Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Het algemene doel van dit protocol is het aanpassen van de grootte van niet-chemisch gecrosslinkte schuimen of microdragers, afgeleid van weefselspecifieke extracellulaire matrix, voor toepassingen in 3D in-vitro celcultuurmodellen of als pro-regeneratieve scaffolds in celafgiftesystemen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van toegepaste celbiologie en weefseltechnologie, zoals de wijze waarop de 3D cellulaire micro-omgeving de celfunctie en weefselregeneratie medieert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de fabricage mogelijk maakt van scaffolds met instelbare geometrieën die de samenstelling van de natuurlijke weefselspecifieke ECM nabootsen en stabiel blijven in langetermijnculturen zonder aanvullende crosslinking.

Nadat de uit weefsel afgeleide ECM volgens het tekstprotocol is gelyofiliseerd, wordt het gedecellulariseerde weefsel met scherpe chirurgische scharen fijngehakt. Om het bewerkte weefsel te cryomillen, vult u een roestvrijstalen maalkamer van 25 milliliter voor een laboratorium kogelmolensysteem met de fijngehakte gelyofiliseerde ECM en voegt u twee roestvrijstalen maalkogels van 10 milliliter toe. Sluit de gevulde maalkamer en dompel deze gedurende drie minuten volledig onder in vloeibare stikstof.

Maal het bevroren monster vervolgens gedurende drie minuten bij 30 Hertz. Herhaal het onderdompelen in vloeibare stikstof en het malen totdat de ECM is vermalen tot een fijn poeder. Weeg 250 milligram van de fijngehakte of cryogemalen ECM af en breng dit over naar een centrifugebuis van 15 milliliter.

Voeg vijf milliliter 22 molar NaH2PO4-buffer toe aan de centrifugebuis en markeer het vloeistofniveau op de buis. Bereid vervolgens een voorraadoplossing van alfa-amylase door 7,5 milligram alfa-amylase toe te voegen aan één milliliter 22 molar NaH2PO4-buffer. Voeg daarna 100 microliters van de voorraadoplossing van alfa-amylase toe aan het monster.

Voeg vervolgens 22 molar NaH2PO4 toe om een eindvolume van 10 milliliters te verkrijgen. Agiteer de suspensie continu bij 300 RPM en kamertemperatuur gedurende 72 uur. Centrifugeer de suspensie bij 1500 times G gedurende 10 minuten.

Verzamel voorzichtig het supernatant en gooi dit weg zonder het gedigereerde ECM-pellet te verstoren. Gebruik vervolgens 10 milliliters van vijf procent NaCl verdund in dubbel gedestilleerd water om het gepelletteerde materiaal opnieuw te suspenderen en schud dit continu gedurende 10 minuten bij 300 RPM. Herhaal het wassen nog twee keer voordat u 10 milliliters dubbel gedestilleerd water gebruikt om het pellet opnieuw te suspenderen.

Agiteer de suspensie vervolgens continu gedurende 10 minuten bij 300 RPM bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster opnieuw en verzamel en verwijder vervolgens voorzichtig de supernatant zonder het pellet van de gedigesteerde ECM te verstoren. Voeg 2 molar azijnzuur toe tot het vijfmilliliterstreepje.

En vortexen. Agiteer de suspensie vervolgens continu bij 120 RPM en 37 °C gedurende de nacht. Homogeniseer de ECM-suspensie de volgende dag bij kamertemperatuur met een handhomogenisator uitgerust met een 10 mm brede zaagtandsonde in intervallen van 10 seconden totdat er geen zichtbare fragmenten meer aanwezig zijn.

Plaats de suspensie tussen de homogenisatie-intervallen in een bekerglas met koud water om oververhitting te voorkomen. Incubeer de ECM-suspensie bij 37 °C met continue agitatie bij 120 RPM totdat de suspensie warm is. Gebruik vervolgens 2 M azijnzuur om de monster-suspensie te verdunnen tot de gewenste concentratie.

Vul de gewenste mal met de ECM-suspensie met behulp van een spuit van 3 mL en een naald van 18 gauge. Schuimen kunnen in diverse geometrieën worden vervaardigd, afhankelijk van de vorm van de mal. Dek de mallen af en vries deze in bij -20 of -80 °C.

Plaats de mallen vervolgens in een vriesdroogkolf. Sluit de kolf aan op het vriesdroogsysteem van het laboratorium en droog de mallen gedurende 24 uur of tot ze volledig droog zijn. Incubeer de cryogemaalde ECM-suspensie overnacht bij continue agitatie van 100 RPM.

Laad drie milliliters ECM-suspensie in een spuit van drie milliliter met luer-lock en bevestig een vleugelinfuussysteem aan de opening van de spuit. Zet de spuit vast in de spuitpomp. Bevestig vervolgens de naald aan een statief en positioneer de naaldpunt verticaal op een afstand van vier tot zes centimeters boven de opening van een laag gevormde Dewar-fles.

Bevestig vervolgens een krokodillenklem-elektrode aan de punt van de naald en zorg er ook voor dat de krokodillenklem is verbonden met de positieve pool van de hoogspanningsvoeding. Vouw een strip aluminiumfolie over de rand van de vacuümfles. Bevestig daarna een tweede krokodillenklem-elektrode aan de buitenrand van de folie.

Sluit het aan op de aardingsklem van de voeding. Vul de Dewar-kolf met vloeibare stikstof tot ongeveer één centimeter onder de rand, zodat driekwart van de folie is ondergedompeld. Stel vervolgens de spuitpomp in op een infusiesnelheid van 30 milliliters per uur en voer de electrospray van de monsters uit volgens het tekstprotocol.

Zodra de infusie is voltooid, giet u voorzichtig het overtollige vloeibare stikstof uit de Dewar, waarbij de microcarriers in ongeveer 25 milliliters vloeibare stikstof blijven hangen om te garanderen dat ze bevroren blijven. Breng de microcarriers onmiddellijk samen met de vloeibare stikstof over in een 50 milliliter centrifugebuis door deze in één vloeiende beweging over te gieten. Gebruik vervolgens een Scoopula om eventuele bevroren microcarriers die in de Dewar zijn achtergebleven te verzamelen.

Voeg deze ook toe aan de centrifuge. Om ze voor te bereiden op lyofilisatie, wordt de centrifugebuis bedekt met aluminiumfolie waarin kleine gaatjes zijn geperforeerd. Plaats de bedekte centrifugebuizen in een lyofilisatiefles.

Sluit de kolf vervolgens onmiddellijk aan op de lyofilisator en droog de monsters gedurende de nacht. Breng het gelyofiliseerde schuim voorzichtig over in een centrifugebuis van 50 milliliter met een overmaat aan absolute ethanol. Resuspendeer op dezelfde wijze de gelyofiliseerde microcarriers in een overmaat aan absolute ethanol in de oorspronkelijke centrifugebuis die voor de opvang is gebruikt.

Filter de microdragers met een serologische pipette door een roestvrijstalen zeef met een gedefinieerde maaswijdte in een nieuwe centrifugebuis van 50 milliliter om aggregaten te verwijderen en de gewenste groottebereiken te selecteren. Incubeer het monster bij vier graden Celsius gedurende vier uur of totdat het schuim of de microdragers naar de bodem van de centrifugebuis zijn gezakt. Verwijder vervolgens, onder een laminaire flowkap met aseptische techniek, de absolute ethanol van de scaffolds met een serologische pipette en voeg een overmaat aan 95% ethanol toe, verdund met steriele PBS.

Incubeer de scaffolds bij 4 °C gedurende vier uur of totdat de scaffolds naar de bodem van het rehydratatievat zijn gezakt. Rehydrateer de scaffolds geleidelijk via een ethanolserie. Incubeer bij elke stap de scaffolds bij 4 °C totdat ze naar de bodem van het vat zakken, alvorens de oplossing te vervangen.

Vervang de steriele PBS door twee extra spoelingen om residuen van ethanol te verwijderen. Bewaar de monsters in 100% steriele PBS bij vier graden Celsius tot ze klaar zijn voor celkweek. Gebruik de scaffolds binnen één tot twee weken na rehydratie.

Hier worden voorbeelden getoond van de typen ECM-afgeleide schuimen en microdragers die zijn gefabriceerd met gebruik van gedecellulariseerd vetweefsel. Porcijen gedecellulariseerd dermaal weefsel en porcijen gedecellulariseerde linker ventrikel. Hiermee wordt aangetoond dat de technieken kunnen worden toegepast om weefselspecifieke bio-scaffolds te genereren met behulp van diverse gedecellulariseerde weefsels als ECM-bronnen.

Na cryomalen of versnijden, enzymatische digestie en homogenisatie kunnen de monsters in een kom worden verdeeld vóór bevriezing en lyofilisatie. Deze figuur toont rehydrateerd gemalen DAT-, DDT- en DLV-schuim, gesynthetiseerd in een mal van een 48-wells weefselkweekplaat. Deze DAT-, DDT- en DLV-schuimen werden gefabriceerd met cryogemalen ECM bij een concentratie van 35 mg/mL en een vriestemperatuur van -80 °C.

Om ECM-afgeleide microcarriers te vervaardigen met een electrosprayingtechniek, kunnen voor elke ECM-bronsuspensieconcentratie de naaldmaat, de infusiesnelheid en het voltage worden afgestemd om discrete sferische microcarriers te genereren met een diameter variërend van 350 tot 500 micrometer na gecontroleerde rehydratie. Ten slotte laten de hier met SEM getoonde DAT-, DDT- en DLV-microcarriers zien dat de ultrastructuur in grootte kan variëren afhankelijk van de gedecellulariseerde ECM-bron. De in deze video gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om een diverse reeks weefselspecifieke microcarriers en schuimen te vervaardigen die bestaan uit pure, niet-chemisch gecrosslinkte ECM, waarbij gedecellulariseerd weefsel als matrixbron dient.

Na het volgen van deze procedures kunnen de schuimen en microcarriers worden gezaaid met cellen onder statische of dynamische omstandigheden en kunnen ze worden toegepast als een cel-instructief substraat voor in vitro celcultuur en in vivo toepassingen.