Name: Het gebruik van een β-lactamase gebaseerde Conductimetric Biosensor Assay voor het detecteren van biomoleculaire interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Ontdek een conductimetrische biosensor met hybride β-lactamasetechnologie voor het detecteren van antilichaam-antigeeninteracties. Deze methode meet protonafgifte en biedt een snellere, kosteneffectievere aanpak dan conventionele immunosensoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs erkennen het Waals Gewest in het kader van de onderzoeksprojecten SENSOTEM en NANOTIC alsmede de nationale middelen voor het wetenschappelijk onderzoek (FRS-F.N.R.S) voor hun financiële steun.

1. bereiding van de monsters eiwitten
<ol><li>Produceren en te zuiveren van de hybride proteïne BlaP-cAb-Lys3 zoals gemeld in onze vorige studie15. Bewaar het eiwit in 50 mM fosfaatbuffer pH 7.4 met de volgende samenstelling: 8 g NaCl, KCl 0.2 g, 1,44 g nb2HPO4 en 0,24 g. van KH2PO4 opgelost in 800 mL gedestilleerd water Fix de pH van de oplossing aan 7.4 vóór aanpassing van het uiteindelijke volume van de oplossing op 1 steriliseren L. Filter de eiwit-oplossing.</li>
	<li>Voorbereiden van een stamoplossing van kip ei wit lysozym (HEWL). Los 100 mg (40.000 eenheden/mg) commercieel gekochte HEWL in 10 mL fosfaat buffer zoutoplossing (PBS Zie stap 2.1.1). De eiwit-oplossing steriliseren door filtratie met behulp van filters met een 0,22 μm cutoff.</li>
</ol>2. biosensor Assays
<ol><li>
Bereiding van de oplossing en buffer
	<ol>
<li>50 mM PBS voor te bereiden door het oplossen van 8 g NaCl, KCl 0.2 g, 1,44 g nb2HPO4en 0,24 g van KH2PO4 in 800 mL gedestilleerd water. Op een pH van 7,4 met 1 N HCl of 1 N NaOH aanpassen vooraleer u het volume van de oplossing op 1 L. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C.</li>
		<li>Bereid een oplossing van verzadiging/blokkeren door ontbinding van de 3 g van caseïne hydrolysaat in 100 mL PBS bereid zoals hierboven beschreven (zie stap 2.1.1). Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C.</li>
		<li>Bereid een bindende oplossing door ontbinding van 1 g van caseïne hydrolysaat in 100 mL PBS bereid zoals hierboven beschreven (zie stap 2.1.1). Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C.</li>
		<li>Bereid een wassen-oplossing (0,1% Tween - PBS) door toevoeging van 100 μl van tween-20 (100%) in 100 mL PBS bereid zoals hierboven beschreven (zie stap 2.1.1). Bewaren bij 4 ° C.</li>
		<li>Bereid de oplossing van een elektrode voorbereiding (1% Triton X-100-PBS) door toevoeging van 1 mL van Triton X-100 (100%) in 100 mL PBS bereid zoals hierboven beschreven (zie stap 2.1.1). Bewaren bij 4 ° C.</li>
		<li>Bereid een elektrode regeneratie-oplossing (3.5 M KCl) door ontbinding van 26 g van KCl in gedestilleerd water tot een eindvolume 100 mL. Filter gesteriliseerd en winkel bij 4 ° C.</li>
		<li>Bereid een 5 mM NaCl oplossing door ontbinding 0.29 g NaCl in gedestilleerd water tot een eindvolume van 1 L. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C. Vervolgens bereid een detectie-oplossing (4 mM Benzylpenicilline) door ontbinding 26.7 mg Benzylpenicilline in 20 mL 5 mM NaCl-oplossing. Filter steriliseren en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van de sensor en regeneratie Opmerking: De polyaniline bekleed sensor chips werden ontwikkeld en vriendelijk geleverd door Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus en Prof. Y. Glupczynski (Katholieke Universiteit van Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). De beschrijving van de sensor, alsmede de polyaniline electro-polymerisatie protocollen die worden gebruikt voor het synthetiseren van deze sensoren worden gedetailleerd beschreven in hun eerdere werk17. Kortom, dit systeem maakt gebruik van herbruikbare sensoren van acht afzonderlijke chips die werden vervaardigd door klassieke printed circuit board (PCB) technieken. Individuele fiches zijn samengesteld uit drie elektrode ronde vlekken. De bovenste is de elektrode werken op welke polyaniline was electro-gesynthetiseerd. De middelste is de referentie-elektrode en de elektrode van de bodem vormt de teller-elektrode. Zowel de verwijzing als de elektroden van de teller zijn matiemaatschappij met behulp van solide Ag/AgCl amalgaam bovenop de koolstof laag.<ol>
<li>Voeren 3 wasbeurten van de elektroden door dompelen de tips in wells van een 96-wells-plaat met 300 µL per putje van elektrode voorbereiding oplossing (1% Triton X-100-PBS, zie stap 2.1.5.). Voer elke wassen voor 2 min met zacht mengen bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Spoel de elektroden door dompelen de tips in wells van een 96-wells-plaat met 300 µL per putje gedestilleerd water gedurende 2 minuten met zacht mengen bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Het regenereren van de elektroden door dompelen de tips in wells van een 96-wells-plaat met 300 µL per putje van regeneratie oplossing (3.5 M KCl, zie stap 2.1.6) overnachting bij 4 ° C of 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeren 3 wasbeurten van de elektroden door dompelen de tips in wells van een 96-wells-plaat met 300 µL per putje fosfaat buffer zoutoplossing (zie stap 2.1.1.). Voer elke wassen voor 2 minuten met zacht mengen bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bindende bepaling uitgevoerd op de sensor
	<ol>
<li>Jas HEWL op het oppervlak van de PANI (polyaniline) van de elektrode door nederlegging van een daling van de 15 µL van 40 µg/mL HEWL bereid in PBS op het oppervlak van de elektrode. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C of 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Uitvoeren van drie wasbeurten van de elektroden met fosfaat buffer saline (zie stap 2.1.1) door dompelen de delen van de elektrode van de sensor chips in wells van een 96-wells-plaat met 300 µL per putje fosfaat buffer zoutoplossing. Voer elke wassen voor 2 min met zacht mengen bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verzadigen de elektroden door het toevoegen van een daling van de 50 µL van de blokkerende oplossing (zie stap 2.1.2) op het oppervlak van de elektrode. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Vervolgens wassen drie keer zoals beschreven in de vorige stap (zie stap 2.3.2).</li>
		<li>Verdun de oplossing BlaP-cAb-Lys3 naar 20 µg/mL in bindende oplossing (zie stap 2.1.3) en een daling van de 15 µL van deze verdunde oplossing op de elektroden van toepassing. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na de antigeen-nanobody reactie, wassen drie keer zoals beschreven in de vorige stap met behulp van de wash-oplossing (zie stap 2.1.4). Spoel de elektrode keer met PBS (zie stap 2.1.1).</li>
		<li>Sluit voor de detectie, de spaander van de sensor via het koper-circuit deel aan een digitale multimeter. Vervolgens, het starten van de reactie van de sensor door een daling van de 50 µL van detectie oplossing toe te passen (zie stap 2.1.7) op de positieve elektroden en een daling van de 50 µL van NaCl 5 mM oplossing op de negatieve elektroden (zie stap 2.1.7) toe te passen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De huidgeleiding controleren met een digitale multimeter. Opmerking: De multimeter werd verzorgd door Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus en Prof. Y. Glupczynski (Katholieke Universiteit van Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Deze potentiostaat is computergestuurde via een USB-poort en analyseert de acht verschillende chips van de sensor tegelijk. De software gemaakt door Yunus en collega's17 creëert een real-time plot die de metingen van het geleidingsvermogen verschil tussen de elektroden van de referentie- en monster tegen de klok vertegenwoordigt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Higgins, I. J., Lowe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+principles+and+applications+of+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Introduction to the principles and applications of biosensors.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).</li>
<li>Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+sensors%3A+principles%2C+problems+and+potential+for+detection+of+pathogens+and+associated+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins.</a> Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).</li>
<li>Huston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+of+antibody+binding+sites%3A+recovery+of+specific+activity+in+an+anti-digoxin+single-chain+Fv+analogue+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).</li>
<li>Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+a+single-chain+Fv+antibody+for+specific+detection+of+Bacillus+anthracis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Sheriff, S., Constantine, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+minimal+antigen-binding+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Redefining the minimal antigen-binding fragment.</a> Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).</li>
<li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+conserved+cryptic+epitopes+of+infectious+agents+by+single+domain+antibodies.+African+trypanosomes+as+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm.</a> J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).</li>
<li>Thanongsaksrikul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+V+H+H+that+neutralizes+the+zinc+metalloproteinase+activity+of+botulinum+neurotoxin+type+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A.</a> J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+antigen+immunosensing+based+on+mixed+self-assembled+monolayers%2C+camel+antibodies+and+colloidal+gold+enhanced+sandwich+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).</li>
<li>Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+beta-lactamase+in+enzyme+immunoassays+for+detection+of+microbial+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens.</a> J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).</li>
<li>Kojima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+circularly+permutated+beta-lactamase+tethered+to+antibody+domains+by+specific+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules.</a> Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).</li>
<li>Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+Ligand-Dependent+Enzyme+by+Fusing+Circularly+Permuted+Antibody+Variable+Region+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains.</a> Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).</li>
<li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+licheniformis+BlaP+beta-lactamase+as+a+model+protein+scaffold+to+study+the+insertion+of+protein+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments.</a> Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).</li>
<li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+easy+development+of+versatile+tools+to+study+protein%2Fligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions.</a> Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).</li>
<li>Crasson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+functionalization+of+a+nanobody+using+protein+insertion+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology.</a> Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).</li>
<li>Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400511002668">A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).</li>
<li>Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+BYG+Carba+Test%2C+a+New+Electrochemical+Assay+for+Rapid+Laboratory+Detection+of+Carbapenemase-Producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).</li>
<li>Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+under+electrical+stimulation+of+neural+probe+coated+with+polyaniline%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).</li>
<li>Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalization+of+porous+polypropylene+membranes+with+polyaniline+for+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization.</a> Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).</li>
<li>Khatkhatay, M. I., Desai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+performances+of+four+enzymes+used+in+ELISA+with+special+reference+to+beta-lactamase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay%22%5BJournal%5D)">A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase.</a> J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).</li>
<li>Worn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).</li>
<li>Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+allosteric+protein+switches+by+domain+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">Engineering allosteric protein switches by domain insertion.</a> Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).</li>
<li>Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+protein+switches+based+on+an+ensemble+model+of+allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Design of protein switches based on an ensemble model of allostery.</a> Nat Commun. 6, 6968(2015).</li>
<li>Collinet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+accepted+insertions+of+proteins+within+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functionally accepted insertions of proteins within protein domains.</a> J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).</li>
<li>Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+bifunctional+protein+by+insertion+of+beta-lactamase+into+the+maltodextrin-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein.</a> Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).</li>
<li>Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+Bacillus+hybrid+enzyme+GluXyn-1%3A+native-like+jellyroll+fold+preserved+after+insertion+of+autonomous+globular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).</li>
<li>Ruth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+vaccination+for+the+priming+of+neutralizing+antibodies+against+non-immunogenic+STa+enterotoxin+from+enterotoxigenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).</li>
<li>Zervosen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+cattle+serum+antibody+responses+against+TEM+beta-lactamase+and+the+nonimmunogenic+Escherichia+coli+heat-stable+enterotoxin+%28STaI%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI).</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).</li>
<li>Chevigne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bifunctional+hybrid+beta-lactamases+for+epitope+mapping+and+immunoassay+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development.</a> J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).</li>
<li>Ke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+engineered+beta-lactamase+maltose+binding+protein+fusion+protein%3A+insights+into+heterotropic+allosteric+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation.</a> PloS One. 7, 39168(2012).</li>
<li>Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiometric+urea+biosensor+based+on+an+immobilised+fullerene-urease+bio-conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate.</a> Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).</li>
<li>D'Orazio, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009898103002419">Biosensors in clinical chemistry.</a> Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).</li>
<li>Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiometric+enzyme+immunoassay+using+miniaturized+anion-selective+electrodes+for+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection.</a> Analyst. 134, 1601-1607 (2009).</li>
<li>Ding, J., Wang, X., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+galvanostatic+control+of+a+polymeric+membrane+ion-selective+electrode+for+potentiometric+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymeric+liquid+membrane+electrode+responsive+to+3%2C3%27%2C5%2C5%27-tetramethylbenzidine+oxidation+for+sensitive+peroxidase%2Fperoxidase+mimetic-based+potentiometric+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing.</a> Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).</li>
<li>Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+Biosensors+-+Sensor+Principles+and+Architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures.</a> Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).</li>
<li>Bakker, E., Pretsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+potentiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoscale potentiometry.</a> Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).</li>
<li>Zhang, D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors+and+bioelectronics+on+smartphone+for+portable+biochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection.</a> Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).</li>
<li>Nemiroski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+mobile+electrochemical+detector+designed+for+use+in+resource-limited+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.gsma.com/connectedliving/wp-content/uploads/2013/06/Socio-economic_impact-of-mHealth_EU_14062013V2.pdf">Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union</a>. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hierbij presenteren we een methode om functionalize van een nanobody met behulp van de β-lactamase BlaP als een drager-eiwit en we laten zien dat we de daaruit resulterende eiwitten hybride met succes in een potentiometrische sensor assay implementeren kunt. De belangrijkste vernieuwing aspect van ons werk in vergelijking met andere biosensor testen is de covalente koppeling van het antilichaam deel naar de enzymatische activiteit het elektrische signaal genereert. Deze zogenaamde eiwit invoeging technology presenteert v...

Biosensoren zijn analytische apparaten die een bio-moleculaire interactie met fysische of chemische signalering apparaten die worden aangeduid als omvormers1combineren. De opgenomen signalen kunnen dan worden geïnterpreteerd en omgezet voor het controleren van de interacties tussen de geïmmobiliseerdet en gratis partners. Allermeest naar de biosensoren wordt gekenmerkt door het gebruik van een antilichaam te detecteren analyten zoals hormonen of andere ziekteverwekker markeringen2. Verschillende sensor indelingen kunnen worden gebruikt en massa-gebaseerde, magnetische, optische of elektrochemische biosensoren omvatten. De laatste behoren tot de meest gebruikte sensoren, en werkt door het omzetten van een bindende evenement in een elektrisch signaal. De voorstellingen en de gevoeligheden van alle antilichamen gebaseerde biosensoren zijn sterk afhankelijk van in wezen twee parameters: i) de kwaliteit van het antilichaam en ii) de eigenschappen van het systeem dat wordt gebruikt voor het genereren van het signaal-2.
Antilichamen zijn hoge-moleculaire massa dimeric eiwitten (150 – 160 kDa) dat uit twee zware kettingen en twee lichte kettingen bestaat. De interactie tussen de lichte en zware kettingen is meestal gestabiliseerd door hydrofobe interacties, alsmede een geconserveerde Zwavelbrug. Elke keten een variabele domein bevat dat met het antigeen in wezen via drie hypervariable regio's met de naam aanvullende bepaling van regio's (CDR1-2-3 samenwerkt). Ondanks de vele ontwikkelingen op het gebied, de grootschalige uitdrukking van full-length antilichamen met goedkope expressiesystemen (bijvoorbeeld E. coli) leidt vaak tot de productie van instabiele en geaggregeerde eiwitten. Dit is de reden waarom diverse fragmenten van antilichaam hebben ontworpen, zoals één-keten variabele fragmenten3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Zij bestaan uit de veranderlijke domeinen van respectievelijk één zware en een lichte kettingen die covalent gekoppeld zijn door een reeks synthetische aminozuur. Echter deze fragmenten vaak weer een slechte stabiliteit en hebben de neiging om statistische, aangezien zij een groot deel van hun hydrofobe regio's het oplosmiddel4blootstellen. In dit verband één keten kameelachtige antilichaam fragmenten, hierna nanobodies of VHHs, lijken te zijn uitstekende alternatieven voor ScFvs. Deze domeinen komen overeen met de variabele domeinen van kameelachtige single-keten antilichamen. In tegenstelling tot conventionele antilichamen, kameelachtige antilichamen zijn verstoken van lichte kettingen en alleen bevatten twee zware kettingen5. Daarom zijn nanobodies de kleinste monomeer antilichaam fragmenten (12 kDa) kunnen binden aan een antigeen met een vergelijkbaar met die van conventionele antilichamen6affiniteit. Bovendien, bieden ze verbeterde stabiliteit en oplosbaarheid in vergelijking met andere full-length antilichamen of fragmenten van antilichaam. Ten slotte, hun kleine maten en hun uitgebreide CDR3 loops laten herkennen cryptische epitopes en een binding met het enzym actieve sites7,8. Tegenwoordig, deze domeinen zijn veel aandacht krijgt en aan de biosensor technologie zijn gecombineerd. Bijvoorbeeld, Huang et al.. hebben ontwikkeld een nanobody gebaseerde biosensor voor de detectie en kwantificering van menselijke prostaat-specifiek antigen (PSA)9.
Zoals vermeld hierboven is een belangrijke parameter in biosensor testen de efficiëntie van het systeem gebruikt voor het genereren van het elektrische signaal. Om deze reden, enzym gebaseerde elektrochemische biosensoren steeds aandacht hebben getrokken en hebben grote schaal gebruikt voor diverse toepassingen zoals gezondheidszorg, voedselveiligheid en milieubewaking. Deze biosensoren vertrouwen op de katalytische hydrolyse van een substraat door een enzym voor het genereren van het elektrische signaal. In dit verband werden β-lactamases meer specifieke, gevoeliger en gemakkelijker te implementeren dan vele andere enzymen zoals alkalisch fosfatase of horseradish peroxidase10experimenteel aangetoond. Β-lactamases zijn enzymen die verantwoordelijk voor bacteriële resistentie tegen β-lactam antibiotica zijn door hydrolyseerd hen. Ze zijn monomeer, zeer stabiel, efficiënt, en van klein formaat. Domein/peptide invoegingen in β-lactamases genereren bovendien, bi-functionele chimeer eiwitten die te zien waren als efficiënte tools aan studie eiwit-ligand interacties. Inderdaad, recente studies hebben aangetoond dat het invoegen van variabele fragmenten van antilichaam in de TEM1 β-lactamase resultaten in een chimeer eiwit dat blijft kunnen binden met hoge affiniteit aan haar doel-antigeen. Interessant, bleek de antigeen-bindende ertoe allosteric verordening van11,12van de katalytische activiteit van de TEM1. Bovendien toonden we in verschillende studies dat eiwit domein inbrengen in een tolerante lus van de Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase functionele chimeer proteïnen toe die geschikt zijn produceert voor het controleren van de eiwit-ligand interacties13 ,14. We onlangs een nanobody, met de naam cAb-Lys3, in deze site tolerante invoeging van BlaP15ingevoegd. Deze nanobody werd getoond om te binden aan de kip-ei-wit lysozym (HEWL) en voor de remming van de enzymatische activiteit16. We toonden dat de gegenereerde hybride eiwit, genaamd BlaP-cAb-Lys3, een hoge specificiteit behouden / affiniteit tegen HEWL terwijl de β-lactamase activiteit bleef ongewijzigd. Dan zijn we met succes de hybride β-lactamase technologie om een elektrochemische biosensor gecombineerd en toonde aan dat de hoeveelheid gegenereerde elektrische signaal afhankelijk van de interactie tussen BlaP-cAb-Lys3 en HEWL op een elektrode geïmmobiliseerd was. Inderdaad, hydrolyse van β-lactam antibiotica door BlaP induceert een proton-release die kan worden omgezet in een kwantitatieve elektrisch signaal. Deze combinatie van de hybride β-lactamase technologie met een elektrochemische biosensor is snel, gevoelige, kwantitatieve en kunt real-time meting van het gegenereerde signaal. Deze methodologie wordt hierin beschreven.

<table><tbody><tr><td>Reagenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>V000225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>1551128</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris&ndash;HCl</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>alanine</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>HClO4</td><td>Fluka</td><td>34288</td><td>1M HClO4 oplossing, distributeur : Sigma-Aldricht</td></tr><tr><td>caseïne hydrolysaat</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>22090</td><td></td></tr><tr><td>benzylpenicilline natrium</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>B0900000</td><td></td></tr><tr><td>henneigeelwit lysozym</td><td>Roche</td><td>10837059001</td><td></td></tr><tr><td>heptaan</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>ammoniumhydroxide-oplossing</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>380539</td><td>28% NH3&nbsp;in H2O, gezuiverd door dubbele destillatie (geconcentreerd?)</td></tr><tr><td>Laboratoriumconsumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well plate&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657165</td><td>CELLSTAR 6-Well Plate</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>WTW</td><td>1AA110</td><td>Lab pH meter inoLab pH 7110</td></tr><tr><td>vacuüm- en filtratiesysteem</td><td>Nalgene</td><td>NALG300-4100</td><td>Filterhouders met ontvanger, distributeur : VWR</td></tr><tr><td>potentiometrische sensorchips</td><td></td><td></td><td>vervaardigd door Yunus en collega's (ref 16)</td></tr><tr><td>PGSTAT30 Autolab</td><td>Metrohm Autolab</td><td></td><td>uit productie, opvolger Autolab PGSTAT302N</td></tr><tr><td>digitaal multimeter, METRAHit 22M</td><td>Gossen Metrawatt</td><td></td><td>uit productie, opvolger Metrahit Base</td></tr></tbody></table>

het gebruik van een β-lactamase gebaseerde conductimetric biosensor assay voor het detecteren van biomoleculaire interacties

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensoren zijn steeds belangrijk en toegepast op verschillende gebieden zoals pathogen detectie, moleculaire diagnostiek, milieumonitoring en veiligheid controle op levensmiddelen. In dit verband, we gebruikten β-lactamases als efficiënte verslaggever enzymen in verschillende eiwit-eiwit interactie studies. Bovendien is hun vermogen om te aanvaarden sterk inlassingen uit peptiden of gestructureerde eiwitten/domeinen stimuleert het gebruik van deze enzymen te genereren chimeer eiwitten. In een recente studie, wij in de Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase een enkel domein antilichamen-fragment ingevoegd. Deze kleine domeinen, een afkorting voor nanobodies, worden gedefinieerd als de antigeen-bindende domeinen van één keten antilichamen van kameelachtigen. Als gemeenschappelijke dubbele keten antilichamen tonen ze hoog affiniteiten en specifieke kenmerken van hun doelstellingen. De daaruit resulterende chimeer eiwitten tentoongesteld een hoge affiniteit tegen haar doelstelling met behoud van de β-lactamase activiteit. Dit suggereert dat de nanobody en β-lactamase wordt blijven functioneren. In het huidige werk rapporteren we een gedetailleerd protocol dat β-lactamase onze hybridesysteem aan de biosensor technologie combineert. De specifieke binding van de nanobody aan zijn doel kan worden opgespoord dankzij een conductimetric meting van de protonen uitgebracht door de katalytische activiteit van het enzym.

Design en engineering van het chimeer eiwit BlaP-cAb-Lys3
Figuur 1 geeft het inbrengen van cAb-Lys3 in een tolerante lus van de BalP klasse A β-lactamase van Bacillus licheniformis. De invoegpositie werd uitgevoerd tussen residuen van Asp198 en Lys199. Een trombine breukzijde geïntroduceerd aan weerskanten van cAb-Lys3. Cellen getransformeerd met een constitutief expressie plasmide codering het chimeer BlaP-cAb-Lys3-eiwit ...

In dit werk rapporteren we een nieuwe methode om te studeren met behulp van een conductimetric biosensor gebaseerd op de technologie van de β-lactamase hybride eiwit-eiwitinteractie. Deze methode is gebaseerd op de release van protonen op hydrolyse van β-lactamen.

Het gebruik van een β-lactamase gebaseerde Conductimetric Biosensor Assay voor het detecteren van biomoleculaire interacties

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Het algemene doel van deze conductometrische biosensor-assay is het detecteren van biomoleculaire interacties met behulp van hybride bèta-lactamase-technologie. We beschrijven een methode om antilichaam-antigeeninteracties te detecteren met behulp van een chimeer bèta-lactamase-eiwit. Het principe van deze methode berust op het detecteren van binding door de protonenvrijgave van de bèta-lactamase-activiteit te meten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele immunosensoren is het gebruik van een chimerisch bèta-lactamase, wat goedkopere en snellere sensor-assays mogelijk maakt door een hybride eiwit te gebruiken voor de detectie van analyten. De procedure zal worden gedemonstreerd door Mathieu Dondelinger, een promovendus. Begin deze procedure met de voorbereiding van eiwitmonsters en oplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid de herbruikbare elektrode voor door de uiteinden gedurende twee minuten in de putjes van een 96-wells plaat te dopen, die elk 300 microliters elektrode-preparatieoplossing bevatten, met voorzichtig mengen bij kamertemperatuur.Herhaal deze stap drie keer. Spoel vervolgens de elektroden door de tips gedurende twee

the-use-lactamase-based-conductimetric-biosensor-assay-to-detect

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Source: Barber, A. E., et al. Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the detection of specific analytes using a bacterial biosensor. A bacterial culture carrying a plasmid with a red fluorescent protein (RFP) gene under an analyte-sensitive promoter is taken. After thoroughly wiping the test surface, a small section of the wipe is immersed in the culture and incubated. The analyte...

Detection of a Target Analyte Using a Bacterial Biosensor

This video demonstrates a conductimetric biosensor assay to study the interaction of an antibody with a target antigen immobilized on a transducer chip. The biosensor is engineered to have a bifunctional chimeric protein — a β-lactamase enzyme with a functional catalytic site fused to a nanobody for binding to the immobilized target antigen. Upon binding, the catalytic hydrolysis of an antibiotic substrate by the β-lactamase enzyme generates an electrical signal — confirming the...

&beta;-Lactamase-Based Conductimetric Biosensor Assay for Protein-Protein Interactions

Verworven resistentie tegen antibiotica is een grote openbare gezondheidszorg probleem en is momenteel gerangschikt door de WHO als een van de grootste bedreigingen voor het menselijk leven. Hier beschrijven we het gebruik van cantilever technologie antibacteriële resistentie, kritisch voor de ontdekking van nieuwe en krachtige middelen tegen multidrug-resistente bacteriën te kwantificeren.

Nanomechanica van Drug-target Interacties en Antibacteriële Resistance Detection

De protocollen beschrijven hier kinetische analyses van eiwit-eiwit interacties met Bio-layer interferometrie. F type ATP synthase, dat betrokken is bij de cellulaire energiemetabolisme, kan worden geremd door de ε subeenheid in bacteriën. We hebben Bio-layer interferometrie aangepast aan interacties van de katalytische complex studeren met remmende C-terminale domein ε's.

Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects

We beschrijven hier protocollen voor het meten van antilichaam-antigeen-bindende affiniteit en kinetiek met vier gebruikelijke biosensor platforms.

Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms

Een microfluidic biosensor platform is ontworpen en vervaardigd met behulp van goedkope droge film fotoresist technologie voor snelle en gevoelige kwantificering van verschillende analyten. Deze eenmalig gebruik-systeem zorgt voor de elektrochemische uitlezing van enzyme-linked tests aan-chip-geïmmobiliseerd door middel van de techniek van de stop-flow.

Droge Film elektrochemische Microfluidic Biosensor fotoresist gebaseerde Platform: Apparaat Fabrication, On-chip Assay voorbereiding en werking van het systeem

Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van lage overvloedige molecules in complexe oplossingen met behulp van moleculaire inprenting in combinatie met een capaciteit biosensor.

Ultrasensitive detectie van Biomarkers met behulp van een moleculaire Imprinting gebaseerd capacitieve Biosensor

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Dit artikel beschrijft een protocol voor het bestuderen van DNA-eiwitinteracties met behulp van een op streptavidine gebaseerd biolaaginterferometrie (BLI) systeem. Het schetst de essentiële stappen en overwegingen voor het gebruik van basis- of geavanceerde bindingskinetiek om de evenwichtsbindingsaffiniteit (KD) van de interactie te bepalen.

Analyse van DNA-eiwitinteracties met op streptavidine gebaseerde biolaaginterferometrie

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Ontdek een conductimetrische biosensor met hybride β-lactamasetechnologie voor het detecteren van antilichaam-antigeeninteracties. Deze methode meet protonafgifte en biedt een snellere, kosteneffectievere aanpak dan conventionele immunosensoren.

Het gebruik van een β-lactamase gebaseerde Conductimetric Biosensor Assay voor het detecteren van biomoleculaire interacties

Meer video's verkennen