Name: Peptide Scanning-bijgestaan Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Leer hoe u een lineair B-cel-epitoop identificeert dat wordt herkend door een monoklonaal antilichaam met behulp van peptide-scanning en dot-blot-hybridisatie. Deze eenvoudige methode is geschikt voor therapeutische en diagnostische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Miss Ching-Chun Lin en Miss Diana Lin van de Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) van Academia Sinica voor het aanbieden van hun expertise op het gebied van peptide synthese en DNA-sequencing, respectievelijk. Dit onderzoek werd ondersteund door Academia Sinica.

1. Bereiding van monoklonaal antilichaam <ol><li> De cultuur van de RG-M56 muis monoklonale hybridoomcellen 2 in serum-vrij medium in 175T kolven bij 37 ° C met 5% CO 2 te vullen. Verzamel de bovenstaande vloeistof wanneer de kleur van het medium wordt geel na vijf dagen incuberen. OPMERKING: Hybridoma cellen werden gekweekt in serumvrij medium antilichaam verontreiniging uit foetaal runderserum voorkomen. </li><li> Centrifugeer de supernatant bij 4500 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en werp de celresten pellet. </li><li> Voeg 2 ml proteïne G agarose (geleverd als een 50% suspensie) aan een 5 ml kolom en equilibreren met 10 hars volumes (10 ml) ijskoude PBS. </li><li> Load 200 ml van het antilichaam supernatant (stap 1.2) op de kolom en gooi de doorwerking. </li><li> Voeg 10 ml ijskoude PBS om de kolom te wassen. Herhaal dit twee keer. </li><li> Voeg 10 ml 50 mM glycine, pH 2,7 aan de kolom om het eiwit G-geassocieerde antilichaam te elueren. collect 900 ul fracties in een microcentrifugebuis met 100 ui 10x neutralisatie buffer (1 M Tris, 1,5 M NaCl en 1 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Bewaar het gezuiverde antilichaam in 50% glycerol met 0,03% NaN3 bij -20 ° C. </li></ol> 2. Constructie en expressie van Serieel afgeknotte recombinante eiwitten <ol><li> Bereid een PCR reactiemengsel: 5 ui 10 x Pfu buffer, 0,2 mM van elk dNTP, 0,2 pM forward primer 3, 0,2 uM reverse primer 3, 2 mM MgSO4, 1 ng pET20b-1A59 3 plasmide-DNA, en 2,5 U ( eenheid) van Pfu DNA polymerase; voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 50 ul. <ol><li> Run monsters in een automatische thermische cycler met de volgende parameters: Cyclus 1 (94 ° C gedurende 5 min); cycli 2-36 (94 ° C gedurende 30 seconden, 63 ° C gedurende 30 seconden, en 72 ° C gedurende 60 s); en cyclus 37 (72 ° C gedurende 7 min). </li></ol></li><li> Extraheer de polymerasekettingreactie (PCR) producten met behulp van een PCR zuivering kit 5 voor de volgende restrictie-enzymdigestie vergemakkelijken. </li><li> Digest het PCR-geamplificeerde DNA-fragmenten met NdeI en XhoI-restrictie-enzymen en ligeren elk van deze DNA fragmenten in NdeI en XhoI-enzym geknipt pET-20b (+) vector. Transformeer de constructen in Escherichia coli DH-5α-competente cellen 6. <ol><li> Bereid het digestiemengsel in digestiebuffer (20 mM Tris-acetaat, 10 mM Mg (CH3COO) 2, 50 mM KCH 3 COO, en 1 mM DTT, pH 7,9) met 1 ug PCR-geamplificeerde DNA of pET-20b (+) vector DNA, en 2 U van NdeI en XhoI restrictie-enzymen in een uiteindelijk volume van 20 pl. </li><li> Meng de spijsvertering mengsel voorzichtig en snel spin down. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur in een droge bad om te zorgen voor de volledige snijden van de beperking zittenes. </li><li> Extraheer de restrictie-enzymen gedigereerde DNA-fragmenten onder toepassing van een PCR zuivering kit 5 onderstaande plasmideconstructie te vergemakkelijken. </li><li> Bereid het ligatiemengsel in ligatiebuffer (66 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP en 5 mM DTT, pH 7,5) met 100 ng voorverteerd, PCR-geamplificeerd DNA, 10 ng voorverteerd pET-20b (+) vector DNA en 5 U van T4 DNA ligase in een eindvolume van 10 pi. </li><li> Meng de ligatiemengsel voorzichtig en snel spin down. Incubeer bij 16 ° C gedurende 18 h in een waterbad. </li><li> Put 10 pi van het ligatiemengsel monsters in 100 ul van de DH-5α-competente cellen en meng voorzichtig alvorens de microcentrifugebuis op ijs gedurende 30 min. Zet de microcentrifugebuis in een droge bad bij 42 ° C gedurende 90 s aan heat shock 7 induceren. Onmiddellijk over de buis op ijs gedurende 2 minuten. </li><li> Voeg 900 ul van Luria-Bertani (LB) bouillon (1% Bacto trypton, 0,5% Bacto gist extractiet en 0,5% NaCl, pH 7,0) aan de buis. Incubeer bij 37 ° C met 150 rpm schudden gedurende 45 minuten. Pellet de cellen door centrifugeren bij 4000 x g gedurende 10 min en gooi het supernatant. </li><li> Resuspendeer de pellet met 50 pl LB-bouillon en uitgespreid elke transformatie op voorverwarmd LB platen met 100 ug / ml ampicilline. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 16 uur. </li><li> Ophalen van een enkele kolonie met een 200 ul tip en plaats deze in 3 ml LB-bouillon die 100 ug / ml ampicilline in een losjes afgedekte 15 ml buis. Incubeer bij 37 ° C met 150 rpm schudden gedurende 12 uur. </li><li> Extraheer het plasmide-DNA 8 van elke kweek en de sequentie met behulp van T7-promotor en T7-terminator primers met de sequentie 9 bevestigen. </li></ol></li><li> Na sequentiebevestiging, transformatie 10 ng DNA uit deze pET-20b (+) plasmiden met verschillende lengtes van YGNNV manteleiwitgen in de BL-21 (DE3) stam van E. coli door onsing de heat-shock-methode 7. Volg de stappen 2.3.6-2.3.8 om de transformatie uit te voeren. </li><li> Transfer een enkele kolonie van elke getransformeerde E. coli BL-21 cellen in 3 ml LB-bouillon die 100 ug / ml ampicilline in een losjes afgedekte 15 ml buis. Incubeer de cultuur bij 37 ° C met 150 rpm schudden. </li><li> Koel de cultuur 25 ° C wanneer de OD 600 van de kweek ongeveer 0,6 en voeg IPTG tot een uiteindelijke concentratie van 0,4 mM om de expressie van het recombinante eiwit te induceren. Incubeer de cultuur voor een extra 4 uur bij 25 ° C met 200 rpm schudden. </li><li> Breng 1 ml van de kweek in een microcentrifugebuis. Pellet de cellen door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 1 min en gooi het supernatant. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 100 pl denaturatie buffer (8 M ureum, 20 mM natriumfosfaat en 0,5 M NaCl, pH 7,4) door op en neer pipetteren met een micropipet. Meng door krachtig vortexen. LET OP: Het monster solutions moet nu halftransparant, een beetje plakkerig en klaar voor de dot-blot hybridisatie assay. </li></ol> 3. Design en Synthese van overlappende peptiden <ol><li> Ontwerp en synthetiseren 3 seriële 20-meer peptiden die elk overlappen met zijn opvolger met 10 aa resten uit de 195-338 aa regio van het YGNNV manteleiwit om een beperking van het epitoop regio RG-M56 mAb door dot blotting. </li><li> Ontwerp en synthetiseren 3 drie 8-mer peptiden (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204 en 199 VLCRWSVR 206) met een overlapping van 6 aa resten naar de volgende synthetische peptide om een beperking van het epitoop regio 195-206 aa door dot blotting. </li><li> Ontwerp en synthetiseren 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 en 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201 en 197 VSVLCR 202), en 5-meer peptiden (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201 en 198 SVLCR 202) met een overlapping van 6, 5 en 4 aa-residuen,, op naburige peptiden aan het minimaliseren epitoopregio door dot blotting. </li></ol> 4. Dot-blot hybridisatie <ol><li> Ontbinden elke gesynthetiseerde peptide in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml. OPMERKING: Om de gevarieerde oplosbaarheid van synthetische peptiden te overwinnen, moeten alle synthetische peptiden worden opgelost in DMSO. DMSO is een goed oplosmiddel voor hydrofobe of hydrofiele peptiden volledig oplossen. </li><li> Week de polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met methanol gedurende 2 minuten. OPMERKING: PVDF membraan tot 100% resistent DMSO; anderen kunnen niet zo zijn. </li><li> Equilibreren het PVDF membraan met gemodificeerd Towbin buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine en 0,1% SDS, pH 8,3) voor2 minuten. OPMERKING: 10-20% (v / v) methanol worden toegevoegd gemodificeerde Towbin buffer om de overdracht te verbeteren. </li><li> Spoel een stuk chromatografie papier met de gewijzigde Towbin buffer. Plaats de PVDF-membraan op de chromatografie papier. Wacht tot de gewijzigde Towbin buffer is verdwenen uit de PVDF membraanoppervlak voordat u doorgaat naar de volgende stap. </li><li> Voeg 2 ul van elk monster peptide aan het membraan met een 10 pi tip. Lucht-drogen PVDF membraan op de chromatografie papier voor 10 min. Voeg elk peptide monster langzaam en geleidelijk op het membraan te veel diffusie te voorkomen. </li><li> Blokkeer het membraan in TBST buffer (0,05% (v / v) Tween-20, 20 mM Tris en 150 mM NaCl, pH 7,4) met 5% magere melk gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zachtjes schudden. </li><li> Add RG-M56 mAb in een uiteindelijke verdunning van 1: 1000 in TBST buffer met 5% magere melk aan het membraan. Incubeer het membraan bij 37 ° C gedurende 1 uur onder zacht schudden. </li><li> Verwijder het antilichaam zodatlutie. Was het membraan in TBST buffer gedurende 5 minuten onder zacht schudden. Herhaal dit twee keer. </li><li> Voeg het tweede antilichaam (geit anti-muis IgG, Fc geconjugeerd alkalisch fosfatase) in een uiteindelijke verdunning van 1: 5000 in TBST buffer met 5% magere melk aan het membraan. Incubeer het membraan bij 37 ° C gedurende 1 uur onder zacht schudden. </li><li> Gooi de antilichaamoplossing. Was het membraan in TBST buffer gedurende 5 minuten onder zacht schudden. Herhaal de wasstap tweemaal. </li><li> Ontwikkeling van de membraan met BCIP / NBT substraatoplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten in het donker. Stop de ontwikkeling door het wassen van de membraan met DDH 2 O wanneer het signaal wordt weergegeven. </li><li> Air-droog het membraan en vast te leggen beeld de dot-blot met behulp van een afbeelding systeem. </li><li> Meet de intensiteit van elke dot blot met behulp van software voor beeldanalyse 3. </li></ol> 5. Alanine Scanning en Substitutie <ol><li> Ontwerpen en synthetiseren van 3 alanine en methionine substitutie peptiden. Vervang elk aa residu met alanine voor de 8-meer peptide 195 VNVSVLCR 202 en synthetiseren peptiden 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202, en 195 VNVSVLCA 202 . Vervang aa residu leucine 200 naar methionine aan de SJNNV genotype epitooppeptide VNVSVMCR 195 202 maken. </li><li> Volg Deel 4 uit te voeren alanine scanning en substitutie mutagenese dot blotting. </li></ol>

<ol><li>Milstein, C., Kohler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+variations+of+myelomatous+cells+%28proceedings%29%5BTitle%5D)+AND+%22Minerva+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal variations of myelomatous cells (proceedings).</a> Minerva Med. 68 (50), 3453(1977).</li>
<li>Lai, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2761.2001.00293.x/abstract">In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel).</a> J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).</li>
<li>Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Linear+B-Cell+Epitope+of+Betanodavirus+Coat+Protein+by+RG-M18+Neutralizing+mAB+Inhibits+Giant+Grouper+Nervous+Necrosis+Virus+%28GGNNV%29+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection.</a> PLoS One. 10 (5), 0126121(2015).</li>
<li>Lai, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2761.2001.00303.x/abstract">Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue.</a> J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).</li>
<li>Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+HLA+typing+designed+for+solid+organ+transplantation%3A+epityping+and+its+application+to+the+HLA-A+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunogenet%22%5BJournal%5D)">A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus.</a> Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).</li>
<li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre%2Flox+based+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnol. 11, 24(2011).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Miraprep%3A+A+Protocol+that+Uses+a+Miniprep+Kit+and+Provides+Maxiprep+Yields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields.</a> PLoS One. 11 (8), e0160509(2016).</li>
<li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+in+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies in DNA sequencing.</a> Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).</li>
<li>Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+ayu+%28Plecoglossus+altivelis%29+Pit-1+in+Escherichia+coli%3A+its+purification+and+immunohistochemical+detection+using+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody.</a> Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).</li>
<li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+structures+of+proteins.+Their+determination+has+revealed+important+aspects+of+immune+recognition+and+generated+strategies+for+synthetic+mimicking+of+protein+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites.</a> Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).</li>
<li>Opuni, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+epitope+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric epitope mapping.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li>
<li>Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. <a target="_blank" href="http://library.wur.nl/WebQuery/clc/1931063">The Aquaculture of Groupers</a>. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).</li>
<li>Conti-Tronconi, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-bungarotoxin+and+the+competing+antibody+WF6+interact+with+different+amino+acids+within+the+same+cholinergic+subsite%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite.</a> Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).</li>
<li>Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+specificity+of+antibody+recognition+of+carcinoma-associated+epithelial+mucins%3A+antibody+binding+to+synthetic+peptide+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes.</a> Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).</li>
<li>Chen, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+a+Piscine+Betanodavirus%3A+Mechanisms+of+Capsid+Assembly+and+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (10), e1005203(2015).</li>
<li>Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+entry+inhibitors+of+enveloped+viruses%3A+The+importance+of+interfacial+hydrophobicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity.</a> Biochim Biophys Acta. , (2014).</li>
<li>Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+putative+cellular+receptor+for+HIV-1+transmembrane+glycoprotein+using+synthetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides.</a> AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten met betrekking tot dit rapport.

Dit protocol biedt een snelle en eenvoudige techniek om een ​​lineaire mAb herkende epitoop te identificeren. Gezien de kosten van peptidesynthese en de productie-efficiëntie van het synthetiseren van peptiden de antigene gebied van het virus manteleiwit werd verminderd tot expressie serieel afgeknotte recombinante eiwitten voor peptide-scanning analyse. Als zodanig werd het betrouwbaar en doelmatig pET E. coli expressiesysteem gebruikt om deze serieel afgeknotte recombinante eiwitten, recombinante eiwitten met...

In het immuunsysteem, de recombinatie van V-, D- en J-segmenten zorgt voor antilichamen tegen enorme variaties van complementariteitsbepalende gebieden (CDR&#39;s) te creëren voor binding aan verschillende antigenen aan de host pathogene infectie te beschermen. De verdediging neutraliserende antilichamen tegen antigenen afhankelijk van de ruimtelijke complementariteit van de CDR&#39;s van de antilichamen en de epitopen van de antigenen. Daarom zal een begrip van deze moleculaire interactie profylactisch vaccin ontwerp en therapeutische ontwikkeling peptide helpen. Dit kan echter neutralisatie interactie beïnvloed door zowel meerdere antigene domeinen van één antigeen en door meerdere CDR&#39;s van antilichamen, die bijgevolg het epitoop behandelingsprocedure complexer. Gelukkig is de ontwikkeling van hybridoma technologie, die afzonderlijke antilichaamproducerende cellen ondersteunen gen met myelomacellen, zorgt voor een constant delende partij cellen secrete een specifiek antilichaam, bekend als een monoklonaal antilichaam (mAb) 1. Hybridoma cellen die zuivere hoge affiniteit mAbs binden aan een enkele antigene domein van een specifiek antigeen. De verhouding van het antigeen-antilichaam gevestigde verschillende manieren, waaronder peptide scannen, kan worden gebruikt om het epitoop van een antigeen via de bijbehorende mAb te bepalen. Recente ontwikkelingen in de synthetische peptide technologie hebben het peptide scantechniek toegankelijker en handiger te voeren gemaakt. Kort samengevat, een set van overlappende synthetische peptiden worden geproduceerd volgens een doelantigeen sequentie en worden gekoppeld aan een vaste drager membraan mAb hybridisatie. Peptide scanning biedt niet alleen een eenvoudige manier aan het antilichaam bindingsgebied kaart, maar vergemakkelijkt ook aminozuur (aa) mutagenese met scannen of residu substitutie de bindingsinteractie tussen elke aa residu van het epitoop peptide en de CDR&#39;s van het antilichaam te beoordelen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier de huidige studie beschrijft een protocol voor de efficiënte identificatie van het lineaire epitoop van de gele grouper nerveuze necrose (YGNNV) manteleiwit met een neutraliserende mAb 2, 3, 4. Het protocol omvat mAb preparaat, constructie en expressie van serieel afgeknotte recombinante eiwitten, synthetische peptiden overlappend ontwerp, dot-blot hybridisatie, alanine scanning en substitutie mutagenese. Gezien de hoge kosten van peptidesynthese, de stap van het serieel afkappen de recombinante eiwitten van een gewenst doeleiwit werd gewijzigd en het antigene gebied werd teruggebracht tot ongeveer 100 tot 200 aa resten voor het synthetische peptide matrix dot-blotanalyse werd uitgevoerd.

<table><tbody><tr><td>Hybrid-SFM medium</td><td>Gibco</td><td>12045-076</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Pfu DNA Polymerase&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EP0502&nbsp;</td><td>Inclusief buffers</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td>Inclusief buffers</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Inclusief buffers</td></tr><tr><td>XhoI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Inclusief buffers</td></tr><tr><td>pET-20b(+) vector</td><td>Novagen, Merck Millipore</td><td>69739</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH-5&alpha; competent cell</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH617</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL-21(DE3) competent cell</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH217</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB broth&nbsp;</td><td>Invitrongen</td><td>12780-052</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylthio-&beta;-D-thiogalactoside (IPTG)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td><td>J.T.Baker</td><td>X251-07</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Amresco</td><td>0167-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Affymetrix, USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002-500G</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL937001PK</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Agarose Fast Flow</td><td>Merck Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>UVP BioSpectrum 600 Image System</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler thermal cycler</td><td>BioRad</td><td>1709713</td><td></td></tr></tbody></table>

peptide scanning-bijgestaan ​​identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende lineair b-celepitoop

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

De identificatie van een antigeen epitoop door het immuunsysteem zorgt voor het begrijpen van het beschermingsmechanisme van neutraliserende antilichamen die de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen peptide kan vergemakkelijken. Peptide scannen is een eenvoudige en efficiënte methode die rechtlijnig brengt de lineaire epitoop herkend door een monoklonaal antilichaam (mAb). Hier de auteurs presenteren een epitoop bepaling methodiek waarbij serieel afgeknotte recombinante eiwitten, synthetisch peptide ontwerp en dot-blot hybridisatie voor de antigene herkenning van nerveuze necrose virus manteleiwit met behulp van een neutraliserende mAb. Deze techniek is gebaseerd op de dot-blot hybridisatie van synthetische peptiden en mAbs op een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan. De minimale antigeen gebied van een viraal manteleiwit herkend door de RG-M56 mAb kan teruggebracht worden stap voor stap bijgesneden peptide mapping op een 6-meer peptide epitoop. Bovendien, alanine scanning mutagenese en residuen substitutie kan worden uitgevoerd om de binding betekenis van elke aminozuurrest die het epitoop karakteriseren. De resten aan weerszijden van de epitoop website bleken cruciale rol in peptide conformatie regelgeving spelen. Het geïdentificeerde epitoop peptide kan worden gebruikt om kristallen van epitoop peptide-antilichaam complexen een röntgendiffractie onderzoek en functionele concurrentie, of therapeutische vormen.

Het doel van dit experiment was om een ​​epitoop te identificeren door middel van dot blotting met behulp van mAb. Snel en doeltreffend beperken het antigeen gebied herkend door mAb, met de volledige lengte en afgeknot serieel YGNNV recombinante manteleiwitten met 6xHis fusion label de C-terminus werden tot expressie gebracht vanaf een E. coli expressiesysteem PET 10 (Figuur 1A). De resulterende recombinante eiwitten werden gespot op het ...

Hier presenteren de auteurs een eenvoudig en efficiënt protocol om een lineair antigeen epitoop te definiëren met behulp van een gezuiverd monoklonaal antilichaam en peptide scanning door dot-blot hybridisatie. De geïdentificeerde epitoop kan vervolgens worden gebruikt in therapeutische en diagnostische toepassingen.

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Het algemene doel van dit protocol is het identificeren van een lineair B-cel-epitoop dat wordt herkend door een monoklonaal antilichaam, met behulp van serieel getrunceerde recombinante eiwitten en peptide-scanning via dot-blot hybridisatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de moleculaire interactie tussen het antigeen en het antilichaam. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de eenvoud en de efficiëntie.Het identificerende epitoop kan vervolgens worden gebruikt in uitgebreidere onderzoeken, zoals in therapeutische en diagnostische toepassingen. De procedure wordt gedemonstreerd door Chien-Wen Chen, postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium. Begin met het kweken van RGM56 muis monoklonale hybridoomcellen in een hybride serumvrij medium.Houd celculturen aan in 175 T-flessen bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Verzamel na vijf dagen incubatie het kweekmedium zodra dit geel is verkleurd en centrifugeer het supernatant 30 minuten lang bij 4.500 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens het gepelletteerde celdebris om het antilichaam in oplossing te verkrijgen.Voeg vervolgens twee milliliter van 50% protein G agro slurry toe aan een kolom van vijf milliliter en equilibriumeer de hars met 10 milliliter ijskoud PBS, wat gelijkstaat aan 10 volumes van de vooraf geladen hars. Breng 200 milliliter van de eerder bereide antilichaamoplossing aan op de geëquilibriumeerde kolom en gooi de fractie die door de kolom stroomt weg. Was de kolom twee keer met 10 milliliter ijskoud PBS.Voeg tenslotte, om het antilichaam uit de hars te elueren, 10 milliliters van een millimolaire glycerine-oplossing bij pH 2.7 toe aan de kolom. Verzamel fracties van 900 microliter in microcentrifugebuisjes die vooraf zijn gevuld met 100 microliters van 10X neutralisatiebuffer. Bewaar het gezuiverde antilichaam in een 50%glycerol-oplossing aangevuld met natriumazide bij minus 20 degrees Celsius.Bereid de constructen voor en transformeer E.coli BL21-cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Draag vervolgens een enkele kolonie over naar een buis van 15 milliliter met drie milliliter LB-bouillon, aangevuld met 100 micrograms per milliliter ampicilline, en sluit de dop van de buis losjes. Incubeer de cultuur bij 37 degrees Celsius met schudden op 150 RPM.Houd de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nanometer bij. Wanneer deze ongeveer 0,6 bereikt, koel de cultuur dan af tot 25 graden Celsius. Voeg vervolgens IPTG toe tot een eindconcentratie van 0,4 millimolair om de expressie van het recombinante eiwit te induceren.Incubeer de cultuur nog eens vier uur bij 25 °C met schudden op 200 RPM. Breng na incubatie één milliliter van de bacteriële cultuur over in een microcentrifugebuisje. Centrifugeer de cellen bij 12.000 ×g gedurende één minuut en verwijder het supernatant.Resuspendeer de celpellet in 100 µL denaturatiebuffer door herhaaldelijk op en neer te pipetteren met een micropipet. Meng de resulterende suspensie door krachtig te vortexen om een gebruiksklaar recombinant eiwitmonster te verkrijgen. Om door te gaan met dot-blot hybridisatie, los elk synthetisch peptide op in DMSO om oplossingen van 10 mg/mL te verkrijgen.Activeer vervolgens het PVDF-membraan gedurende twee minuten in methanol en equilibreer het gedurende nog eens twee minuten met gemodificeerde Towbin-buffer. Spoel een stuk chromatografisch papier met gemodificeerde Towbin-buffer en leg het geëquilibreerde PVDF-membraan hierop. Laat het membraan rusten totdat de buffer van het oppervlak is verdwenen.Voeg met een tip van 10 µL twee µL van elk peptide- of recombinant eiwitmonster toe aan het membraan en laat dit 10 minuten aan de lucht drogen. Het aanbrengen van een monster op het membraan is de meest kritische stap in dit protocol. Het laden van een nauwkeurige hoeveelheid monster op een klein oppervlak van het PVDF-membraan vereist zorgvuldige aandacht.Blok vervolgens het membraan in TBST-buffer aangevuld met 5% magere melk gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met zachte schudbewegingen. Verdun het monoklonale antilichaam RGM56 in TBST-buffer aangevuld met 5% magere melk. Voeg daarna de antilichaamoplossing toe aan het membraan.Incubeer het membraan gedurende één uur bij 37 °C met voorzichtig schudden. Verwijder na incubatie de antilichaamoplossing. Was het membraan vervolgens twee keer gedurende vijf minuten met TBST-buffer onder voorzichtig schudden.Voeg vervolgens de oplossing van het secundaire antilichaam, verdund in TBST-buffer met 5% vetvrije melk, toe aan het membraan. Incubeer het membraan gedurende één uur bij 37 °C onder zachte schudding. Verwijder na incubatie de antilichaamoplossing en was het membraan tweemaal gedurende vijf minuten met TBST-buffer onder zachte schudding.Ontwikkel vervolgens het membraan met de substraatoplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Zodra het signaal verschijnt, wordt de reactie gestopt door het membraan te wassen met dubbel gedestilleerd water. Nadat het membraan aan de lucht is gedroogd, wordt het dot-blot-beeld vastgelegd met een imaging-systeem.Meet tenslotte met behulp van software voor beeldanalyse de intensiteit van elke dot-blot. Hier wordt het volledige nervous necrosis virus code-eiwit gepresenteerd, bestaande uit aminozuren één tot en met 338, samen met de respectievelijk getrunceerde varianten. Om de expressie van de eiwitten in de getransformeerde bacteriële cellen te bevestigen, is een dot-blotanalyse met anti-6XHis-antilichamen uitgevoerd, waaruit de aanwezigheid van alle onderzochte eiwitten bleek.Vervolgens werden de recombinante eiwitten geanalyseerd via dot-blot hybridisatie waarbij het monoclonale antilichaam RG-M56 werd gebruikt. De analyse toonde aan dat het door het antilichaam herkende eiwitepitoop zich bevindt in peptide 195 tot 338. Tot slot werd middels peptide-scanning een epitoop geïdentificeerd bestaande uit 20 of acht aminozuurresiduen.Alanine-scanning toonde aan dat substituties van valineresten op posities 197 en 199, evenals een cystine op 201, het bindingsvermogen van het epitoop en de dot-blot hybridisatie ophieven. Op dezelfde wijze werd een verminderde bindingsaffiniteit waargenomen in de analyse van de bindingsintensiteit, wat bevestigt dat de geïdentificeerde resten essentieel zijn voor de binding van het epitoop aan het monoklonale antilichaam RGM56. Deze techniek voor peptide-identificatie kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van therapeutische peptide-geneesmiddelen of peptidemedicatie.

peptide-scanning-assisted-identification-monoclonal-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit protocol beschrijft het gebruik van peptide: MHC tetrameren en magnetische microbolletjes voor laagfrequente populaties van epitoop-specifieke T-cellen isoleren en analyseren door flowcytometrie. Deze methode maakt de directe bestudering van endogene T-celpopulaties plaats...

Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

This video demonstrates a technique that applies peptide microarray technology to profile the specificity of antibodies recognizing post-translational modifications (PTMs) on histone peptides. A microarray slide containing immobilized fluorophore-conjugated histone peptides with known PTM combinations is treated with target PTM-specific antibodies. This process helps identify the antibody's specificity for the target and its potential cross-reactivity with non-target PTMs.

A Peptide Microarray Technology for Specificity Profiling of Antibodies

Technieken om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de afscheiding van HIV-1 Nef in exosomes ontleden worden beschreven. Specifieke korte peptiden afgeleid van Nef en eiwit transfectie werden uitgebuit om de structuur, functie, en bindende partners van Nef's Secretion Wijziging Region bepalen. Deze procedures hebben algemene belang in veel mechanistische studies.

Peptide-gebaseerde identificatie van functionele Motieven en hun bindingspartners

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald naar 384-well platen beschreven. Deze kosteneffectieve formaat moet nuttig zijn in het gebied van eiwit deimmunization en vaccin ontwerp en ontwikkeling te bewijzen.

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van twee IgG-klasse monoklonale antilichamen (mAbs) die sterk reageren op myoglobine van cetacean. Deze mAbs worden toegepast op een colloïdaal goud immunochromatografische teststrip op basis van het sandwich-formaat om het Mb van cetacean te onderscheiden van zeehond en andere dieren.

Ontwikkeling van een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatographic teststrip voor detectie van walvisachtigen Myoglobin

Dit manuscript beschrijft methodes voor het toepassen van peptide microarray technologie op specificiteit profilering van antilichamen die histonen herkennen en hun post-translationele modificaties.

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Biopanning bacteriële display bibliotheken is een bewezen techniek voor ontdekking van peptide affiniteit reagentia, een robuust alternatief voor antilichamen. De semi-automatische sorteermethode hierin heeft gestroomlijnd biopanning als u wilt verkleinen van het optreden van valse positieven. We illustreren hier het denkproces en de technieken toegepast in de beoordeling van kandidaten en het minimaliseren van de downstream-analyse.

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Incongruenties in menselijke leukocyten antigeen (HLA) sequenties tussen organ donor en ontvanger paren zijn de belangrijkste oorzaak van antilichaam-gemedieerde afwijzing in orgaantransplantatie. Hier presenteren we het gebruik van aangepaste antigeen arrays die zijn gebaseerd op individuele donoren HLA sequenties sonde anti-donor HLA alloantibodies orgel geadresseerden.

Gepersonaliseerd Peptide Arrays voor detectie van HLA Alloantibodies in orgaantransplantatie

QA-1 (HLA-E in mens) behoort tot een groep van niet-klassieke grote histocompatibility complex 1b moleculen. Immunisatie met QA--1-bindende epitopes heeft aangetoond dat weefsel-specifieke immuunregulatie vergroten en verbeteren van verschillende auto-immuunziekten. Hierin beschrijven we een overlappende peptide bibliotheek strategie voor de identificatie van QA--1 epitopes in een eiwit.

Overlappende Peptide bibliotheek Qa-1 Epitopes in een proteïne in kaart

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

Leer hoe u een lineair B-cel-epitoop identificeert dat wordt herkend door een monoklonaal antilichaam met behulp van peptide-scanning en dot-blot-hybridisatie. Deze eenvoudige methode is geschikt voor therapeutische en diagnostische toepassingen.

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

Meer video's verkennen

Peptide Scanning-bijgestaan Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop