Met behulp van Enzyme-gebaseerde biosensoren te meten Tonic en Fasische glutamaat in de ziekte van Alzheimer muismodellen
3 mei 2017
Hier beschrijven we de setup, softwarenavigatie en gegevensanalyse voor een ruimte en tijd nauwkeurige werkwijze voor het meten tonische en fasische extracellulair glutamaat veranderingen in vivo middels enzymgekoppelde micro-elektrode arrays (MEA).
Het algemene doel van deze procedure is om tonische en fasische extracellulaire glutamaatveranderingen in vivo te meten met behulp van enzym-gekoppelde MicroElectrode Arrays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurowetenschappen, zoals of extracellulaire neurotransmitterniveaus en de snelle dynamica van neurotransmitterafgifte en opruiming worden veranderd in ziektetoestanden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de MicroElectrode Arrays specifieke neurotransmitterveranderingen in discrete hersengebieden kunnen meten, waardoor het een ruimtelijk en tijdelijk nauwkeurige aanpak is met een minimaal invasieve benadering.
Holly Hunsberger en Ryan Heslin uit mijn laboratorium zullen de procedure demonstreren. Om deze procedure te beginnen, bedek een paar opnameplaatsen op een MEA met het gewenste enzym en een ander paar opnameplaatsen met de inactieve eiwitmatrix. Trek vervolgens het glutamaatoxidase of eiwitmatrix op met een Hamilton-spuit van 10 microliter.
Druk voorzichtig op de zuiger om een kleine druppel oplossing bij de spuitspuit te spuiten. Om de opnameplaatsen van de MEA te targeten, breng onder een dissectiemicroscoop de oplossing aan op de juiste opnameplaatsen door kort contact te maken met de opnameplaatsen met de druppel oplossing, die één laag vertegenwoordigt. Stel een timer in op één minuut tussen het aanbrengen van de coating op de opnameplaatsen.
Plaats nu de referentie-elektrode door de opening in de plastic arm. Laat de referentie-elektrode zakken in een beker met PBS en zorg ervoor dat deze niet in contact komt met de bodem van de beker. Verbind vervolgens de referentie-elektrode met de hoofdfase en verbind de MEA met de mPD geplateerd op de hoofdfase.
Laat de MEA zakken in de oplossingsbeker zodanig dat alleen de MEA-tip in de oplossing is ondergedompeld. Dompel de MEA-tip niet onder in vloeistof voorbij de zwarte bel. Dit kan schade aan de MEA veroorzaken.
Selecteer vervolgens het elektroplatingpictogram op het bureaublad. Controleer in het elektroplatingtoolmenu of de juiste instellingen zijn ingevoerd. Selecteer vervolgens de software afsluiten om het elektroplateren af te ronden.
Spoel de mPD-geplateerde elektrodetips af met DI-water en bewaar ze 24 uur voordat u kalibreert. Schakel in deze procedure een verwarmingskussen in op 37 graden Celsius en sluit de hoofdfase aan op het opnamebesturingssysteem. Plaats vervolgens de MEA-tip in 40 milliliter geroerd 0,5 molair PBS.
Verbind vervolgens de referentie-elektrode met de hoofdfase. Knip met de referentie-elektrodetip om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen zijn. Open vervolgens het opnameprogramma, zorg ervoor dat de instellingen correct zijn, kies het MEA-nummer en klik op Kalibratie en druk op Start.
Laat vijf tot 10 minuten voor evenwicht en begin met kalibreren zodra de basislijn is gestabiliseerd. Selecteer vervolgens Baseline en voeg 500 microliter ascorbinezuur toe. Selecteer vervolgens Interferent zodra de stroom een nieuw stabiel plateau heeft bereikt.
Als de MEA goed geelektroplat is, mag er geen verandering worden waargenomen. Voeg vervolgens 40 microliter 20 millimolair L-glutamaat toe. Zodra de stroom een nieuw stabiel plateau heeft bereikt, markeer de eerste toevoeging als analyt.
Herhaal dit drie keer voor een totaal van drie glutamaattoevoegingen. Voeg vervolgens 40 microliter dopamine toe en selecteer Testsubstantie.
Voeg vervolgens 40 microliter peroxide toe. Selecteer Testsubstantie en klik op de stopknop zodra de kalibratie is voltooid. Plaats in deze stap de micropipet centraal tussen alle vier de platina-opnameplaatsen en monteer deze 50 tot 100 micrometer boven de MEA met behulp van plakband en modelleerklei.
Klem met behulp van een DC-adapter de rode positieve draad op de voorbereide zilverdraad aan de kant van de gouden pen en klemp de zwarte negatieve draad op de kathode van het platina-bad. Steek vervolgens de DC-adapter in en zoek naar het juiste plateringsproces. Er zouden bubbels moeten verschijnen bij het badelektrode en de referentie-elektrode zou een zilvergrijze kleur moeten krijgen.
Plaats in deze procedure het dier in het stereotactische apparaat en gebruik de oorbeugels om zijn hoofd te stabiliseren. Zorg ervoor dat het dier vastzit en dat het hoofd niet beweegt. Breng vervolgens oogzalf aan met behulp van een steriele wattenstaafje.
Scheer daarna het hoofd met een trimmer. Verwijder het haar nabij de oren met kleine chirurgische schaar. Breng vervolgens jodium en vervolgens alcohol driemaal afwisselend op de hoofdhuid aan.
Maak vervolgens een incisie in het midden van de hoofdhuid en spreid de huid uit. Zuig eventueel bloed op met een steriele wattenstaaf en breng waterstofperoxide aan om het verschijnen van bregma en lambda te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat het hoofd goed is gepositioneerd door de dorsaal-ventrale en mediaal-laterale richting van bregma en lambda te meten.
Stel de coördinaten bij bregma op nul en markeer de doelcoördinaten. Boor vervolgens rond de markering. Bevestig vervolgens de MEA aan de hoofdfase.
Vul de pijpje terug met de eerste gewenste oplossing. Zorg ervoor dat er een hiaat in het pijpje is zonder oplossing, zodat de uitgedreven oplossing kan worden onderzocht. Bevestig vervolgens de slang aan de glazen micropipet.
Zoek bregma met de aangehechte MEA en stel de coördinaten op nul. Verplaats de MEA naar de gewenste coördinaten en laat de MEA langzaam zakken tot de tip de hersenen raakt. Null de dorsaal-ventrale coördinaat en laat vervolgens de MEA langzaam in de hersenen zakken.
Plaats de referentie-elektrode op een afgelegen locatie van de MEA zodat deze nog steeds in vloeibare contact met de hersenen is om de kringloop te voltooien. Klik in het opnameprogramma op de gewenste gekalibreerde elektrode en klik vervolgens op experiment uitvoeren om met opnemen te beginnen. Nadat een stabiele basislijn is verkregen, stel de druk op 0,6 seconden en 0,5 psi en druk op de rode knop op de drukoplosser om te spuiten.
Noteer de tijd en druk evenals het volume van de bewogen ticks op het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het meten van tonische en fasische extracellulaire glutamaatveranderingen in vivo met behulp van enzymgekoppelde micro-elektrode-arrays (MEAs). De methode maakt ruimtelijk en temporeel precieze detectie van neurotransmitterdynamiek in specifieke hersengebieden mogelijk, met een focus op hippocampale verstoringen in een transgeen muismodel voor de ziekte van Alzheimer. De aanpak is minimaal invasief en maakt real-time monitoring mogelijk van glutamaatveranderingen die relevant zijn voor de pathologie van neurodegeneratieve ziekten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Neurochemie
- Elektrochemische detectie
Achtergrond
- Verstoringen van neurotransmitters zijn betrokken bij ziekten van het centrale zenuwstelsel, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, depressie en angst.
- Traditionele microdialyse is invasief en mist temporele en spatiale precisie.
- Micro-elektrodenarrays (MEA's) bieden een minimaal invasieve, real-time meting van neurotransmitterveranderingen in specifieke hersengebieden.
- Dysregulatie van glutamaat is geassocieerd met de pathologie van de ziekte van Alzheimer.
Doel van de studie
- Om de extracellulaire glutamaatdynamiek in de hippocampus van een transgeen muismodel voor de ziekte van Alzheimer te beoordelen.
- Om de effecten van een behandeling met riluzol op de glutamaatspiegels en de afgifte in specifieke subregio's van de hippocampus te evalueren.
- Om de voordelen van MEA-technologie voor in vivo meting van neurotransmitters aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Coaten van MEA-registratieplaatsen met een glutamaat-selectief enzym en een inactieve eiwitmatrix voor zelfreferentie.
- Elektroplating en kalibratie van MEA's met behulp van standaardoplossingen (ascorbinezuur, glutamaat, dopamine, peroxide).
- Stereotaxische chirurgie om hippocampus-subregio's (DG, CA1, CA3) te targeten in geanestheseerde rTg(TauP301L)4510 muizen.
- In vivo registratie van glutamaatniveaus en opgewekte afgifte na lokale applicatie van kaliumchloride.
Belangrijkste resultaten
- De tonische glutamaatspiegels waren significant verhoogd in de CA3- en CA1-regio's van vehicle-behandelde TauP301L-muizen.
- Behandeling met riluzol verminderde de verhoogde tonische glutamaatspiegels in deze regio's.
- De door kaliumchloride opgewekte glutamaatvrijgave was robuust verhoogd bij vehicle-behandelde TauP301L-muizen en werd verminderd door riluzol.
- Histologische analyse bevestigde de nauwkeurige plaatsing van de MEA in de doelsubregio's van de hippocampus.
Conclusies
- MEA-technologie maakt nauwkeurige, minimaal invasieve meting van neurotransmitterdynamiek in vivo mogelijk.
- Glutamaatdysregulatie in de hippocampus is evident in een muismodel voor de ziekte van Alzheimer en kan worden gemoduleerd door riluzol.
- Deze methode biedt waardevolle inzichten in neurotransmitterveranderingen die ten grondslag liggen aan de pathologie van neurodegeneratieve ziekten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Op enzymen gebaseerde micro-elektrodenarrays (MEA's) maken nauwkeurige, minimaal invasieve meting van tonische en fasische glutamaatdynamiek in discrete hersengebieden mogelijk, wat voldoet aan een kritieke behoefte aan ruimtelijke en temporele resolutie bij de ontdekking van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel. Deze mogelijkheid ondersteunt mechanische risicoreductie en targetvalidatie in modellen voor neurodegeneratieve ziekten, wat direct bijdraagt aan besluitvorming over portfolio's in een vroeg stadium. Deze benadering vergroot het voorspellend vertrouwen voor translationele neurowetenschappelijke programma's door real-time, kwantitatieve beoordeling mogelijk te maken van neurotransmitterveranderingen die relevant zijn voor de pathologie van de ziekte van Alzheimer.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar dysregulatie van neurotransmitters in ziekte-relevante hersencircuits mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door het kwantificeren van glutamaatdynamiek in vivo.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie voor therapeutische hypothesen binnen het CZS.
- Levert kwantitatieve gegevens ter ondersteuning van portfolio-triage en prioritering.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde, fysiologisch relevante systemen voor voor de evaluatie van verbindingen.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve read-outs van veranderingen in neurotransmitters.
- Ondersteunt de standaardisatie van assays en de vergelijkbaarheid tussen studies.
- Maakt screening van farmacologische modulatoren in real-time mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante eindpunten voor de translationele ontwikkeling van biomarkers.
- Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie in modellen voor neurodegeneratie.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van in vivo neurotransmittergegevens.
- Biedt mechanistisch inzicht in de effecten van geneesmiddelen op de circuitry van het centrale zenuwstelsel.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze op MEA gebaseerde methode integreert stappen van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, wat hypothesetoetsing, targetvalidatie en translationele biomarker-afstemming in de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het CZS mogelijk maakt.
- Discovery Biology: Kwantificeert de dynamiek van neurotransmitters om ziektemechanismen te verduidelijken en targets te valideren.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de beoordeling van verbindingen in fysiologisch relevante systemen.
- Analytics: Genereert real-time, statistisch robuuste metingen voor het vergelijken van condities en ter ondersteuning van besluitvorming.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen de discovery- en preklinische fasen door in vivo read-outs af te stemmen op de pathologie van de ziekte.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor de meting van neurotransmitters in het centrale zenuwstelsel over meerdere programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van CNS-targets.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare in vivo meetworkflows.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het leveren van bruikbare neurochemische gegevens.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van CNS-assets mogelijk op basis van functionele readouts.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in neurochemie, stereotactische chirurgie en elektrochemische analyse.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie voor de fabricage, kalibratie en in vivo registratie van MEA's.
- Maakt strikte standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor de vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende hersengebieden of ziekte-modellen.
- De signaalkwaliteit is afhankelijk van een correcte aarding en naleving van de timing van het protocol.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Coating the MEA
1:40
Electroplating the Electrode
2:46
Preparing the Solutions Needed for Calibration
4:48
Assemble the Micropipette
5:46
General Animal Surgery for MEA Recordings
9:01
Results: Extracellular Tonic and Potassium Chloride-evoked Release of Glutamate in Hippocampus
10:18
Conclusion
