Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

Het algemene doel van dit protocol is het identificeren van een lineair B-cel-epitoop dat wordt herkend door een monoklonaal antilichaam, met behulp van serieel getrunceerde recombinante eiwitten en peptide-scanning via dot-blot hybridisatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de moleculaire interactie tussen het antigeen en het antilichaam. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de eenvoud en de efficiëntie.

Het identificerende epitoop kan vervolgens worden gebruikt in uitgebreidere onderzoeken, zoals in therapeutische en diagnostische toepassingen. De procedure wordt gedemonstreerd door Chien-Wen Chen, postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium. Begin met het kweken van RGM56 muis monoklonale hybridoomcellen in een hybride serumvrij medium.

Houd celculturen aan in 175 T-flessen bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Verzamel na vijf dagen incubatie het kweekmedium zodra dit geel is verkleurd en centrifugeer het supernatant 30 minuten lang bij 4.500 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens het gepelletteerde celdebris om het antilichaam in oplossing te verkrijgen.

Voeg vervolgens twee milliliter van 50% protein G agro slurry toe aan een kolom van vijf milliliter en equilibriumeer de hars met 10 milliliter ijskoud PBS, wat gelijkstaat aan 10 volumes van de vooraf geladen hars. Breng 200 milliliter van de eerder bereide antilichaamoplossing aan op de geëquilibriumeerde kolom en gooi de fractie die door de kolom stroomt weg. Was de kolom twee keer met 10 milliliter ijskoud PBS.

Voeg tenslotte, om het antilichaam uit de hars te elueren, 10 milliliters van een millimolaire glycerine-oplossing bij pH 2.7 toe aan de kolom. Verzamel fracties van 900 microliter in microcentrifugebuisjes die vooraf zijn gevuld met 100 microliters van 10X neutralisatiebuffer. Bewaar het gezuiverde antilichaam in een 50%glycerol-oplossing aangevuld met natriumazide bij minus 20 degrees Celsius.

Bereid de constructen voor en transformeer E.coli BL21-cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Draag vervolgens een enkele kolonie over naar een buis van 15 milliliter met drie milliliter LB-bouillon, aangevuld met 100 micrograms per milliliter ampicilline, en sluit de dop van de buis losjes. Incubeer de cultuur bij 37 degrees Celsius met schudden op 150 RPM.

Houd de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nanometer bij. Wanneer deze ongeveer 0,6 bereikt, koel de cultuur dan af tot 25 graden Celsius. Voeg vervolgens IPTG toe tot een eindconcentratie van 0,4 millimolair om de expressie van het recombinante eiwit te induceren.

Incubeer de cultuur nog eens vier uur bij 25 °C met schudden op 200 RPM. Breng na incubatie één milliliter van de bacteriële cultuur over in een microcentrifugebuisje. Centrifugeer de cellen bij 12.000 ×g gedurende één minuut en verwijder het supernatant.

Resuspendeer de celpellet in 100 µL denaturatiebuffer door herhaaldelijk op en neer te pipetteren met een micropipet. Meng de resulterende suspensie door krachtig te vortexen om een gebruiksklaar recombinant eiwitmonster te verkrijgen. Om door te gaan met dot-blot hybridisatie, los elk synthetisch peptide op in DMSO om oplossingen van 10 mg/mL te verkrijgen.

Activeer vervolgens het PVDF-membraan gedurende twee minuten in methanol en equilibreer het gedurende nog eens twee minuten met gemodificeerde Towbin-buffer. Spoel een stuk chromatografisch papier met gemodificeerde Towbin-buffer en leg het geëquilibreerde PVDF-membraan hierop. Laat het membraan rusten totdat de buffer van het oppervlak is verdwenen.

Voeg met een tip van 10 µL twee µL van elk peptide- of recombinant eiwitmonster toe aan het membraan en laat dit 10 minuten aan de lucht drogen. Het aanbrengen van een monster op het membraan is de meest kritische stap in dit protocol. Het laden van een nauwkeurige hoeveelheid monster op een klein oppervlak van het PVDF-membraan vereist zorgvuldige aandacht.

Blok vervolgens het membraan in TBST-buffer aangevuld met 5% magere melk gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met zachte schudbewegingen. Verdun het monoklonale antilichaam RGM56 in TBST-buffer aangevuld met 5% magere melk. Voeg daarna de antilichaamoplossing toe aan het membraan.

Incubeer het membraan gedurende één uur bij 37 °C met voorzichtig schudden. Verwijder na incubatie de antilichaamoplossing. Was het membraan vervolgens twee keer gedurende vijf minuten met TBST-buffer onder voorzichtig schudden.

Voeg vervolgens de oplossing van het secundaire antilichaam, verdund in TBST-buffer met 5% vetvrije melk, toe aan het membraan. Incubeer het membraan gedurende één uur bij 37 °C onder zachte schudding. Verwijder na incubatie de antilichaamoplossing en was het membraan tweemaal gedurende vijf minuten met TBST-buffer onder zachte schudding.

Ontwikkel vervolgens het membraan met de substraatoplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Zodra het signaal verschijnt, wordt de reactie gestopt door het membraan te wassen met dubbel gedestilleerd water. Nadat het membraan aan de lucht is gedroogd, wordt het dot-blot-beeld vastgelegd met een imaging-systeem.

Meet tenslotte met behulp van software voor beeldanalyse de intensiteit van elke dot-blot. Hier wordt het volledige nervous necrosis virus code-eiwit gepresenteerd, bestaande uit aminozuren één tot en met 338, samen met de respectievelijk getrunceerde varianten. Om de expressie van de eiwitten in de getransformeerde bacteriële cellen te bevestigen, is een dot-blotanalyse met anti-6XHis-antilichamen uitgevoerd, waaruit de aanwezigheid van alle onderzochte eiwitten bleek.

Vervolgens werden de recombinante eiwitten geanalyseerd via dot-blot hybridisatie waarbij het monoclonale antilichaam RG-M56 werd gebruikt. De analyse toonde aan dat het door het antilichaam herkende eiwitepitoop zich bevindt in peptide 195 tot 338. Tot slot werd middels peptide-scanning een epitoop geïdentificeerd bestaande uit 20 of acht aminozuurresiduen.

Alanine-scanning toonde aan dat substituties van valineresten op posities 197 en 199, evenals een cystine op 201, het bindingsvermogen van het epitoop en de dot-blot hybridisatie ophieven. Op dezelfde wijze werd een verminderde bindingsaffiniteit waargenomen in de analyse van de bindingsintensiteit, wat bevestigt dat de geïdentificeerde resten essentieel zijn voor de binding van het epitoop aan het monoklonale antilichaam RGM56. Deze techniek voor peptide-identificatie kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van therapeutische peptide-geneesmiddelen of peptidemedicatie.