om de elektroden te regenereren, dompel de uiteinden twee minuten lang in putjes van een 96-wells plaat die elk 300 microliter regeneratieoplossing bevatten, overnacht bij vier graden Celsius of een uur bij kamertemperatuur.

Voer vervolgens drie wasbeurten van de elektroden uit door de uiteinden twee minuten lang in putjes van een 96-wells plaat te dompelen die elk 300 microliter fosfaatgebufferde zoutoplossing bevatten. Voer elke wasbeurt uit met zacht mengen bij kamertemperatuur. Bekleed het henneneiwit-lysozym op het polyaniline-oppervlak van de elektrode door een druppel van 15 microliter van 40 microgram per milliliter HEWL, bereid in fosfaatbuffer, op het elektrode-oppervlak te deponeren.

Incubeer de elektrode een uur bij kamertemperatuur. Voer vervolgens drie wasbeurten van de elektroden uit met fosfaatbuffer door de elektrode-onderdelen van de sensorchips in een putje van een 96-wells plaat te dompelen die elk 300 microliter fosfaatbuffer bevatten. Voer elke wasbeurt uit met zacht mengen bij kamertemperatuur.

Verzadig de elektroden door een druppel van 30 microliter van de blokkeringsoplossing op het oppervlak van de elektrode te deponeren. Incubeer een uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens drie keer zoals eerder beschreven.

Verdun de BlaP-cAb-Lys3 of BlaP oplossingen tot 20 microgram per milliliter in bindingsbuffer. Breng vervolgens een druppel van 15 microliter van deze verdunde oplossing aan op de elektroden. Incubeer de elektroden een uur bij kamertemperatuur.

Na de antigeen-nanobie-reactie, was de elektroden drie keer met wasoplossing. Was vervolgens de elektroden van de sensor in detectiebuffer door de elektroden in een putje van een 96-wells plaat te dompelen dat elk 300 microliter detectiebuffer bevat. En incubeer kort gedurende een minuut.

Voor detectie, sluit de digitale multimeter aan op de computer. Sluit vervolgens de sensorchip aan op de digitale multimeter via het koperen circuitgedeelte. Start de sensorrespons door een druppel van 50 microliter van een oplossing van vier millimolar benzylpenicilline op de positief gelabelde elektroden aan te brengen.

Breng een druppel van 50 microliter van de detectieoplossing aan op de negatief gelabelde elektroden om als negatieve controle te dienen. Monitor de conductometrische waarden met de aangesloten digitale multimeter gedurende 30 minuten. Visualiseer de gegevens in realtime direct op het scherm, of exporteer de digitale gegevens als tekstbestand.

Deze ruwe gegevens kunnen worden uitgezet om een grafische uitvoer te maken die de metingen van de geleidbaarheidsveranderingen tussen de referentie- en monsterelektroden weergeeft tegen de tijd. Om het chimere proteïne te construeren, werd de klasse A beta-lactamase BlaP gebruikt als het dragereiwit. Hier zijn de katalytische residuen in rood weergegeven.

De insertieplaats die zich in een oplosmiddel-exponeerde lus bevindt, is aangegeven in geel. Het camelide antilichaamfragment genaamd cAb-Lys3 werd in BlaP geïnsert. Het resulterende chimere proteïne, BlaP-cAb-Lyse3, is in staat om HEWL te binden terwijl de beta-lactamase-activiteit behouden blijft.

HEWL werd geïmmobiliseerd op een polyaniline gecodeerde elektrode voordat BlaP-cAb-Lys3 werd geladen. De afgifte van protonen bij hydrolyse van benzylpenicilline door het geïmmobiliseerde chimere proteïne induceert geleidbaarheidsveranderingen die door de gebruiker kunnen worden geïnterpreteerd. De sensoren bevatten acht chips die zijn georganiseerd als vier paren.

Elke chip bevat drie elektroden, één met polyaniline gecoate werkelektrode, één referentie-elektrode en één tegenelektrode. Voor elk paar correspondeert de negatieve chip met een negatieve controle, terwijl de positieve chip correspondeert met het geteste monster. Hier worden geleidbaarheidsmetingen getoond die de specifieke interactie van BlaP-cAb-Lys3 met HEWL weergeven.

De geleidbaarheidsveranderingen zijn het gevolg van de protonafgifte die wordt geïnduceerd door antibioticumhydrolyse door het geïmmobiliseerde chimere beta-lactamase. Er kon geen binding worden gedetecteerd voor de negatieve controle, native beta-lactamase BlaP. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in een halve dag worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd en de experimentele omstandigheden zijn geoptimaliseerd.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het inbrengen van een antilichaamfragment in BlaP een uitdaging is. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat de kwaliteit van de gegenereerde gegevens afhankelijk is van de functionaliteit van het chimere beta-lactamase. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden die de kwantificering van de gedetecteerde interactie mogelijk maken, worden uitgevoerd om de evenwichtsassociatieconstante van deze interactie te bepalen.

Na de ontwikkel