Name: Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Leer de fabricage van ECM-afgeleide schuimen en microdragers zonder chemische crosslinking voor weefsel-specifieke 3D-celkweek. Deze methode biedt stabiele substraten voor regeneratief geneeskundig onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada en de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) hebben financiering voor dit werk verstrekt. De auteurs willen Dr. Amin Rizkalla bedanken voor het gebruik van zijn electrospraying-systeem, de Nanofabrication Facility aan de Western University voor het gebruik van SEM-beeldvormingsapparatuur, de Mount Brydges Abattoir voor het leveren van varkensweefselmonsters, en Drs. Aaron Grant, Brian Evans en Robert Richards voor hun klinische samenwerkingen ter ondersteuning van dit onderzoek.

1. cellen ontdane Weefsel bewerken <ol><li> Decellularisatie en vriesdrogen <ol><li> Decellularize weefsel (s) plaats na een vastgesteld protocol. OPMERKING: Steigers in de huidige studie werden bereid volgens gepubliceerde protocollen voor humane cellen ontdoen DAT 28, varken DDT 8 en varkens DLV 32. In de handel verkrijgbare, onoplosbare collageen kan ook worden gebruikt om schuimen en microdragers, zoals collageen afkomstig van runderen pees, die met succes is gebruikt in een concentratiegebied van 10 fabriceren - 50 mg / ml. Andere onoplosbare collageen bronnen kunnen worden gebruikt, maar kan optimalisering vereisen om het concentratiegebied dat stabiele steiger zal opleveren identificeren. </li><li> Breng de gehydrateerde ontcelde weefsel of gezuiverd collageen in een 50 ml centrifugebuis met een pincet en voeg voldoende dubbel gedestilleerd water (DDH 2 O) aan het weefsel onder te dompelen, to een maximale totale volume van 35 ml. </li><li> Bevriezen van het monster gedurende de nacht bij -80 ° C, met de centrifugebuis horizontaal geplaatst tijdens het vriezen aan de oppervlakte voor sublimatie maximaliseren tijdens daaropvolgende lyofilisering. </li><li> Verwijder de dop van de centrifugebuis en breng het bevroren monster in een pot vriesdrogen. </li><li> Lyofiliseren het monster met een klinisch vriesdroger gedurende 48-72 uur of totdat ze volledig droog. LET OP: De droogtijd kan variëren voor verschillende lyophilizers en ontceld weefsels. </li><li> Fijn gehakt de gelyofiliseerde ECM in kleine stukjes (~ 1-2 mm3) met een scherpe chirurgische schaar. </li><li> Bewaar de gehakt ECM in een exsiccator tot klaar voor verdere verwerking. LET OP: Het wordt aanbevolen dat het gehakt ECM onmiddellijk worden gebruikt om vochtopname uit de omgeving te voorkomen. </li></ol></li><li> Cryomilling (optioneel voor schuim productie) <ol><li> Vul een 25 ml roestvrij stalen maalkamer van een laboratory kogelmolen systeem met gehakt gevriesdroogd ECM en voeg twee 10 mm roestvrijstalen maalkogels. </li><li> Sluiten en volledig ondergedompeld de geladen maalkamer in vloeibare stikstof gedurende 3 min. </li><li> Maal de bevroren monster gedurende 3 minuten bij 30 Hz (1800 rpm). </li><li> Herhaal stap 1.2.2 en 1.2.3 tot de ECM wordt gemalen tot een fijn poeder. OPMERKING: Het aantal keren dat deze stappen moeten worden herhaald kan variëren tussen ECM bronnen. Bijvoorbeeld, DAT vereist typisch 3 freescycli tot een fijn poeder te genereren. </li><li> Breng het poeder met behulp van een scoopula in een glazen flesje, lekvrij afsluiten en opslaan in een exsiccator. </li></ol></li><li> Suspensie bereiding ECM <ol><li> Weeg 250 mg of gehakt (voor schuimen) of cryomilled (voor schuimen of microdragers) ECM en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis. Zie stap 1.1.6 en 1.2 voor de bereiding van gehakt ECM en cryomilled ECM resp. Opmerking: Dit protocol is ontworpen om een ​​50 mg / ml te bereiden ECM suspenSion, die wordt aanbevolen voor de menselijke DAT, varkens DDT, en varkens DLV. Afhankelijk van de specifieke ECM bron kan uniform suspensies bij hogere of lagere uitgangsconcentraties gegenereerd. </li><li> Voeg 5 ml 0,22 M NaH 2PO 4 (pH 5,4) buffer om de centrifugebuis en markeer het vloeistofniveau op de buis. </li><li> Bereid een α-amylase voorraadoplossing door het toevoegen van 7,5 mg α-amylase 1 mL 0,22 M NaH 2PO 4 (pH 5,4) buffer. Voeg 100 ul van de α-amylase voorraadoplossing (0,75 mg α-amylase, 0,3% w / w droge tissue) verdund. Voeg 0,22 M NaH 2PO 4 tot een eindvolume van 10 ml te verkrijgen. </li><li> Schud de suspensie continu bij 300 rpm gedurende 72 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Centrifugeer de suspensie bij 1500 xg gedurende 10 min. Verzamel zorgvuldig Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de verteerde ECM pellet. Resuspendeer de gepelleteerde materiaal in 10 ml 5% NaCl verdund in DDH 2 O. </li><li> Herhaal stap 1.3.5 voor een totaal van twee spoelingen met 5% NaCl in DDH 2 O. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet materiaal 10 ml DDH 2 O. </li><li> Schud de suspensie continu bij 300 rpm gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer de suspensie bij 1500 xg gedurende 10 min. Verzamel zorgvuldig Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de verteerde ECM pellet. </li><li> Voeg 0,2 M azijnzuur om de 5 mL merk in stap 1.3.2. </li><li> Schud de suspensie continu bij 120 rpm O / N bij 37 ° C. </li><li> Homogeniseer de ECM suspensie bij kamertemperatuur in tien seconde behulp van een draagbare homogenisator voorzien van een zaagtand 10 mm breed probe totdat er geen zichtbare fragmenten overblijven. Plaats de suspensie in een beker met koud water tussen de homogenisatie intervallen om oververhitting te voorkomen. Opmerking: Afhankelijk van de ECM bron kan verdere verdunning in 0,2 M azijnzuur nodig om een ​​homogene suspensie te verkrijgen. Excessive koelen van de ECM suspensie kan leiden tot een verhoging van de viscositeit die kunnen interfereren met een efficiënte homogenisatie. Indien een verhoging van de viscositeit wordt opgemerkt, kan het monster worden opgewarmd tot 37 ° C en verder verwerkt. </li><li> Bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal één maand vóór schuim of microdrager fabricage. </li></ol></li></ol> 2. ECM-afgeleide Foam Fabrication <ol><li> Incubeer de ECM suspensie uit stap 1.3.13 (gehakt of cryomilled) bij 37 ° C onder continu schudden bij 120 rpm tot de suspensie warm. </li><li> Verdun de ECM suspensie in 0,2 M azijn- zuur tot de gewenste concentratie. Opmerking: Afhankelijk van de ECM bron stabiele schuimen kunnen worden bereid in het traject van 10-100 mg / ml, met 15-50 mg / ml als aanbevolen bereik voor DAT, DDT en DLV. Typisch zal schuimen vervaardigd bij hogere concentraties iets minder poreus maar stabieler in kweek en gemakkelijker te hanteren. </li><li> Gebruik een 3 mL spuit with een 18 G naald bellenvorming in de ECM suspensie te voorkomen, vul de gewenste vorm met de ECM suspensie. De DAT, DDT en DLV schuimen te vervaardigen, afzien 400 pi van 35 mg / mL ECM suspensie in een 48-well celcultuur behandeld plaat. OPMERKING: De vorm van de geselecteerde vorm en het volume van ECM suspensie zal de geometrie van het verkregen schuim te bepalen. </li><li> Dek af en bevriezen van de mallen &#39;s nachts door ze in een -20 ° C of -80 ° C vriezer. OPMERKING: De vriestemperatuur kan de porositeit van het schuim beïnvloeden. Grotere poriën worden verwacht wanneer de monsters worden bevroren bij -20 ° C in vergelijking tot -80 ° C door de vorming van grote ijskristallen 33. Schuimen met een uniforme poreuze structuur te vervaardigen, waarborgen dat de matrijs niet in contact met een geleidend oppervlak gerichte koeling voorkomen. </li><li> Plaats de vormen met de bevroren monsters in een vriesdroger kolf. Verbind de vriesdroger kolf met het Laboratory vriesdroger systeem en droog gedurende 24 uur. LET OP: Het is belangrijk dat het monster bevroren voorafgaand aan vriesdrogen blijft. </li><li> Bewaar de gevriesdroogde schuimen in een exsiccator totdat ze nodig waren. </li></ol> 3. ECM-afgeleide microdrager Fabrication via Electrospraying LET OP: Een overzicht van de set-up electrospraying is weergegeven in figuur 2. <ol><li> Incubeer de cryomilled ECM suspensie van stap 1.3.13 bij 37 ° C onder continu roeren bij 100 rpm O / N. OPMERKING: Cryomilled ECM wordt gebruikt om de ECM afgeleide microdragers fabriceren grotere uniformiteit in de suspensie te verzekeren en verstoppingen te voorkomen tijdens electro. </li><li> Last 3 ml ECM suspensie in 3 mL Luer lock spuit en voeg een gevleugelde infusieset op de boring van de spuit. Opmerking: Een reeks naalden maten kunnen worden gebruikt, erkennen dat de keuze van de afmeting en vorm van het verkregen microdragers kunnen beïnvloeden. om fabricate de DAT, DDT en DLV microdragers, gebruikt een 25 G naald. </li><li> Bevestig de injectiespuit binnen de injectiespuitpomp. Bevestig de naald een retort stand en plaats de naaldpunt verticaal op een afstand van 4-6 cm vanaf de top van een lage-vorm dewarvat (250-500 mL groottebereik aanbevolen). </li><li> Bevestig een krokodilklem elektrode aan de punt van de naald en sluit deze aan op de pluspool van de hoge spanningsvoeding. </li><li> Vouw een strook aluminiumfolie (12 x 5 cm) over de rand van het vacuüm kolf. </li><li> Bevestig een tweede poolklem elektrode naar de buitenrand van de folie en sluit deze op de grond bronaansluiting van de voeding. </li><li> Vul het dewarvat met vloeibare stikstof tot ongeveer 1 cm van de bovenkant, waardoor ¾ van de folie wordt ondergedompeld. Opmerking: Het is belangrijk om het dewarvat gevuld met vloeibare stikstof bewaren. Het oppervlak van de vloeibare stikstof mag niet minder zijn dan 2 cm van de bovenkant van de kolf tijdens het proces electrosprayings. Continu bijvullen van de vloeibare stikstof nodig is om een ​​constant niveau tijdens electro handhaven. </li><li> Stel de injectiespuitpomp met een infusiesnelheid van 30 ml / h. Opmerking: Het variëren van de infusiesnelheid kan de microdrager vorm en diameter te veranderen, maar het aanbevolen bereik 25-35 mL / uur. Hoewel het sterk afhankelijk van de viscositeit van de suspensie kan stroomsnelheden dan 25 ml / h leiden tot de vorming van grotere microdragers. Bij zeer lage stroomsnelheden, kan de afmeting en vorm van de microdragers minder homogeen geworden. Op infusiesnelheden boven 35 ml / uur, kan de uniformiteit van de druppels opgebracht via electrospraying verstoord, wat resulteert in niet-sferische microdragers met een ruimere grootteverdeling 34. </li><li> Een spanning van 20 kV en zet de injectiespuitpomp om electrospraying initiëren. Opmerking: De spanning kan worden gevarieerd om aanpassing van het formaat van de microdragers en heeft de neiging een grotere invloed op de diameter dan de Infusio hebbenn rate. De aanbevolen spanning bereik is 15-25 kV. Een afname in diameter microdrager wordt verwacht met een spanningsverhoging 35. </li><li> Zodra het infuus voltooid is, giet overtollige vloeibare stikstof uit het Dewar, waardoor de microdragers gesuspendeerd in -25 ml vloeibare stikstof te zorgen dat ze bevroren blijven. </li><li> Geeft de microdragers met vloeibare stikstof in een 50 ml centrifugebuis overdracht door uitgieten in een vloeiende beweging. Vang bevroren microdragers die in het Dewar met scoopula en toevoegen aan de centrifugebuis. Opmerking: Afhankelijk van de grootte van de Dewar, kunnen de microdragers in vloeibare stikstof eerst in een middelgrote vat gegoten en vervolgens onmiddellijk overgebracht in 50 ml centrifugebuis. </li><li> Bedek de centrifugebuis die de microdragers in vloeibare stikstof met aluminiumfolie geperforeerd met kleine gaatjes als voorbereiding op vriesdrogen. </li><li> Plaats de overdekte centrifugebuizen in een vriesdroger kolf. Onmiddellijk sluit de kolf met de vriesdroger en de monsters O / N drogen. Opmerking: Het is zeer belangrijk om de microdragers gesuspendeerd in vloeibare stikstof zodat ze niet ontdooien voor deze stap bewaren als ontdooien kan leiden tot collaps en / of aggregatie. DAT, DDT en DLV microdragers vervaardigd in een concentratie van 35 mg / ml met behulp van de hierboven beschreven electrospraying omstandigheden zullen gewoonlijk een gehydrateerde diameter die varieert tussen 350-500 urn in grootte. De grootteverdeling kan variëren afhankelijk van de ECM bron. </li><li> Bewaar de gevriesdroogde microdragers in een exsiccator totdat ze nodig waren. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig2.jpg" /> Figuur 2. Overzicht van de Electrospraying voorzieningen die bij microdrager Fabrication. A: Het beeld dat de opstelling van de belangrijkste electrospraying apparatuur, waaronder de injectiepompen hoogspanningsvoeding, alsmede de positionering van de naald ten opzichte van de Dewar vloeibare stikstof. B: electro schema, waaronder de aanbevolen bereik voor spanning, infusiesnelheid en afstand. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> 4. Voorbereiden van schuim en Microcarriers voor Cell Culture <ol><li> rehydratatie <ol><li> Breng het gelyofiliseerde schuim met een tang in een 50 ml centrifugebuis die overmaat absolute ethanol (~ 99,9%) (~ 5: 1 verhouding van ethanol tot schuimen). Evenzo resuspendeer de gevriesdroogde microdragers boven absolute ethanol in de oorspronkelijke centrifugebuis voor inzameling. Met behulp van een serologische pipet, filtreer de microdragers door een roestvrijstalen zeef met een bepaalde maasgrootte in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml om eventuele aggregaten te verwijderen en het selecteren op gewenste afmetingen vallen. OPMERKING: Als de schuimen worden vervaardigd binnen TCPS platen, kunnen ze direct worden gerehydrateerd binnen deze vaten. </li><li> Incubeer bij 4 ° C gedurende 4 uur of totdat het schuimen of microdragers zwaartekracht geregeld op de bodem van de centrifugebuis. Voer alle volgende stappen in een laminaire stroming kap met steriele reagentia en geschikte aseptische techniek. </li><li> Verwijder het absolute ethanol met behulp van een serologische pipet en voeg overmaat (5: 1 verhouding) 95% ethanol verdund met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de steigers. Incubeer bij 4 ° C gedurende 4 uur of totdat de ECM-afgeleide steigers onderaan de rehydratatie gezonken vaartuig. </li><li> Langzaam rehydrateren de schavotten door een ethanolreeks (90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 en 0%, verdund met steriel PBS). Bij elke stap incuberen bij 4 ° C totdat de steigers alvorens de oplossing naar de bodem van het vat gezonken. Ontgas de steigers onder licht vacuüm of bellenvorming in de steigers is observed. </li><li> Vervang de steriele PBS gedurende nog tweemaal spoelen om achtergebleven ethanol te verwijderen. </li><li> Winkel in 100% steriele PBS bij 4 ° C tot gereed voor celkweek. Gebruik de steigers binnen 1-2 weken na rehydratie. </li></ol></li><li> Voorbereiding Cell Seeding <ol><li> Op de dag voor enten dragen de schuimen met behulp van pincet in celkweek goed behandeld platen of Transwell-inserts en voeg voldoende celkweekmedium (geselecteerd op basis van het celtype) aan de steigers (bijvoorbeeld 2,5 mL / steiger volledig ondergedompeld een 12-wells plaat). Evenzo kan de microdragers zwaartekracht bezinken in de centrifugebuis, verwijder de PBS met behulp van een serologische pipet zonder microdragers storen en voeg celkweekmedium een ​​5 bereiken: 1 verhouding van middel aan de microdragers. OPMERKING: Bij zaaien menselijke ASC, gebruik Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM): Ham&#39;s F12 aangevuld met voedingsmengsel10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine. </li><li> Vervang de celkweek medium voor een totaal van een spoeling. </li><li> Equilibreer de steigers overnacht in celkweek medium bij 37 ° C. De steigers zal klaar zijn voor de cel enten van de volgende dag. Opmerking: Het schuimen kan statisch worden gezaaid in celkweek of weefselkweek inserts putjesplaten 29, of dynamisch geënt met een klinisch schudder 36. Afhankelijk van de ECM bron verwerkingsmethoden en suspensieconcentratie kan dynamisch zaaien initiële celhechting, proliferatie en infiltratie te vergroten. De microdragers kunnen dynamisch worden geënt met behulp van een spinner kweek systeem 11. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In het algemeen kan bioscaffolds afgeleid van cellen ontdane weefsels dichter te benaderen de complexe 3D samenstelling en structuur van de ECM in de natieve cellulaire micro-omgeving in vergelijking met synthetische steigers of standaard cultuur-modellen op basis van 2D-TCPS. Zoals eerder besproken, cel-ECM interacties cruciaal belang bij het mediëren cellulaire gedrag zowel in kweek en in het lichaam 1. Erkennen dat de biochemische, biofysische en biomechanische eigenschappen van het ECM zijn uniek voor elk weefsel, is er steeds meer bewijs voor de ratio van toepassing weefselspecifieke benaderingen bij het ontwerpen van biomaterialen voor weefselregeneratie, en bij de ontwikkeling van meer steunen fysiologisch relevante cultuur modellen voor in vitro experimenten 20. Met gebruikmaking van cellen ontdane weefsels als uitgangsmateriaal, kunnen onze werkwijze de complexe samenstelling van de weefsel-specifieke ECM integreren in more customizable steiger formaten. Terwijl de mechanische en enzymatische verwerkingsstappen leidt tot een verlies van de natieve ECM ultrastructuur, hebben eerdere studies DAT aangetoond dat de instructieve effecten van de adipeus afgeleide ECM zijn geconserveerd in deze scaffold formaten, wat suggereert dat de bioscaffold samenstelling een sleutelmediator van celfunctie 11, 29. Een belangrijk voordeel van het gebruik van de ECM-afgeleide schuimen en microdragers celcultuur substraten in vergelijking met het intacte cellen ontdane weefsel is dat ze homogener, die uniformiteit in celverdeling en cel-cel / cel-ECM interacties kunnen verbeteren. De hier beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt om een ​​breed scala van weefselspecifieke bioscaffolds voor gebruik in celkweek en tissue engineering toepassingen genereren. Bijvoorbeeld, in aanvulling op de DAT, DDT, en DLV, ons lab heeft met succes deze technieken toegepast op 3D por genererenous schuimen met behulp van cellen ontdane bot, kraakbeen, nucleus pulposus en annulus fibrosis, alsook commercieel verkrijgbare, oplosbare collageen dat van runderpeescollageen. Van een in vitro perspectief zouden deze bioscaffolds worden gebruikt als basis voor hogere-fidelity 3D cultuurmodellen voor het onderzoek celbiologie, fysiologie en pathologie 38, zoals biologisch actieve substraten in high-throughput drug discovery platforms 39, of instructief matrices stam celdifferentiatie 40, 41. DAT, DDT en DLV schuimen vervaardigd bij concentraties van 25-50 mg / ml zijn stabiel bij langdurige in vitro kweek (getest tot 28 dagen). Verder kunnen alle drie soorten microdragers celhechting en proliferatie onder dynamische omstandigheden ondersteunen een lage afschuifkrachten spinner kweeksysteem (10-15 rpm) gedurende ten minste 2 weken. Voor in vivo toepassingen, de biocompatibele en biodegradable-ECM afgeleide schuimen en microdragers houdt belofte als kant-en-klare producten constructieve weefsel remodellering en regeneratie 11, 29 stimuleren. Verder zou de cel met lijm steigers worden gebruikt als celtherapie afgiftesystemen 42, 43. Als voorbeeld werden DAT schuimen aangetoond angiogenese en adipogenese te bevorderen na enting met allogene ASC en subcutaan geïmplanteerd in een immunocompetente ratmodel 29. Ten opzichte van het intacte DAT, hoe sterk bewerkte DAT schuimen gedegradeerd veel sneller, met een vermindering van 50% van het volume waargenomen bij 3 weken en zij werden geïntegreerd met de gastheer weefsels en bijna volledige resorptie van 12 weken. De schuimen hebben ook geleid tot een krachtiger angiogene respons, wat suggereert dat het enzym gedigereerde ECM hadden unieke pro-regeneratieve effecten. Zo zou ook de ECM-afgeleide microdragers worden gebruikt als in vitro &lt;/ em&gt; celkweek substraten binnen dynamische kweeksystemen en injecteerbare celafgifte voertuigen 11, 30, 44. Meer in het bijzonder kan de kleine diameter en de grote oppervlakte van de microdragers de afgifte van een grote hoeveelheid cellen in een klein volume mogelijk, terwijl een matrix die kunnen helpen om cellevensvatbaarheid te ondersteunen en celretentie op de injectieplaats 30. Voor gebruik in een levend systeem, is het essentieel om te waarborgen dat de bron ECM is nagenoeg geen antigene celbestanddelen en / of potentieel cytotoxische cellen ontdoen reagentia die een negatieve gastheerrespons 7 zou kunnen leiden. Het proteolytische enzym pepsine is vaak gebruikt bij het bereiden van ECM-afgeleide hydrogels 15. Pepsine is een niet-specifieke protease die verteren collageen en andere ECM eiwitten into kleine fragmenten 45. Terwijl hydrogels vervaardigd uit pepsine gedigereerde ECM is beschreven dat cel-instructieve veroorzaken, een beperking is dat deze materialen de neiging hebben zeer mechanisch zwak 46 zijn. Bij onze initiële ontwikkeling van de DAT microdragers, gebruikten we een samengestelde benadering waarbij pepsine gedigereerde DAT werd met alginaat en druppelsgewijs toegevoegd aan CaCl2 bolvormige korrels 30 te vormen. De bolletjes werden vervolgens foto-verknoopt alginaat en werd geëxtraheerd met behulp natriumcitraat. In aanvulling op de eis voor de chemische verknoping, een belangrijke beperking was dat de microdragers vervaardigd met deze aanpak had een slechte stabiliteit onder een orde van grootte van 900-950 urn 30. In plaats van pepsine, de hier gepresenteerde werkwijzen maken gebruik van een mildere digestie van de ECM met de glycolytische enzym α-amylase dat wordt gepostuleerd koolhydraatgroepen splitsen van de telopeptide gebieden van collageen, waardoor toenemende oplosbaarheid in azijnzuur 37. Deze benadering maakt de isolatie van sterk gepolymeriseerde collageen die kunnen worden gebruikt om zuiver ECM afgeleide schuimen en microdragers te maken zonder de noodzaak van chemische verknoping of andere toevoegsels. Deze bioscaffolds worden gestabiliseerd door fysieke interactie en waterstofbinding tussen de goed bewaarde collageenfibrillen, vergelijkbaar met het collageen in de natieve ECM micromilieu. De schuimen zijn een zeer flexibel platform dat kan worden vervaardigd in uiteenlopende geometrieën afhankelijk van de specifieke vorm gekozen. Voor celcultuur studies, kunnen de schuimen direct worden gegoten TCPS putsplaten, bekledingen of 3D draagstructuren van variërende dikte. 3D schuimen met zeer gelijkmatige oppervlakken te fabriceren, wordt aanbevolen dat een aangepaste vorm is uitgevoerd, dat kan worden afgedicht aan beide zijden met kunststof of glazen objectglaasjes. Hetzij gehakt of cryomilled ECM kunnen worden gebruikt voor het synthetiserende schuimen. In het algemeen is gebleken dat de cryomilled schuimen vaak macroscopisch zachter zijn en een verstoord ultrastructuur bij lagere concentraties 31, 36. Afhankelijk van de weefselbron, kunnen de aanvullende bewerkingsstappen mechanische veranderingen in de ECM samenstelling die invloed kunnen hebben celfunctie leiden. Bijvoorbeeld, in onze vorige werk, werd laminine gedetecteerd in gehakt DLV schuim, maar niet cryomilled DLV schuimt 31. Daarentegen collageen I, collageen IV, laminine en fibronectine werden gedetecteerd in zowel gehakt en cryomilled DAT schuimt 36. Naast de mechanische bewerkingsstappen kunnen de porositeit en de poriëngrootte van de schuimen worden afgestemd op zekere hoogte door het variëren van de ECM suspensieconcentratie en de vriestemperatuur 47. Doorgaans lagere concentratie schuimen (~ 10-15 mg / ml) zijn kwalitatief poreuzer maar kunnen snel samentrekken en slechtestabiliteit op lange termijn kweek 31, 36. Ook een lagere invriessnelheid, typisch bereikt door een hogere vriestemperatuur, kan leiden tot grotere poriën in het schuim vanwege de grootte van de ijskristallen gevormd tijdens vervaardiging 29. Al deze parameters beïnvloeden cel interacties met materialen, zoals hechting, infiltratie en hermodellering. Bijvoorbeeld kan celgroei op schuimen die worden vervaardigd met hogere concentraties ECM beperkt tot de oppervlaktegebieden, met name gehakte ECM bronnen en onder statische kweekomstandigheden 36. Voor de microdragers, de belangrijkste parameters die kunnen worden ingesteld zijn ECM suspensieconcentratie, gauge naald en aangelegde spanning, waarbij hogere concentraties typisch opbrengst microdragers die stabieler onder langdurige dynamische cultuur. Na de inleiding van electrospraying de ECM suspension druppeltjes moet snel vallen in het midden van de fles, in de richting van het aluminiumfolie collector. Om aggregatie te voorkomen, is het belangrijk dat de korrels contact vloeibare stikstof voorafgaande aan de folie. De afstand tussen de naald en het oppervlak van de vloeibare stikstof kan worden aangepast aan deze eisen te voldoen. Het is belangrijk op te merken dat optimalisatie kan vereist zijn afhankelijk van de eigenschappen van elk specifiek ECM bron, met name bij het kiezen concentratiebereik dat stabiele bioscaffolds zal genereren. Een andere belangrijke factor is het van cellen ontdoen protocol dat wordt gebruikt om de uitgangsmaterialen te genereren, zoals cellen ontdoen methoden die de ECM of de aanwezigheid van residuele reagentia (bijvoorbeeld surfactanten) kunnen een negatieve invloed hebben op de stabiliteit van de verkregen schuimen en microdragers degraderen. Als uitdagingen ondervonden met bioscaffold stabiliteit, opties die kunnen worden onderzocht zijn het gebruik van een meer geleidelijke rehydratie proces, het verhogen van de ECM suspension concentratie, en het verkennen van gehakt versus cryomilled ECM. Moeten al deze opties het probleem niet op te lossen, kan het nodig zijn om alternatieve decellularisatie protocollen of ECM bronnen te verkennen. Reproduceerbaarheid tijdens scaffold productie te waarborgen, dient voorzichtigheid geboden bij bepaalde stappen in het protocol. Cryomilling wanneer de cellen ontdane weefsels, verdient het aanbeveling het malen wordt uitgevoerd direct na vriesdrogen in een droge omgeving om de kans op deeltjesaggregatie verminderen als gevolg van de absorptie van vocht uit de omgeving. Microdrager tijdens fabricage, wordt voorgesteld dat de suspensie electrospray in kleine hoeveelheden, met een maximaal volume van 3 ml, om problemen met voorbeeld koeling die kan leiden tot verstopping van de naald te voorkomen. Verder is het essentieel dat de microdragers niet mogen ontdooien na electrospraying proces. Hun sferische geometrie en mechanische stabiliteit, het handhaven microcarriers ophalen bij de vloeibare stikstof, in een vloeibare-stikstof gevulde container vervoerd, en onmiddellijk gevriesdroogd. Tot slot, voor zowel de schuim en microdragers, is het essentieel dat de rehydratie stappen langzaam worden uitgevoerd over een periode van meerdere dagen. Snelle rehydratatie kan leiden tot instorting van de macro- en / of microschaal. Verder moet rehydratie langzaam opkomen bij de vorming van luchtbelletjes in de stellage, die een aanzienlijke hoeveelheid tijd te ontgassen kan eisen onder licht vacuüm te voorkomen. Concluderend kunnen de in dit document werkwijzen worden gebruikt om een ​​divers scala aan weefselspecifieke schuimen en microdragers uit Zuivere, niet-chemisch verknoopt ECM fabriceren. Een voordeel voor biologische onderzoekers dat de bioscaffolds gemakkelijk te hanteren en kunnen op soortgelijke wijze worden verwerkt tot weefsels bij het uitvoeren van analyses met technieken zoals histologie, immunohistochemie, of gen en eiwitexpressie assays.Bovendien kan de ECM-afgeleide steigers enzymatisch afgebroken tot geënte celpopulaties extraheren of kan direct worden gebruikt als biologisch afbreekbare en biologisch verenigbare cellen bestelwagens. Kortom, dit flexibele platform technologie houdt groot nut voor tal van toepassingen, waaronder voor 3D-celcultuur studies die celfunctie, zoals celexpansie substraten en als pro-regeneratieve bioscaffolds.

De extracellulaire matrix (ECM) bestaat uit een complexe 3D netwerk van eiwitten, glycoproteïnen en polysacchariden 1. Ooit beschouwd als overwegend structureel raamwerk, wordt nu algemeen erkend dat de ECM bevat een uiteenlopende reeks van biologisch actieve moleculen met belangrijke functionele rol 2. Cel-ECM interacties kunnen celoverleving, adhesie, migratie, proliferatie en differentiatie 3 sturen. Terwijl de hoofdklassen van ECM macromoleculen algemeen goed geconserveerd over weefsels en species, elk weefsel een unieke matrixsamenstelling en architectuur 4. Algemene, weefsel-specifieke ECM&#39;s geeft een micro die functie medieert van de subcellulaire naar het weefsel / orgaan schaal 5. Vanwege de cruciale rol van de ECM in het bemiddelen van cellulaire functie, is er steeds meer interesse in de dekeling van ECM afgeleid bioscaffolds voor toepassingen in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. In het bijzonder is de werkwijze volgens decellularisatie uitgebreid onderzocht als een middel om ECM uit een brede reeks van weefsels voor toepassing als een stellage materiaal voor weefselregeneratie en celafgifte 5, 6, 7. Decellularisatie omvat typisch een reeks van mechanische, chemische en / of biologische behandelingsstappen gericht op het verwijderen van cellen en celcomponenten, terwijl idealiter waardoor minimale wijzigingen in de 3D structuur en samenstelling van de ECM 8. Door het onderzoeken van de literatuur, kunnen verschillende cellen ontdoen protocollen worden geïdentificeerd voor vrijwel elk weefsel in het lichaam 7. Terwijl cellen ontdane weefsels direct als implanteerbare steigers of 3D-celkweek substraten kunnen worden gebruikt, kan cellulaire infiltratiein weefsels beperkt met een dichte structuur 9 ECM. Verder kan de natuurlijke heterogeniteit in de ECM variabiliteit in celhechting en spreiding binnen de cellen ontdane matrices, die mogelijk van invloed kunnen de cellulaire respons 10 veroorzaken. Over het algemeen, terwijl veelbelovend voor sommige toepassingen, het toepassen van cellen ontdane weefsels in hun intacte vorm biedt beperkte veelzijdigheid op het gebied van tuning steiger eigenschappen zoals vorm, de poreusheid, en stijfheid, evenals de wijze van levering voor in vivo toepassingen. Om deze beperkingen te omzeilen, worden talrijke onderzoeksgroepen toepassen verdere verwerkingsmethoden voor afgestemde scaffold formaten gebruikt gedecelluleerde weefsels als basismateriaal genereren. In de eenvoudigste vorm kan dit inhouden cryomilling de ontcelde weefsels injecteerbare weefselspecifieke ECM deeltjes 11 te genereren. Deze ECM deeltjes kunnen worden geïncorporeerd als een cel-instructive component in samengestelde scaffolds met andere biomaterialen, zoals in situ verknopen hydrogels 12, 13, 14. Naast mechanische bewerking, kan gedecelluleerd weefsel worden onderworpen aan enzymatische digestie met proteolytische en / of glycolytische enzymen te ECM afgeleide hydrogels, schuimen, microdragers fabriceren en deklagen 15, 16, 17, alsmede synthetiseren bioinks voor 3D printing 18. Naast weefselmanipulatie toepassingen ECM-afgeleide bioscaffolds houden groot potentieel voor het genereren van een hogere geluidskwaliteit in vitro modellen voor biologisch onderzoek. Er is een grote behoefte aan 3D-celkweek systemen die de inheemse cellulaire micromilieu 19 beter recapituleren ontwikkelen. De meeste in vitro cell cultuur studies tot op heden zijn uitgevoerd op weefselkweek polystyreen (TCPS), die weinig correlatie met de biologisch complexe en dynamische cellulaire milieu binnen levende weefsels 20 heeft. Terwijl handig voor het bestuderen van cellulaire interacties binnen een gecontroleerde omgeving, het kweken van cellen op deze vereenvoudigde 2D starre ondergronden verandert celhechting en morfologie, evenals zowel cel-cel- en cel-ECM interacties 21, 22. De cellulaire aanpassingen waargenomen op 2D TCPS van invloed kan zijn intracellulaire signaalroutes dat diverse celfuncties met inbegrip van de overleving, proliferatie, migratie en differentiatie, wat vragen doet rijzen over de relevantie van 2D-studies in modellering in vivo systemen 23 reguleren. Er is steeds meer erkend dat cellulaire gedrag sterk kunnen variëren in 2D versus 3D-systemen 24, en dat de biochemische en biomechanical signalering met de ECM zijn essentiële mediatoren van celfunctie 25. Veel groepen hebben geprobeerd om de beperkingen van bestaande 2D te overwinnen door bekleding met TCPS ECM componenten zoals collageen, laminine en fibronectine. Hoewel deze strategieën celhechting kunnen verbeteren en kunnen cellulaire reacties te wijzigen, blijven deze modellen beperkt door hun 2D-configuratie die niet de complexe ruimtelijke organisatie of biochemie van de inheemse ECM 26, 27 heeft na te bootsen. Onze biotechniek laboratorium is geïnteresseerd in de ontwikkeling van ECM afgeleid bioscaffolds als substraten voor 3-D celcultuur en tissue engineering-toepassingen geweest. In het bijzonder hebben wij het gebruik van cellen ontdane vetweefsel (DAT) als een stellage platform adipose regeneratie 28 bood. Bovendien hebben we werkwijzen voor het synthetiseren 3D microdragers en poreuze schuimen toets D vastgesteldAT gedigereerd met proteolytische enzym pepsine of glycolytische enzym α-amylase 29, 30, 31. Met name hebben we in al deze scaffold formaten die de vetcellen afgeleide ECM biedt een inductieve micro voor adipogene differentiatie van humane adipose-afgeleide stam / stromale cellen (ASC) in kweek aangetoond. Meer recent, hebben we onze fabricagemethoden naar 3D poreuze schuimen van α-amylase-verteerd varkens cellen ontdaan linker ventrikel (DLV) genereren (decellularisatie methoden aangepast van Wainwright et al. 32), en toonde aan dat ze een ondersteunend platform voor het induceren van vroege cardiomyogene marker expressie in humaan pericard vet afgeleide ASC 31. Dit artikel beschrijft in detail de werkwijzen voor het synthetiseren van niet-chemisch verknoopt 3D poreuze schuimstoffen en microdragers zuiver afgeleidevan α-amylase-gedigereerd ECM voor gebruik als biologisch complexe 3D in vitro celkweek substraten en als biomaterialen voor weefselregeneratie. In theorie kan elk ECM bron die hoogmoleculaire collageen molecuulgewicht worden gebruikt als uitgangsmateriaal voor deze technieken. De flexibiliteit van deze benadering te demonstreren, zijn de werkwijzen toegepast op weefselspecifieke bioscaffolds genereren met menselijke DAT, varken cellen ontdane huidweefsel (DDT) 8 en varkens DLV als representatieve voorbeelden. Figuur 1 verschaft een overzicht van het fabricageproces van de ECM-afgeleide schuimen en microdragers. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig1.jpg" /> Figuur 1. Overzicht van de werkwijze voor de productie van weefsel-specifieke ECM afgeleid Schuimen en Microcarriers. 1. ontcelde weefsels geproduceerd volgens gevestigde decellularization protocollen kunnen worden gebruikt voor weefsel-specifieke ECM afgeleid bioscaffold fabricage. Macroscopische afbeeldingen worden gehydrateerd menselijke DAT (bereid zoals beschreven in Flynn 2010 28), varkens DDT (bereid zoals beschreven in Reing, JE, et al. 2010 8) en varkens DLV (bereid zoals beschreven in Wainwright et al. 2010 32 ) als representatieve voorbeelden van ECM bronnen die gebruikt kunnen worden als uitgangsmaterialen. Schaalbalken vertegenwoordigen 3 cm. 2. De van cellen ontdane weefsels worden gelyofiliseerd en vervolgens 3. mechanisch gehakt. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 cm. 4. Het gehakte ECM kan dan cryomilled, die optioneel voor schuim fabricage, maar vereist microdrager synthese. Schaalbalk staat voor 3 mm. 5. Het gehakte of cryomilled ECM wordt vervolgens gedigereerd met α-amylase en gehomogeniseerd om een homogene suspensie te maken ECM. Schaalbalk staat voor 1 cm. <strong&gt; 6a) voor schuim fabricage, de ECM suspensie wordt overgebracht in een door de gebruiker gedefinieerde vorm, ingevroren, en gelyofiliseerd een poreuze 3D scaffold met een goed gedefinieerde geometrie genereren. Schaalbalk staat voor 1 cm. 6b) Voor microdrager fabricage, de cryomilled ECM suspensie electrospray om afzonderlijke bolvormige microdragers genereren. Schaalbalk staat voor 2 mm. 7. De schuimen en microdragers kan dan geleidelijk worden gerehydrateerd en geënt met cellen. Representatieve beelden getoond van humaan ASC (levensvatbare cellen = groen) gezaaid op een DAT schuim (links) en DAT microdrager (rechts). Schaalbalken vertegenwoordigen 100 urn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur, glacial</td><td>BioShop</td><td>ACE222.500</td><td></td></tr><tr><td>Alligator clip leads</td><td>VWR</td><td>470149-728</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-101</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-amylase</td><td>Sigma</td><td>101074694</td><td>van Aspergillus aryzae</td></tr><tr><td>Analytische balans</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004251</td><td>Met draaibare emmerrotor voor 15 &amp; 50 mL centrifugebuizen</td></tr><tr><td>Centrifugebuizen (15 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen (50 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>Collageen uit boviene achillespezen (onoplosbaar)</td><td>Sigma</td><td>C9879&nbsp;</td><td>Of een vergelijkbare onoplosbare collageenbron; Kan worden gebruikt als alternatief voor decellulariseerd weefsel om de schuimen en microcarriers te fabriceren</td></tr><tr><td>Cryomilling systeem</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>MM 400</td></tr><tr><td>Exsiccator</td><td>Fisher Scientific</td><td>8624426</td><td>Voor gelyofiliseerd ECM en bioscaffold opslag</td></tr><tr><td>DMEM: F12 Hams</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Gebruikt voor proliferatie media</td></tr><tr><td>Dewar fles</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-196-6</td><td>Laagvorm; volumebereik van 250 - 500 mL</td></tr><tr><td>Dubbel gedistilleerd water (ddH2O)</td><td></td><td></td><td>Van Barnstead GenPure xCAD Waterzuiveringssysteem</td></tr><tr><td>D-PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing)</td><td>Wisent</td><td>311425125</td><td></td></tr><tr><td>ECM (Extracellulaire Matrix)</td><td></td><td></td><td>Geïsoleerd uit menselijk vetweefsel, porcine dermis of porcine myocardium, zoals beschreven in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, en Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Greenfield Specialty Alcohols Inc.</td><td>P016EAAN</td><td>Absoluut</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Wisent</td><td>80150</td><td>Gebruikt voor proliferatie media</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>VWR</td><td>37-501-32</td><td>Voor het overbrengen van de schuimen</td></tr><tr><td>Vrieskast (-20 &deg;C)</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td></td></tr><tr><td>Vrieskast (-80 &deg;C)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EXF40086A</td><td></td></tr><tr><td>Glasbuisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-26D</td><td>Om gelyofiliseerd cryogemalen ECM op te slaan</td></tr><tr><td>Handmatige homogenisator</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>Snelheid: 8.000 - 30.000 rpm</td></tr><tr><td>Homogenisator accessoires: zaagtandbodem generator sondes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-261-17</td><td>10 x 95 mm</td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td>Voor elektrosprayen</td></tr><tr><td>Lyofilisaat</td><td>Labconco</td><td>7750021</td><td>FreeZone4.5</td></tr><tr><td>Maalkamer</td><td>Retsch</td><td>02.462.0213</td><td>25 mL volume aanbevolen</td></tr><tr><td>Maalbollen</td><td>VWR</td><td>16003-606</td><td>10 mm diameter, roestvrij staal aanbevolen</td></tr><tr><td>18 G naald</td><td>VWR</td><td>C ABD305185</td><td>Voor het doseren van ECM suspensie in mallen</td></tr><tr><td>Orbitale incubator shaker</td><td>SciLogex</td><td>832010089999</td><td>Temperatuur gecontroleerd (37 &deg;C)</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Gebruikt voor proliferatie media</td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>Mandel Scientific</td><td>DRU-4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Retort standaard</td><td>VWR</td><td>470019-526</td><td></td></tr><tr><td>Retort standaard klem</td><td>VWR</td><td>21573-606</td><td></td></tr><tr><td>Safety-Lok Spuit</td><td>BD</td><td>309606</td><td>3 mL Luer lock spuit voor microcarrier fabricage en het doseren van ECM suspensie</td></tr><tr><td>Serologische pipetten (10&nbsp;mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten (25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch</td><td>BioShop</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Schepje</td><td>VWR</td><td>89259-968</td><td>Voor het verzamelen van microcarriers</td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>VWR</td><td>82027-590</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>VWR</td><td>10117-490</td><td>Microprocessor bediend</td></tr><tr><td>Hoogspanningsvoeding</td><td>Gamma High Voltage Research</td><td>ES30P-5W/DDPM</td><td>Capabel van aanbevolen 15 - 25 kV spanningsbereik</td></tr><tr><td>12-wells platen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565321</td><td>Voor gebruik als mallen tijdens schuim fabricage; Andere maten of door de gebruiker gedefinieerde mallen kunnen ook worden geselecteerd</td></tr><tr><td>Vleugel infuus set</td><td>Terumo</td><td>22258092</td><td>30 cm slanglengte, 25 G 3/4" aanbevolen; Andere naaldmaten kunnen worden gebruikt en kunnen de microcarrier diameter beïnvloeden</td></tr></tbody></table>

fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers weefsel-specifieke cell cultuur en delivery platforms

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Celfunctie wordt gemedieerd door interacties met de extracellulaire matrix (ECM), die complexe weefsel-specifieke samenstelling en architectuur heeft. De focus van dit artikel op de werkwijzen voor het vervaardigen-ECM afgeleide poreuze schuimstoffen en microdragers voor gebruik als biologisch relevante substraten in geavanceerde 3D in vitro celkweekmodellen of pro-regeneratieve steigers en mobiele afleveringssystemen voor tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Gebruik van cellen ontdaan en gezuiverd weefsel onoplosbare collageen als uitgangsmateriaal, kan de techniek worden toegepast op een breed scala van weefselspecifieke bioscaffolds met aanpasbare geometrieën synthetiseren. De aanpak omvat mechanische bewerking en milde enzymatische digestie van een ECM suspensie die wordt gebruikt om de driedimensionale schuimen of microdragers fabriceren gecontroleerde bevriezen en lyofiliseren procedures leveren. Deze zuivere ECM-afgeleide steigers zijn zeer poreus, maar stabiel zonder dat chemieal verknopingsmiddelen of andere additieven die een negatieve invloed celfunctie. De scaffold eigenschappen te stemmen op zekere hoogte door het variëren van factoren zoals de ECM suspensieconcentratie, mechanische verwerkingsmethoden of syntheseomstandigheden. In het algemeen zijn de steigers zijn robuust en gemakkelijk te hanteren, en kan worden verwerkt als weefsels voor de meeste standaard biologische tests, die een veelzijdige en gebruiksvriendelijke 3D celcultuur platform dat de inheemse ECM samenstelling nabootst. Algemeen, kunnen deze eenvoudige werkwijzen voor het vervaardigen van aangepaste ECM-afgeleide schuimen en microdragers van belang voor zowel biologen en biomedische ingenieurs weefselspecifieke cel leerzaam platforms voor in vitro en in vivo toepassingen.

In deze studie hebben we-ECM afgeleide schuim en microdragers vervaardigd met menselijke DAT, varken DDT en varkens DLV als representatieve voorbeelden demonstreren dat de technieken kunnen worden toegepast op weefselspecifieke bioscaffolds met verschillende cellen ontdane weefsels ECM bronnen (genereren figuur 1). Voor zowel schuim en microdrager fabricage, de Nishihara techniek van collageen oplosbaar maken met de glycolytische enzym α-amylase 37 is aangepast om een viskeuze ECM suspensie van cellen ontdane weefsel uitgangsmaterialen, die wordt gebruikt om de bioscaffolds gecontroleerde bevriezen en lyofiliseren procedures synthetiseren genereren. Het schuimen te vervaardigen, kan de van cellen ontdane weefsel worden verwerkt door mechanisch en hakken of cryomilling aan het oppervlak voorafgaand aan enzymatische digestie verhogen. volgend45, amylase behandeling en homogenisatie de verkregen ECM suspensie gebracht in een door de gebruiker gedefinieerde vorm, die vervolgens ingevroren en gevriesdroogd. De steigers kunnen stabiel worden opgeslagen in een droge toestand voor langere tijd. Voorafgaand aan gebruik in celkweek onderzoeken, moet de gevriesdroogde steigers worden onderworpen aan een gecontroleerde rehydratie proces poreuze en sterk gehydrateerde homogene schuimen verkregen uit zuivere ECM (Figuur 3A) oplevert. Als de schuimen te snel opnieuw gehydrateerd, kan snelle zwelling beschadigen delicate structurele kenmerken, wat resulteert in verlies van integriteit en structurele instorten. In het algemeen zal het schuim de vorm gedefinieerd door de oorspronkelijke vorm na rehydratatie behouden en stabiel zonder chemische verknoping. figuur 3B toont representatieve scanning elektronenmicroscoop (SEM) foto&#39;s van DAT, DDT en DLV schuimen vervaardigd met cryomilled ECM bij een concentratie van 35 mg / mL en een vriestemperatuur van -80 &amp; #176; C. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig3.jpg" /> Figuur 3. Representatieve afbeeldingen van de DAT, DDT en DLV Schuimen Gefabriceerde met Cryomilled ECM Suspensies in een concentratie van 35 mg / ml en ingevroren bij -80 ° C. A: Macroscopisch gezien de DAT, DDT en DLV gemalen schuimen gesynthetiseerd op een 48-well weefselkweekplaat matrijs na rehydratatie. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 cm. B: SEM beelden van DAT, DDT en DLV schuimen die een homogeen poreus ultrastructuur. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 urn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> De cryomilled ECM suspensies kunnen ook worden toegepast om zuivere ECM afgeleid microdragers via electrospraying technieken (Figuur 2 </strong&gt;). Voor iedere ECM bron, de suspensieconcentratie, naaldenmeter, infusiesnelheid en spanning kan worden afgestemd op discrete sferische microdragers variërend van 350 genereert - 500 pm in diameter bij gecontroleerde rehydratie (Figuur 4A). Terwijl de microdragers kunnen worden opgeslagen in een gevriesdroogde toestand, wordt aanbevolen voor het gemak van hanteren dat zij worden afgegeven of gezeefd tot een gewenst groottegebied na opnieuw suspenderen in ethanol. SEM beeldvorming suggereert dat de microdrager ultrastructuur kan variëren afhankelijk van de van cellen ontdane weefselbron (figuur 4B). <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig4.jpg" /> Figuur 4. Representatieve afbeeldingen van de DAT, DDT en DLV Microcarriers Gefabriceerde met Cryomilled ECM Suspensies in een concentratie van 35 mg / ml, een infusiesnelheid van 0,5 ml / min en een spanning van 20 kV. A: Macroscopische view of de gehydrateerde DAT, DDT en DLV microdragers. Schaalbalken vertegenwoordigen 4 mm. B: SEM beelden van DAT, DDT en DLV microdragers waaruit blijkt dat de ultrastructuur en de grootte kan variëren naargelang de ECM bron. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 urn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> De mechanische eigenschappen van de steigers zijn afhankelijk van de ECM bron, de wijze van verwerking toegepast (bijv fijnhakken versus cryomilling), de ECM suspensieconcentratie en de vriestemperatuur. In het algemeen zijn de steigers zijn zacht en compatibel met moduli Young in het gebied van 1-5 kPa gerapporteerd voor de DAT (50 en 100 mg / ml) 29 en DLV schuim (20-50 mg / ml) 31 en &lt;1 kPa voor de microdragers. De cryomilled schuimen zijn meestal zachter theen gehakt schuimen als gevolg van hun meer verstoord natuur. Gespecialiseerde mechanische testsystemen uitgerust met zeer gevoelige weegcellen nodig voor nauwkeurige karakterisering van de samendrukkende eigenschappen. Kenmerkend zullen de schuimen en microdragers lagere moduli dan het natieve cellen ontdane weefsel vanwege de extra verwerkingsstappen betrokken bij fabricage waaronder enzymatische digestie en homogenisatie en de niet-covalent verknoopte karakter van de steigers hebben. Dit kan echter variëren afhankelijk van het weefsel van belang. Bijvoorbeeld in eerder werk hebben we vastgesteld dat gehakt DAT schuimen vervaardigd bij hoge ECM concentraties (100 mg / ml) was vergelijkbaar met natief moduli vetweefsel 29. De gerehydrateerde ECM-afgeleide schuimen en microdragers kunnen worden ingezaaid met cellen onder statische of dynamische kweekomstandigheden een cel ondersteunende platform voor in vitro celcultuur studies en / or in vivo afgifte van cellen. Terwijl de steigers algemeen ondersteunen celhechting, zal het zaaien rendement hangen af ​​van de ECM bron, het schavot geometrie en porositeit en het celtype. Als zodanig zal het zaaien methoden en dichtheden optimalisatie vereisen, afhankelijk van de door de gebruiker gedefinieerde voorwaarden. Voor de hierboven beschreven schuimsoorten aanbevolen een startpunt celconcentratie in het traject van 0,25-1 x 10 6 cellen / skelet, met dynamische enten op een orbitale schudinrichting voor celinfiltratie verbeteren. Voor de microdragers, stellen we een initiële zaaidichtheid in het gebied van 25.000 - 50.000 cellen / mg microdragers met enten uitgevoerd onder dynamische omstandigheden in een spinner kolf 11. De onderin figuur 1 beelden representeren menselijke ASC gezaaid op een DAT schuim (links) of DAT microdrager (rechts, van tevoren gemarkeerd met een amine-reactieve kleurstof en blauw verschijnen 13), zoals gevisualiseerd door confocale micro-scopie met behulp van een fluorescerende kleurstof cellevensvatbaarheid (levende cellen = groen, dode cellen = rood; Schaalbalken vertegenwoordigen 100 urn). Confocale microscopie kan worden gebruikt om cellen gezaaid op het oppervlak van schuim tot 2 mm dik visualiseren, maar zichtbaar in de centrale gebieden van de steigers wordt beperkt door de opake aard. Echter, kunnen de schuimen en microdragers weefsels worden behandeld en in paraffine ingebed of cryo-coupes voor histologische en immunohistochemische analyses celverdeling en merkerexpressie visualiseren.

Het weefsel-specifieke extracellulaire matrix (ECM) is een sleutelmediator van celfunctie. Dit artikel beschrijft werkwijzen voor het synthetiseren van zuiver ECM afgeleide schuimen en microdragers die stabiel in cultuur zonder de noodzaak voor chemische verknoping voor toepassingen in geavanceerde 3D in vitro celkweekmodellen of pro-regeneratieve bioscaffolds.

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Het algemene doel van dit protocol is het aanpassen van de grootte van niet-chemisch gecrosslinkte schuimen of microdragers, afgeleid van weefselspecifieke extracellulaire matrix, voor toepassingen in 3D in-vitro celcultuurmodellen of als pro-regeneratieve scaffolds in celafgiftesystemen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van toegepaste celbiologie en weefseltechnologie, zoals de wijze waarop de 3D cellulaire micro-omgeving de celfunctie en weefselregeneratie medieert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de fabricage mogelijk maakt van scaffolds met instelbare geometrieën die de samenstelling van de natuurlijke weefselspecifieke ECM nabootsen en stabiel blijven in langetermijnculturen zonder aanvullende crosslinking.Nadat de uit weefsel afgeleide ECM volgens het tekstprotocol is gelyofiliseerd, wordt het gedecellulariseerde weefsel met scherpe chirurgische scharen fijngehakt. Om het bewerkte weefsel te cryomillen, vult u een roestvrijstalen maalkamer van 25 milliliter voor een laboratorium kogelmolensysteem met de fijngehakte gelyofiliseerde ECM en voegt u twee roestvrijstalen maalkogels van 10 milliliter toe. Sluit de gevulde maalkamer en dompel deze gedurende drie minuten volledig onder in vloeibare stikstof.Maal het bevroren monster vervolgens gedurende drie minuten bij 30 Hertz. Herhaal het onderdompelen in vloeibare stikstof en het malen totdat de ECM is vermalen tot een fijn poeder. Weeg 250 milligram van de fijngehakte of cryogemalen ECM af en breng dit over naar een centrifugebuis van 15 milliliter.Voeg vijf milliliter 22 molar NaH2PO4-buffer toe aan de centrifugebuis en markeer het vloeistofniveau op de buis. Bereid vervolgens een voorraadoplossing van alfa-amylase door 7,5 milligram alfa-amylase toe te voegen aan één milliliter 22 molar NaH2PO4-buffer. Voeg daarna 100 microliters van de voorraadoplossing van alfa-amylase toe aan het monster.Voeg vervolgens 22 molar NaH2PO4 toe om een eindvolume van 10 milliliters te verkrijgen. Agiteer de suspensie continu bij 300 RPM en kamertemperatuur gedurende 72 uur. Centrifugeer de suspensie bij 1500 times G gedurende 10 minuten.Verzamel voorzichtig het supernatant en gooi dit weg zonder het gedigereerde ECM-pellet te verstoren. Gebruik vervolgens 10 milliliters van vijf procent NaCl verdund in dubbel gedestilleerd water om het gepelletteerde materiaal opnieuw te suspenderen en schud dit continu gedurende 10 minuten bij 300 RPM. Herhaal het wassen nog twee keer voordat u 10 milliliters dubbel gedestilleerd water gebruikt om het pellet opnieuw te suspenderen.Agiteer de suspensie vervolgens continu gedurende 10 minuten bij 300 RPM bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster opnieuw en verzamel en verwijder vervolgens voorzichtig de supernatant zonder het pellet van de gedigesteerde ECM te verstoren. Voeg 2 molar azijnzuur toe tot het vijfmilliliterstreepje.En vortexen. Agiteer de suspensie vervolgens continu bij 120 RPM en 37 °C gedurende de nacht. Homogeniseer de ECM-suspensie de volgende dag bij kamertemperatuur met een handhomogenisator uitgerust met een 10 mm brede zaagtandsonde in intervallen van 10 seconden totdat er geen zichtbare fragmenten meer aanwezig zijn.Plaats de suspensie tussen de homogenisatie-intervallen in een bekerglas met koud water om oververhitting te voorkomen. Incubeer de ECM-suspensie bij 37 °C met continue agitatie bij 120 RPM totdat de suspensie warm is. Gebruik vervolgens 2 M azijnzuur om de monster-suspensie te verdunnen tot de gewenste concentratie.Vul de gewenste mal met de ECM-suspensie met behulp van een spuit van 3 mL en een naald van 18 gauge. Schuimen kunnen in diverse geometrieën worden vervaardigd, afhankelijk van de vorm van de mal. Dek de mallen af en vries deze in bij -20 of -80 °C.Plaats de mallen vervolgens in een vriesdroogkolf. Sluit de kolf aan op het vriesdroogsysteem van het laboratorium en droog de mallen gedurende 24 uur of tot ze volledig droog zijn. Incubeer de cryogemaalde ECM-suspensie overnacht bij continue agitatie van 100 RPM.Laad drie milliliters ECM-suspensie in een spuit van drie milliliter met luer-lock en bevestig een vleugelinfuussysteem aan de opening van de spuit. Zet de spuit vast in de spuitpomp. Bevestig vervolgens de naald aan een statief en positioneer de naaldpunt verticaal op een afstand van vier tot zes centimeters boven de opening van een laag gevormde Dewar-fles.Bevestig vervolgens een krokodillenklem-elektrode aan de punt van de naald en zorg er ook voor dat de krokodillenklem is verbonden met de positieve pool van de hoogspanningsvoeding. Vouw een strip aluminiumfolie over de rand van de vacuümfles. Bevestig daarna een tweede krokodillenklem-elektrode aan de buitenrand van de folie.Sluit het aan op de aardingsklem van de voeding. Vul de Dewar-kolf met vloeibare stikstof tot ongeveer één centimeter onder de rand, zodat driekwart van de folie is ondergedompeld. Stel vervolgens de spuitpomp in op een infusiesnelheid van 30 milliliters per uur en voer de electrospray van de monsters uit volgens het tekstprotocol.Zodra de infusie is voltooid, giet u voorzichtig het overtollige vloeibare stikstof uit de Dewar, waarbij de microcarriers in ongeveer 25 milliliters vloeibare stikstof blijven hangen om te garanderen dat ze bevroren blijven. Breng de microcarriers onmiddellijk samen met de vloeibare stikstof over in een 50 milliliter centrifugebuis door deze in één vloeiende beweging over te gieten. Gebruik vervolgens een Scoopula om eventuele bevroren microcarriers die in de Dewar zijn achtergebleven te verzamelen.Voeg deze ook toe aan de centrifuge. Om ze voor te bereiden op lyofilisatie, wordt de centrifugebuis bedekt met aluminiumfolie waarin kleine gaatjes zijn geperforeerd. Plaats de bedekte centrifugebuizen in een lyofilisatiefles.Sluit de kolf vervolgens onmiddellijk aan op de lyofilisator en droog de monsters gedurende de nacht. Breng het gelyofiliseerde schuim voorzichtig over in een centrifugebuis van 50 milliliter met een overmaat aan absolute ethanol. Resuspendeer op dezelfde wijze de gelyofiliseerde microcarriers in een overmaat aan absolute ethanol in de oorspronkelijke centrifugebuis die voor de opvang is gebruikt.Filter de microdragers met een serologische pipette door een roestvrijstalen zeef met een gedefinieerde maaswijdte in een nieuwe centrifugebuis van 50 milliliter om aggregaten te verwijderen en de gewenste groottebereiken te selecteren. Incubeer het monster bij vier graden Celsius gedurende vier uur of totdat het schuim of de microdragers naar de bodem van de centrifugebuis zijn gezakt. Verwijder vervolgens, onder een laminaire flowkap met aseptische techniek, de absolute ethanol van de scaffolds met een serologische pipette en voeg een overmaat aan 95% ethanol toe, verdund met steriele PBS.Incubeer de scaffolds bij 4 °C gedurende vier uur of totdat de scaffolds naar de bodem van het rehydratatievat zijn gezakt. Rehydrateer de scaffolds geleidelijk via een ethanolserie. Incubeer bij elke stap de scaffolds bij 4 °C totdat ze naar de bodem van het vat zakken, alvorens de oplossing te vervangen.Vervang de steriele PBS door twee extra spoelingen om residuen van ethanol te verwijderen. Bewaar de monsters in 100% steriele PBS bij vier graden Celsius tot ze klaar zijn voor celkweek. Gebruik de scaffolds binnen één tot twee weken na rehydratie.Hier worden voorbeelden getoond van de typen ECM-afgeleide schuimen en microdragers die zijn gefabriceerd met gebruik van gedecellulariseerd vetweefsel. Porcijen gedecellulariseerd dermaal weefsel en porcijen gedecellulariseerde linker ventrikel. Hiermee wordt aangetoond dat de technieken kunnen worden toegepast om weefselspecifieke bio-scaffolds te genereren met behulp van diverse gedecellulariseerde weefsels als ECM-bronnen.Na cryomalen of versnijden, enzymatische digestie en homogenisatie kunnen de monsters in een kom worden verdeeld vóór bevriezing en lyofilisatie. Deze figuur toont rehydrateerd gemalen DAT-, DDT- en DLV-schuim, gesynthetiseerd in een mal van een 48-wells weefselkweekplaat. Deze DAT-, DDT- en DLV-schuimen werden gefabriceerd met cryogemalen ECM bij een concentratie van 35 mg/mL en een vriestemperatuur van -80 °C.Om ECM-afgeleide microcarriers te vervaardigen met een electrosprayingtechniek, kunnen voor elke ECM-bronsuspensieconcentratie de naaldmaat, de infusiesnelheid en het voltage worden afgestemd om discrete sferische microcarriers te genereren met een diameter variërend van 350 tot 500 micrometer na gecontroleerde rehydratie. Ten slotte laten de hier met SEM getoonde DAT-, DDT- en DLV-microcarriers zien dat de ultrastructuur in grootte kan variëren afhankelijk van de gedecellulariseerde ECM-bron. De in deze video gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om een diverse reeks weefselspecifieke microcarriers en schuimen te vervaardigen die bestaan uit pure, niet-chemisch gecrosslinkte ECM, waarbij gedecellulariseerd weefsel als matrixbron dient.Na het volgen van deze procedures kunnen de schuimen en microcarriers worden gezaaid met cellen onder statische of dynamische omstandigheden en kunnen ze worden toegepast als een cel-instructief substraat voor in vitro celcultuur en in vivo toepassingen.

fabrication-extracellular-matrix-derived-foams-microcarriers-as

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

This video describes the preparation of a homogenized and digested extracellular matrix suspension from decellularized and lyophilized tissues. This technique helps in fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as substrates in advanced 3D cell culture models.

ECM Suspension Preparation: A Technique to Obtain Homogenous Suspension from Tissue-derived Extracellular Matrix

This video describes the method for synthesizing pure ECM-derived foams without the need for chemical crosslinking. These ECM-derived foams find applications as advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Extracellular Matrix-derived Foam Fabrication via Lyophilization: A Procedure to Generate Biological Scaffolds from ECM of Decellularized Tissues

This video demonstrates the procedure of extracellular matrix-derived microcarrier fabrication by electrospraying. These microcarriers simulate the native tissue-specific microenvironment and are stable in long-term 3D in vitro cell culture models.

Bioscaffold Fabrication by Electrospraying: A Technique to Generate Microcarrier Scaffolds Derived from Extracellular Matrix of Decellularized Tissue

Deze studie geeft een methode voor 3D, bioafbreekbare, schuimachtige cellen steigers basis van biocompatibele zijketen vloeibaar kristal elastomeren (LCEs) te bereiden. Confocale microscopie experimenten tonen aan dat schuimachtige LCEs zorgen voor celhechting, proliferatie en de spontane uitlijning van C2C12s myoblasten.

Synthese van biocompatibel Liquid Crystal elastomeerschuimen als Cell Stellingen voor 3D Ruimtelijke Cell Cultures

Dit protocol beschrijft de fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels door de integratie van microfabrication met cryogelation-technologie. Bij het laden met cellen, worden 3D-microtissues gegenereerd, die kan gemakkelijk ingespoten in vivo om regeneratieve therapie of geassembleerd tot arrays voor in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

Wij stellen voor een cel expansie protocol betreffende macroporeuze microcarriers en hun gebruik als levering systeem in een bioreactor perfusie om het zonebeheer van een matrix decellularized weefsel. Wij omvatten ook verschillende technieken om te bepalen van celproliferatie en levensvatbaarheid van cellen gekweekt op microcarriers. Bovendien tonen we functionaliteit van cellen na bioreactor culturen.

Recombinante collageen ik Peptide Microcarriers voor cel expansie en hun mogelijke toepassing als cel levering systeem in een Bioreactor Model

Het doel van dit protocol is productie van hele extracellulaire matrix vezels die voor reparatie van de wond wordt gericht die geschikt voor preklinische evaluatie als onderdeel van een regeneratieve steiger implantaat zijn. Deze vezels worden geproduceerd door de cultuur van fibroblasten op holle vezel membranen en geëxtraheerd door ontbinding van de membranen.

Productie van extracellulaire Matrix vezels via cultuur van de cel van de membraan van opofferende holle vezel

Het doel van deze methode is om fibroblast-afgeleide 3D-matrices te verkrijgen als een natuurlijke steiger voor volgende cellulaire assays. Fibroblasten worden in een voorbehandelde kweek plaat geseeid en gestimuleerd met ascorbinezuur voor matrix generatie. Matrices zijn decellularized en geblokkeerd voor de kweek van relevante cellen (bijv. endotheel cellen).

Fibroblast-afgeleid 3D-matrix systeem dat van toepassing is op endotheliale buis vorming assay

Hier wordt een milde 3D-printtechniek gepresenteerd die wordt aangedreven door afwisselend viskeuze-traagheidskrachten om de constructie van hydrogel-microdragers mogelijk te maken. Zelfgemaakte nozzles bieden flexibiliteit, waardoor eenvoudige vervanging voor verschillende materialen en diameters mogelijk is. Celbindende microdragers met een diameter van 50-500 μm kunnen worden verkregen en verzameld voor verdere kweek.

3D-printen van in vitro hydrogel microdragers door afwisselend viskeuze-traagheidskracht jetting

Hoewel de stijfheid van de extracellulaire matrix (ECM) een belangrijke regulator is van cellulair gedrag, blijven de onderliggende sensor- en transductiemechanismen onduidelijk. Om dit aan te pakken, bieden we protocollen aan voor het creëren van polyacrylamide- en siliconengebaseerde substraten met afstembare stijfheid, om ons begrip van cel-ECM-overklank te vergroten.

Generatie van polyacrylamide en siliconen extracellulaire matrixsubstraten met gedefinieerde stijfheid voor toepassingen in de celbiologie

Leer de fabricage van ECM-afgeleide schuimen en microdragers zonder chemische crosslinking voor weefsel-specifieke 3D-celkweek. Deze methode biedt stabiele substraten voor regeneratief geneeskundig onderzoek.

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Meer video's verkennen