Name: Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Leer hoe antilichaam-conjugaten worden geëvalueerd op specificiteit en effectiviteit voor tumorgerichte accumulatie met behulp van PET-beeldvorming en celbiologische technieken. Deze methode verbetert de ontwikkeling van gerichte kankertherapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door de kanker Research Society (Canada) en de CIMS. De auteurs bedanken Dr. Samia Ait-Mohand en Jean-Francois Beaudoin voor hulp. Dr. Angel Lopez (Universiteit van Zuid-Australië) voor mAb A14.

De in vivo dierproeven beschreven werden uitgevoerd volgens een goedgekeurde protocol en onder de ethische richtsnoeren van de ethische commissie van Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke voor dier experimenten.
1. antilichaam Peptide Woordherkomst en-opbouw
Opmerking: ChAcNLS kan gesynthetiseerd worden bij elke commerciële peptide fabrikant of universiteit-aangesloten peptide synthese serviceplatform. De synthese van ChAcNLS kan worden gevonden in verwijzing 34. Procedures 1 en 2 gebruikt u de mAb 7G 3, specifiek voor de leukemie-antigeen IL-3Rα- 39.
<ol><li>In een tube van 1,7 mL microcentrifuge, bereid een 10 mg/mL (~ 1 mg totale antilichaam) oplossing voor 7G 3 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,6.</li>
	<li>Ontbinden sulfo-SMCC in dimethylsulfoxide (DMSO) met een concentratie van 5-10 mM. Vortexing de oplossing zeer grondig geschikt met het oog op een volledige ontbinding.</li>
	<li>Voeg toe aan de buis met 7G 3 de opgeloste sulfo-SMCC-oplossing (doorgaans tussen 5-20 μL afhankelijk van de molaire verhouding van sulfo-SMCC-tot - 7G 3 gewenst). Testen van sulfo-SMCC-tot - 7G 3 ratio's van 10 - 25- en 50-tegen-1 wordt aanbevolen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.</li>
	<li>
Zuiveren en het concentreren van de 3 7G maleimide-derivatized met behulp van een ultrafiltratie apparaat en buffer uitwisseling in PBS, pH 7.0. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende ongeveer 5 min. Discard stroom door en vul met PBS pH 7,0 en centrifuge opnieuw.
	<ol>
<li>Uitvoeren van dit 7 - 8 keer te wisselen volledig de buffer. Recover de geconcentreerde 7G 3 eiwit door het plaatsen van het apparaat filter ondersteboven in een schone microcentrifuge buis. Centrifugeer gedurende 2 min op 1000 x g. herstel volume moet ongeveer 0.3 mL</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 2-fold molaire overmaat van ChAcNLS ten opzichte van de sulfo-SMCC-tot - 7G 3-verhouding gebruikt in de vorige stap in de buis met de maleimide-geactiveerde 7G 3, en na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Bijvoorbeeld, als een 10-tegen-1 sulfo-SMCC-tot - 7G 3-verhouding werd gebruikt, gebruikt u een 20-tegen-1 ChAcNLS-tot - 7G 3-verhouding. Totale volume mag niet aanzienlijk worden gewijzigd. Opmerking: Hoewel ChAcNLS geen neerslag tijdens het Gelijkklinkende woorden veroorzaakt dit is een mogelijkheid die met andere peptiden optreden kan. Observeer de buis tijdens de reactie op tekenen van neerslag, die waarschijnlijk wordt veroorzaakt wanneer peptiden hydrofobe zijn. In deze gevallen wellicht moeite waard zijn herzien van de peptide van belang om ontwerpwijzigingen om verhoogde hydrophilicity.</li>
	<li>Het concentreren van de 7G 3-ChAcNLS met behulp van een apparaat van de ultrafiltratie aan gewenste concentratie en buffer uitwisseling in PBS pH 7.4 (zie stap 1.4). De opbrengst van de terugwinning van totaal eiwit moet ≥ 75% van de oorspronkelijke grondstof.</li>
	<li>SDS-pagina om te evalueren van de geconstrueerde 7G 3-ChAcNLS kandidaten met behulp van een 12% polyacrylamide-gel (biedt voldoende scheiding van de ChAcNLS geconjugeerd zware en lichte kettingen van nonconjugated ketens) uitvoeren. Mix 10 μg 7G 3-ChAcNLS in PAGINALADING buffer met 2 μL β-mercaptoethanol en laadt in goed.</li>
	<li>Instellen van de juiste spanning (120 V voor 1 h voor een 12% gel) en voer de elektroforese. Stop de elektroforese wanneer de voorkant van de kleurstof Coomassie de onderkant van de gel bereikt. Opmerking: Laat niet de Coomassie kleurstof voorkant weggelopen van de gel.</li>
	<li>Verwijderen van gel uit elektroforese apparaat en spoel met destaining oplossing met 10% (v/v) van ijsazijn en 20% v/v methanol.</li>
	<li>Maak een foto van de gel en met een liniaal en meet de afstand (cm) gemigreerd voor de normen en 7G 3 geconjugeerde. Berekenen van de waarde van de retentie factor (Rf), waarin de afstand wordt gemigreerd verdeeld door de lengte van de gel (vanaf waar eiwit wordt geladen naar de voorkant van de migratie Coomassie). Uitzetten van het molecuulgewicht (MW) in logboek tegen de Rf-waarden van elke standaard proteïne en de grootte van de 7G 3 te extrapoleren conjugaten.</li>
	<li>Bereken het aantal peptiden per antilichaam door het verdelen van het verschil in MW tussen 7G 3 vervoegt en 7G 3 ongewijzigd door 1768.5 g/mol (MW van ChAcNLS).</li>
	<li>Nemen van digitale beelden van de gel Coomassie gebeitste en densitometrie analyses uit te voeren. Op dit punt, kan selectie van een kandidaat van het lood worden gebaseerd op de AC met het maximum aantal ChAcNLS moleculen die geen significante statistische soorten bevat.</li>
</ol>2. confocale microscopie voor intracellulaire accumulatie evaluatie
Opmerking: Het is belangrijk om te testen de selectiviteit van de cel van intracellulaire accumulatie van de peptide gemodificeerde mAbs voorafgaand aan de ontwikkeling van formuleringen met een lading van belang. Omdat Tat is ook aangetoond dat een neiging voor het niet-specifieke cel penetratie, loont eerste analyseren intracellulaire accumulatie en cel selectiviteit vóór onderneming dure ontwikkeling stappen met dure laadvermogens. Om deze reden moet Procedure 1 isotype specifieke irrelevant controle mAbs ook wijzigen. Voor de rest van het protocol zullen wij werken met ACs bewerkt met 10 ChAcNLS moleculen per antilichaam. Een schema met inbegrip van de belangrijkste stappen voor Procedures 2 en 3 is beschreven in Figuur 2.
Let op: Deze stap van het protocol omvat de behandeling en de manipulatie van paraformaldehyde. Volg de instructies van de fabrikant in bij de behandeling.
<ol><li>Doelcellen TF-1a met 200 nM van 7G 3-ChAcNLS met inbegrip van aangepast besturingselement mAbs te behandelen. Incubeer 5 x 106 antigeen-positieve cellen met de geconjugeerde gedurende 1 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Na 1 uur bovendrijvende vloeistof verwijderen en wassen met 1 mL 3 x in ijskoude PBS. Voeg nieuwe media toe en incubeer gedurende een uur bij 37 ° C.</li>
	<li>
Na de extra uur, bovendrijvende vloeistof verwijderen en spoelen 3 x in 1 mL ijskoud PBS. Voeg 0,5 mL PBS met 0,25% trypsine en ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) bij 37 ° C gedurende 3 tot 30 min. Opmerking: Tijdens de eerste piloot testen is het aanbevolen om niet trypsinize cellen om te bepalen van de verschillen in AC intracellulaire accumulatie. Dit protocol bevordert het gebruik van trypsine en we laten zien hoe dit verbetert de beoordeling van de efficiëntie van de intracellulaire accumulatie van verschillende AC kandidaten.<ol>
<li>Test de verschillende tijdstippen voor incubatie door visuele controle voor alle cellen worden losgemaakt. Daarnaast broeden cel aliquots met levensvatbaarheid kleuringsvloeistoffen en stroom cytometrische analyses als eerder beschreven 40uit te voeren.</li>
		<li>Neutraliseer trypsine met 1,5 mL van de cultuur van de cel RPMI 1640 media/10% foetale runderserum. Centrifugeer cellen bij 500 x g gedurende 5 min, bovendrijvende vloeistof verwijderen en 3 x wassen in 0,5 mL ijskoud PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fix cellen in 0,5 mL PBS, met 1% paraformaldehyde en 1% sucrose op ijs voor 30 min. Wash cellen 3 x in 0,5 mL ijskoud PBS en centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min. Permeabilize cellen in 0,5 mL PBS met 0,15% Triton X-100 voor 5 min op ijs. Cellen in ijskoude PBS wassen en centrifugeren herhalen.</li>
	<li>
Schorten cellen in 0,1 mL PBS met 2 μg/mL (of de fabrikant aanbevolen concentratie) van een anti-RattenUitrustingen (isotype specifieke) Fc secundaire polyclonal antilichaam geconjugeerd met AlexaFluor 647 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
	<ol>
<li>Centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min en wassen cellen 3 x in 0,5 mL ijskoud PBS. Schorten cellen in 0,5 mL PBS. PAUZE: Cellen kunnen worden opgeslagen in de koelkast. Opmerking: Het is essentieel om te selecteren van een secundair antilichaam dat de juiste isotype van de mAb van belang herkent. AF647 is gekozen vanwege haar ver-infrarood emissie, die niet interfereert met propidium jodide (PI) kleuring van de kern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PI tot een concentratie van 10 μg/mL tot de container met cellen toevoegen. Vervolgens monteer 1 x 105 cellen in glazen dia's met behulp van montage media en cover met een dekglaasje glas aan.</li>
	<li>Cellen met een Plan Apo 60 X olie onderdompeling doelstelling NA 1.42 op een omgekeerde laser scannen confocal microscoop onderzoeken. Detecteren PI fluorescentie met behulp van de 488 nm argon laser en de spectrale scannen prisma instellen voor 600-650 nm. Gebruik de 633 nm helium neon laser en de spectrale scannen prisma instellen voor 650-700 nm voor AF647 fluorescentie. Fluorescentie emissies opeenvolgend van PI en AF647 verzamelen. Opmerking: Gebruik dezelfde instelling gedurende de evaluatie en vergelijking van de cellen. Echter zul je instellingen voor trypsinized cellen ten opzichte van niet-trypsinized cellen aan te passen.</li>
	<li>Microscoop software gebruiken voor het verwerven van beelden. Het verzamelen van beelden met behulp van seriële horizontale optische secties van 1024 x 1024 pixels met 2 X lijn gemiddeld 0,5 μm regelmatig door de dikte van de gehele cel genomen. Presenteren de beelden als gestapelde z-projecties van vier opeenvolgende segmenten op de maximale fluorescentie-intensiteit.</li>
	<li>Cellen met Microscoop software analyseren. Het patroon van de cellulaire distributie van de geconjugeerde opnemen. Specifiek, evalueren of intracellulaire fluorescentie in het cytoplasma wordt gegroepeerd en in de buurt van de cel oppervlakte of diffuus en homogeen. Ook het evalueren van de intensiteit van de relatieve fluorescentie per cel.</li>
</ol>3. radiolabeled AC bouw en cellulaire fractionering voor de evaluatie van 64 Cu intracellulair levering efficiëntie
Let op: Procedures 3 en 4 betrekken de behandeling en de manipulatie van radioactiviteit. Voordat u deze stappen uitvoert, moeten de onderzoekers hebben goedgekeurd veiligheidstraining en protocollen uit hun eigen instelling straling veiligheidsinstantie erkend.
Opmerking: Voor Procedures 3 en 4 gebruiken we de mAb A14, die is specifiek voor de invasieve blaas kanker antigeen IL-5Rα41. Ook zijn alle experimenten tijdgevoelig te wijten aan de korte halfwaardetijd van 64Cu. In het algemeen, is het best niet wachten afgelopen 1 week in vitro experimenten uitvoeren en niet langer dan 72 h voor in vivo studies.
<ol><li>Schorten in een tube van 1,7 mL 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic zuur (NOTA-NHS) in DMSO tot een concentratie van 10 mM.</li>
	<li>Reageren 50-fold molaire overmaat van NOTA-NHS met A14 (2 mg grondstof) in 0,1 M natriumbicarbonaat bij pH 8.6 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een volume ≤ 0,5 mL (het eindvolume van NOTA-NHS mag niet meer dan 2% (v/v) van het totale volume).</li>
	<li>Zuiveren en buffer-uitwisseling NOTA-A14 met behulp van een apparaat van ultrafiltratie in PBS, pH 7,6 (zie stap 1.4).</li>
	<li>Voor latere bevestiging van ChAcNLS, stappen 1.2-1.6.</li>
	<li>NOTA-A14-ChAcNLS (250 μg batches) reageren met 100 megabecquerel (MBq) 64CuCl2 in 0,1 M natriumbicarbonaat, pH 5.5 gedurende 1 uur bij 37 ° C ≤ 0,1 mL. 64 Cu wordt geproduceerd op het cyclotron TR-PET bij de CIMS 42.</li>
	<li>Concentreren 64Cu-A14-ChAcNLS in PBS pH 7.4 met behulp van een apparaat van de ultrafiltratie tot de gewenste concentratie (zie stap 1.4).</li>
	<li>
Bepaal de radiolabeling efficiëntie van 64Cu-A14-ChAcNLS door onmiddellijke dunne-laag chromatografie (ITLC) met behulp van chromatografie strips en 0,1 M, pH 5.5 Natriumcitraat (ITLC eluens) als oplosmiddel. Toepassing 0,5 μL aliquoot deel van de oplossing van de reactie op de ITLC-strip. Het uitvoeren van een autoradiograph van de strip en het verkrijgen van een digitaal beeld.
	<ol>
<li>Densitometrie voor het verkrijgen van het aandeel van de gebonden en vrij van 64Cu uitvoeren Als gratis 64Cu inhoud > 5% is, terug te keren naar de vorige stap en extra reiniging uitvoeren.</li>
		<li>Daarnaast voeren SDS-pagina met Coomassie kleuring om aggregaties te evalueren. Een tweede SDS-pagina gevolgd door een autoradiograph van de gel om te bepalen als er radiolabeled statistische soorten uitvoeren</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Affiniteit bindend kwaliteit controlepost: Incubeer 64Cu-A14 geconjugeerde op toenemende concentraties (0-100 nM) in tweevoud met 1 x 106 target cellen per mL. Als u wilt schatten niet-specifieke binding, meng u dubbele monsters van 64Cu-A14 geconjugeerde met cellen in aanwezigheid van 100-fold molaire overmaat van labelloze A14.
	<ol>
<li>Na een incubatieperiode van 1 h op ijs, wassen van cellen en tellen van totale afhankelijke antilichaam monsters en totale niet-specifieke afhankelijke antilichaam monsters in een gamma-teller. Grafiek specifieke bindende (totale afhankelijke antilichaam - niet-specifieke gebonden antilichaam) tegen reactieve gratis 64Cu-A14 (nM) gebruikt in de test. Bepaal de dissociatieconstante (Kd) door middel van niet-lineaire regressie met behulp van grafische software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor 64Cu cellulaire accumulatie studies: behandelen van cellen met 100 nM van de 64Cu-geëtiketteerden A14 conjugaten voor 1 h, 6 h, en 24 uur bij 37 ° C33zoals hiervoor is beschreven. Aanvullende parameters zoals behandeling in aanwezigheid van ongewijzigde A14 voor takel IL-5Rα terreinen en bij 4 ° C voor het blokkeren van receptor-gemedieerde internalisering bevatten.</li>
	<li>Gedefinieerde destijds punten, als eerder beschreven in stap 2.3 - 2.3.2, Voeg 0,5 mL PBS met 0,25% trypsine en EDTA bij 37 ° C gevolgd door neutralisatie en wassen.</li>
	<li>Incubeer de cellen in het plasmamembraan lysis-buffermengsel met 1% NP-40, 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 buffer op ijs voor 10 min. Centrifugeer het plasmamembraan-lysed cellen bij 90 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Bovendrijvende vloeistof verwijderen en plaatsen in verse buis. Dit vertegenwoordigt de cytoplasmatische breuk. Wassen kernen 3 x in ijskoude PBS en wast op de cytoplasmatische breuk toe te voegen.</li>
	<li>Zorgen voor flesjes met de nucleaire en cytoplasmatische breuken zijn verzegeld. Plaats ze dan in een gamma counter gekalibreerd voor 64Cu om te converteren van raw graven naar MBq.</li>
	<li>
Bepalen de kwaliteit van de isolatie van de kernen door het uitvoeren van westelijke vlekkenanalyse voor triplex netvoeding, een beperkte nucleaire eiwit en Rab7, een overvloedige cytoplasmatische eiwit op de gehele cel lysate, nucleaire en cytoplasmatische breuken.
	<ol>
<li>Traktatie 5 x 106 cellen met 500 μL van radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer en het plasma membraan lysis-buffermengsel in stap 3,12 met 1%, 2% en 4% NP-40. Bovendien behandelen de geïsoleerde kernen in 500 μL van RIPA buffer te verkrijgen van geïsoleerde nucleaire eiwitten.</li>
		<li>Neerslag van eiwitten van de geïsoleerde nucleaire, cytoplasmatische en hele cel met behulp van 4 x Het monstervolume koude aceton voor 60 min bij-20 ° C. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 10 minuten en decanteren supernatant voorzichtig niet te verjagen van de eiwit-pellet. Voeg 100 μl van PBS te ontbinden van eiwitten.</li>
		<li>10 μg van eiwit in ieder putje van een 10% SDS-pagina gel laden. Voert elektroforese zoals beschreven in 1.7-1.9. Overdraagt Western Blot zoals eerder is beschreven in refeference 43.</li>
		<li>Het identificeren van de markeringen die het beste overeenkomen met een MW van ~ 40 kDa ladder. Snij het membraan doormidden op deze markering. Sonde van de vlek met de hogere MW eiwitten met Lamin A/C-specifieke antilichamen. Sonde van het membraan met de lagere MW eiwitten met de Rab 7-specifieke antilichamen. Westelijke vlek is een bekende techniek en niet beschreven in dit protocol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. PET Imaging evaluatie van de Tumor gericht op
Opmerking: De technieken van het implanteren van tumorcellen in muizen voor het genereren van heterotopic xenografts zijn bekend en de meeste laboratoria hebben in-house protocollen op maat gemaakt voor hun systeem van de tumor. Dit valt dus niet in het protocol. Het xenograft-model zullen nonobese diabetes/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (knik/SCID) muizen die IL-5Rα-positieve invasieve blaas tumoren HT-1376 en HT-B9. De cellen van de tumor van de IL-5Rα-positieve invasieve blaas omvatten > 66% van het totaal aantal cellen in de xenograft. Daarentegen waren slechts ~ 11% van de IL-5Rα-positieve HT-B9 cellen opgenomen in ontwikkelde xenografts41. Dus biedt dit model een uitstekend voorbeeld voor het evalueren van AC tumor gericht op in twee tumoren die te verwachten patiënt tumor heterogeniteit vertegenwoordigen.
<ol><li>In groepen met ≥ injecteert 4 (knik/SCID) muizen, 20-30 μg (6-9 MBq) 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS en 64Cu-A14 in de ader van de staart.</li>
	<li>Plaats op dezelfde dag een cilindrische phantom (24.8 mL) met 5 MBq van 64Cu omzetten van de radioactieve graven per seconde in de ingespoten dosis per gram weefsel (%ID/g).</li>
	<li>Wacht 48 uur en vervolgens anesthetize muizen door ze te plaatsen in een inductie-zaal met 1,5 L/min voor zuurstof stroom met 2% Isofluraan. Toepassing steriele ophthalmic zalf op muis ogen na inductie en voor plaatsing in de PET-scanner.</li>
	<li>Snel de muis naar een PET-scanner-tabel in de headfirst vatbaar positie met een neus voor Isofluraan overbrengen. Plaats de ademhaling en de rectale sondes en de monitor temperatuur en ademhaling tarief om ervoor te zorgen dat de fysiologische omstandigheden worden gehandhaafd tijdens het experiment zoals eerder beschreven 44.</li>
	<li>Start de PET data-acquisitie met behulp van een regelmatige bemonstering modus instelling en een energie-venster van 250-650 keV. Een 45 minuten durende statische scan per muis is meestal voldoende voor voldoende samenvallende gebeurtenissen voor wederopbouw en productie van PET-afbeeldingen van hoge kwaliteit.</li>
	<li>Na de scan 64Cu-AC, muis uit de scanner te verwijderen en plaats deze terug in de kooi. Toestaan voor de muis voldoende herstellen voordat u terugkeert naar het dier faciliteit.</li>
	<li>Gereconstrueerde beelden met behulp van 20 iteraties van een driedimensionale Maximum waarschijnlijkheid verwachting maximalisatie algoritme te verkrijgen.</li>
	<li>
Regio van belang (ROI) analyse van de tumor en visueel verifieerbare organen gebruik van de AMIDE-software uit te voeren.
	<ol>
<li>ROIs kwantitatieve %ID/g om gegevens te verkrijgen door handmatig met behulp van de instelling van het 3D Freehand gereedschap tekenen en zorgvuldig af te bakenen de tumoren of de aangrenzende bovenbeen spier. De tellingen per pixel in de ROI zal worden omgezet in %ID/g uit de vorige stap 4.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vergelijk 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS beelden voor tumor daarentegen en kwantitatieve ROI % ID/g en tumor-naar-achtergrond ratio's.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Belangrijkste doelstellingen van systemische levering van anti-kanker agenten zijn te verhogen van accumulatie op de site van de tumor, en opname binnen kankercellen, of ongewenste bijwerkingen in de gezonde weefsels. AC gericht levering van moleculaire payloads aan tumorcellen is een zeer veelbelovende benadering behandelen en tumoren op te sporen. Echter het gebrek aan doeltreffendheid veroorzaakt door beklemming van de endosome en beneden lysosomale aantasting van de stream blijft een belangrijke uitdaging. Terwijl di...

Antilichaam-geconjugeerde (ACs) zijn biofarmaceutica die zijn rijpen in een transformatieve klasse effectieve geneesmiddelen voor de verbetering van behandelingen van kanker en voor het opsporen van tumoren. Samengesteld uit een monoklonaal antilichaam (mAb) geconjugeerd met moleculaire payloads zoals radio-isotopen, kleine moleculen en biologische toxines, ACs kunnen leveren deze codering van de payloads tot kankercellen met uitgelezen doelwit antigeen affiniteit en specificiteit. Dus ACs hebben het potentieel om aanzienlijk verminderen van niet-specifieke toxiciteit en lading activiteit op de site van de tumor te verhogen. Therapeutisch, zijn ACs vervoer van cytotoxische kleine moleculen (meestal genoemd antilichaam-drug conjugaten) goedgekeurd voor de behandeling van patiënten met borstkanker en Hodgkin lymfoom die hebben gefaald conventionele behandelingen 1, 2. Daarnaast ACs vervoeren radioactieve isotopen (kortweg radioimmunoconjugaten) zijn ook in ontwikkeling. Een AC vervoeren een isotoop voor imaging is goedgekeurd voor het identificeren van prostaatkanker uitzaaiing 3. Met veel meer therapeutische ACs ingediend voor goedkeuring 4, is optimisme voor de toekomst van de ACs om kanker zorg 5hoog.
Echter bij het afleveren van chemotherapeutica of radio-isotopen, ACs ondervindt bij het effectief accumuleren deze codering van de payloads binnen doelcellen. Dit aspect aanzienlijk bijdraagt in veel gevallen in het onvermogen van de ACs om langdurige ziektevrije overleving of hoog contrast tumor imaging 6,7. In het algemeen, zodra ACs binden hun doel-antigeen zijn ze geïnternaliseerd via een proces dat bekend staat als receptor-gemedieerde endocytose. De ACs zijn vervolgens binnen de Endosomen in de val gelokt en verhandeld aan lysosomen voor afbraak en payload vrijgeven 8. Het intracellulaire mensenhandel proces vormt uitdagingen voor ACs aan het bereiken van een hoog laadvermogen specificiteit en werkzaamheid tegen kanker van de doelcellen. Bijvoorbeeld, veel antigenen zoals Her2 (doel voor therapeutische AC Trastuzumab-emtansine) tot 85% van de gebonden antilichamen in de eerste 30 min 9kunt recyclen. Bovendien, zodra aantasting optreedt, vrijgegeven chemotherapeutica en radio-isotopen kunnen worden actief geëxporteerd door de verhoogde expressie en/of activiteit van membraan geassocieerde vervoer eiwitten 10,11. Lysosoom afbraak belemmert ook de levering van nieuwe biologische payloads zoals therapeutische enzymen en oligonucleotides die kunnen worden gedeactiveerd, 12,,13. Kortom, is de kankercel zeer effectief bij intrekking van de nodige intracellulaire accumulatie van nettoladingen geleverd door ACs.
Dit protocol beschrijft hoe de uitvoering van het concept van het ACs-gekoppeld aan virus afkomstige peptides, speciaal voor endosome entrapment ontsnappen en lokaliseren naar de celkern. Met dergelijke verfijning te manipuleren cel hostsystemen, is het niet verwonderlijk dat de ontwikkeling van het virus afkomstige eiwitten en peptiden als potentiële biofarmaceutica lang heeft zijn ingebakken in therapeutisch onderzoek 14. Voor miljoenen jaren zijn virussen geëvolueerd om te verwerven van een uitzonderlijke collectie van eiwitten kunnen profiteren van normale fysiologische zoogdieren cel systemen om effectief gastheer cellen. Voor virussen die zijn geïnternaliseerd via receptor gemedieerde endocytose, zijn ze ook uitgedaagd met ontsnappen aan het lysosoom handel waar de aanval van een gelokaliseerde concentratie van proteasen kan problematisch zijn voor overleving. Een goed gekarakteriseerd virale afkomstige peptide gebruikt in drug levering voor het ontsnappen van endosome entrapment is het humaan immunodeficiëntie virus transactivator van transcriptie (Tat) eiwit 15. Tat vermag endosome entrapment ontsnappen door het aftasten van lage-pH op welk punt eiwit conformationele wijzigingen optreden waardoor Tat als u wilt invoegen zich in en verstoren de membraan endosomal 16. Dit resulteert in Tat-nettolading geconjugeerde kundig voor vlaag van het cytoplasma. Het tweede element van de virale manipulatie gerelateerde bij dit protocol is de aanpak gebruikt voor therapeutische genen en drugs naar de kern 17. Virussen zijn geëvolueerd om te manipuleren met succes host cel machines voor vordert langs het kernmembraan door door de nucleaire porie complexe (NPC). Cellulaire macromoleculen bevatten (of binding aan eiwitten die bevatten) nucleaire localisatie signalen (NLSs) nodig voor bindende tot nucleaire transport eiwitten (bv karyopherins α en β), waarmee de vereiste bewegingen door de NPC. Virussen hebben eiwitten bevatten NLS-sequenties die hen voorzien van de mogelijkheid om gebruik te maken van host cel vervoer eiwitten voor pendelen in de nucleus 18ontwikkeld.
Talrijke ACs eerder matiemaatschappij met Tat - en NLS-afgeleide peptiden en getest voor hun vermogen om te accumuleren binnen kankercellen en voor het targeten van tumoren 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabel 1). Studies leveren van cytotoxische payloads hebben aangetoond dat ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden kunnen aanzienlijk verhoging van cellulaire accumulatie, cytotoxiciteit en tumor doden over ongewijzigde ACs 22,26. Een gemeenschappelijk kenmerk voor deze nieuwe klasse van het Keuzeaxioma is hun bouw. Doorgaans bevatten peptiden een terminal cysteïne bieden een gratis sulfaatzuurstof groep. MAbs zijn eerste reageerde met een noncleavable bifunctionele crosslinker met N- hydroxysuccinimide (NHS) en maleimide groepen op tegenovergestelde uiteinden. De NHS esters reageren met primaire amines op de mAb aan amide-bindingen. De gereageerde mAb met gratis maleimide groepen is het vervolgens reageerde met de sulfaatzuurstof groepen op de peptiden te vormen van een thio-ester-binding en dus het koppelen van de peptide en mAb. Hoewel homobifunctional crosslinkers geweest gebruikte 28, heterobifunctional crosslinker meer in het algemeen worden gebruikt in de bouw van virus-afgeleide peptide-ACs 22,23,26, 31,-32. Dit protocol gebruikt met name de crosslinker-sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat (sulfo-SMCC) voor zijn gebruiksgemak en omdat het wordt gebruikt in de goedgekeurde antilichaam-drug geconjugeerde Trastuzumab-emtansine en in veel virus-afgeleide peptide-ACs 8,22,23,26,31,32. Polyacrylamide-gelelektroforese (SDS-pagina) voor natrium dodecyl sulfaat is de primaire methode voor het aanvankelijk bepaling vervoeging rendement en semi-quantifying hetaantal peptiden per mAb. Confocale microscopie met behulp van een fluorescently-gelabeld secundair antilichaam specifiek voor de mAb is meestal de methode voor het aanvankelijk uitrekenen intracellulaire distributie eigenschappen van peptide gemodificeerde ACs virus-afgeleide. Tot nu toe zijn de radio-isotopen de primaire payloads geleverd door virus afkomstige peptide gemodificeerde ACs. Radio-isotopen zijn voordelig omdat radioactiviteit in cellen wordt gemakkelijk gekwantificeerd door gamma tellen. Daarnaast ACs die zijn vertaald in muismodellen van menselijke kanker onderzoekers voorzien de mogelijkheid om de tumor gericht op met behulp van moleculaire beeldvorming modaliteiten zoals single photon emission berekende tomografie en positron emissie tomografie (PET) 23 , 32 , 33. In het algemeen, de constructie en validatie testmethoden voornamelijk gebruikt door onderzoekers bieden een zeer goede beoordeling van ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden tijdens het aanvankelijke ontwikkelingsstadium effectief invoeren en leveren de lading binnen doelcellen en voor doel tumoren.
Tat - en NLS-gemodificeerde ACs hebben verlichte sleutelgebieden voor verdere verbetering van de nettolading levering binnen cellen van kanker en tumoren. Met betrekking tot de NLS gemodificeerde ACs kunnen de efficiëntie van intracellulaire accumulatie bescheiden 23,31,34. Inefficiënte intracellulaire accumulatie wordt veroorzaakt door voortdurende endosomal entrapment. In vivo tumor targeting kan ook worden verminderd met beide Tat en NLS-gemodificeerde ACs. De actieve sequenties van Tat en NLS bevatten verschillende positief geladen residuen. Wanneer gekoppeld aan mAbs, kunnen de algemene kationische last aanzienlijk verhoogde 35. Dientengevolge hebben de Tat - en NLS-gemodificeerde ACs verhoogd van opname in de gezonde weefsels en snelle bloed klaring verhoogd.
Onze fractie ontwikkeld een samengestelde stof bestaande uit cholzuur en gekoppeld aan NLS (ChAcNLS; Figuur 1). ChAcNLS gemodificeerde ACs kunnen verhogen van intracellulaire accumulatie van radio-isotopen geleverde en tumor gericht op t.o.v. NLS gemodificeerde en traditionele ACs 33,34te verbeteren. Het mechanisme is erachter cholzuur en is geïnspireerd door de mogelijkheid van select nonenveloped virussen die niet op membraan fusion vertrouwen gebruiken cholzuur en om te activeren endosome ontsnappen door de vorming van ceramide. Varkens darmen virus werft bijvoorbeeld cholzuur en dat activeert sphingomyelinase, die de hydrolyse van sphingomyelinase in ceramide 36,37,38katalyseert. Dit endosomal membraan destabiliseert en zorgt voor virus ontsnappen. Cholzuur en is dus een ander virus afkomstige onderdeel dat perfect past bij NLS.
Als dit veld beweegt naar voren en toekomstige optreden vooruitgang in lading levering per ACs bewerkt met virus afkomstige peptides, is het een geschikt moment om visuele demonstraties van hun biochemische en functionele kenmerken tijdens de initiële ontwikkeling. Hier beschrijven we onze protocol voor de initiële beoordeling van virus-afgeleide peptide gemodificeerde ACs voor de efficiënte maar eenvoudige bepaling van intracellulaire accumulatie en tumor gericht op tijdens de vroege fase ontwikkeling. Als modelsystemen voorbeeld gebruiken we de verkrijgbare mAbs 7G 3 en de A14. Procedure 1 beschrijft het gebruik van SDS-pagina als een methode die het mogelijk voor besluiten van de ' go/no go' voor gebouwd ACs maakt. Procedure 2 beschrijft een methode met behulp van trypsinebehandeling waardoor verbeterde visualisatie van AC intracellulaire verspreiding en accumulatie. Procedure 3 beschrijft een methode voor verbeterde intracellulaire fractionering nauwkeurig bepalen nucleaire localisatie. In deze procedure we gebruik maken van de nettolading 64Cu (t-1/2 = 12,7 h) want het is kwetsbaar voor cellulaire efflux en een positron emitter 10is. Dus, de Procedure 4 beschrijft in vivo tumor gericht op karakterisering door PET imaging te visualiseren van opname van de tumor ten opzichte van de achtergrond (dat wil zeggen nontarget gezonde weefsels) en te bepalen of het voorbeeld AC kan specifiek en effectief doel de tumoren. Deze methoden zijn voldoende voor onderzoekers ontwikkelen ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden te identificeren van kandidaten voor verdere vooruitgang.

<table><tbody><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22122</td><td>Er zijn veel homo- en hetero-bifunctionele maleïmide crosslinkers om uit te kiezen.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC505096</td><td>Er zijn verpakkingsgrootten van 8, 24 en 96. Kies volgens uw behoeften.</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards</td><td>BioRad</td><td>1610375EDU</td><td>Meerkleurige recombinante eiwitten van 10 - 250 kDa.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), fenol rood</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td>100 of 500 mL volumes om uit te kiezen.</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 647-conjugaat</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21235</td><td>Aanbevolen 1 - 10 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>NOTA-NHS</td><td>CheMatech</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>Lamin A/C antilichaam (N-18)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6215</td><td></td></tr><tr><td>Rab7 antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-376362</td><td></td></tr><tr><td>A14 mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>555902</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>TF-1a cellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-2003</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>ATCC</td><td>ATCC 30-2001</td><td></td></tr><tr><td>RIPA lysis en extractie buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>AMIDE medische beeldvormingssoftware</td><td>beschikbaar op amide.sourceforge.net</td><td></td><td>Volledig gratis downloaden</td></tr><tr><td>FluoView FV1000 Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoview Software</td><td>Olympus</td><td></td><td>www.olympus-lifescience.com</td></tr><tr><td>ITLC strips</td><td>Biodex</td><td>150-771</td><td></td></tr></tbody></table>

eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de tumor gericht op

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antilichaam-geconjugeerde (ACs) bewerkt met virus afkomstige peptiden zijn een potentieel krachtig klasse van tumor cel levering agenten voor moleculaire laadvermogens gebruikt in de behandeling van kanker en imaging als gevolg van verhoogde cellulaire accumulatie over huidige ACs. Tijdens de vroege AC in vitro zijn ontwikkeling, fluorescentie technieken en radioimmunoanalyses voldoende voor het bepalen van de intracellulaire lokalisatie, accumulatie efficiëntie en target cel specificiteit. Op dit moment is er geen consensus over gestandaardiseerde methoden voor het voorbereiden van cellen voor de evaluatie van AC intracellulaire accumulatie en lokalisatie. De eerste testen van ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden is essentieel vooral als er meerdere kandidaten zijn aangelegd. Bepalen van intracellulaire accumulatie door fluorescentie kan worden beïnvloed door het signaal van de achtergrond van de ACs aan het celoppervlak en bemoeilijken de interpretatie van accumulatie. Voor radioimmunoanalyses, meestal behandelde cellen zijn gespreide en de radioactiviteit in verschillende cel compartimenten gemeten. Echter lysis van de cel varieert van cel naar cel en vaak nucleaire en cytoplasmatische compartimenten zijn niet afdoende geïsoleerd. Deze kan misleidende gegevens over de eigenschappen van de levering van de lading produceren. De intraveneuze injectie van radiolabeled virus afkomstige peptide gemodificeerde ACs in tumor rekening houdend met muizen gevolgd door radionuclide imaging is een krachtige methode voor het bepalen van de tumor gericht en lading levering eigenschappen in de in-vivo -fase van ontwikkeling. Echter dit is een relatief recente vooruitgang en enkele groepen virus afkomstige peptide gemodificeerde ACs op deze manier hebben geëvalueerd. We beschrijven de verwerking van behandelde cellen om nauwkeuriger virus afkomstige peptide gemodificeerde AC accumulatie bij het gebruik van de confocal microscopie en radioimmunoanalyses. Specifiek, een methode voor trypsinizing cellen verwijderen celoppervlak gebonden ACs. We bieden ook een methode voor het verbeteren van de cellulaire fractionering. Ten slotte, dit protocol voorziet een in vivo -methode met behulp van positron emissie tomografie (PET) evaluatie van de eerste tumor gericht op onroerend goed in tumor-dragende muizen. We gebruiken de isotoop 64Cu (t-1/2 = 12,7 h) als de payload van een voorbeeld in dit protocol.

Voor Procedure 1, de constructie van 7G 3 bewerkt met ChAcNLS gebruik van sulfo-SMCC als een crosslinker zeer betrouwbaar is. Meestal, wanneer geladen op een 12% gel en geanalyseerd door SDS-PAGE, dit resulteert in een te onderscheiden stapsgewijze verhoging MW evenredig met verhoging van sulfo-SMCC-tot - 7G 3 ratio's gebruikt en zorgt voor de zware en lichte kettingen worden individueel beoordeeld voor ChAcNLS vervoeging (Figuur 3). 7G 3 reageerde op 10-, 20 - 25- en 50-...

Viral afkomstige peptiden gekoppeld aan antilichaam-geconjugeerde (ACs) is een aanpak die wint dynamiek als gevolg van het potentieel van het leveren van moleculaire payloads met verhoogde tumor cel accumulatie. Gebruik makend van gemeenschappelijke methoden voor evaluatie van peptide conjugatie, AC en lading intracellulaire accumulatie en tumor gericht op, helpt dit protocol onderzoekers tijdens de cruciale eerste ontwikkelingsfasen.

Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Het algemene doel van deze procedures is om de specificiteit en effectiviteit van antilichaamconjugaten te evalueren voor het accumuleren in doelcellen en tumoren tijdens de eerste ontwikkelingsfasen, zodat ze uiteindelijk in de kliniek kunnen worden gebruikt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de antwoorden van de conjugaatvelden, zoals de efficiëntie van nucleaire lokalisatie en de algehele intercellulaire accumulatie. Een voordeel van deze techniek is dat onderzoekers via PET-beeldvorming de effectiviteit en selectiviteit van kandidaat-antilichaamconjugaten kunnen beoordelen.De implicaties van deze technieken strekken zich uit naar therapie en diagnose van kanker, omdat ineffectieve tumorcelaccumulatie een belangrijke beperking is bij deze toepassingen voor antilichaamconjugaten. Na het synthetiseren van een colicaanzuur nucleaire lokalisatiesequentie antilichaamconjugaat volgens het tekstprotocol, behandel doel-TF1A-cellen met 200 nanomolair 7G3 colicaanzuur MLS antilichaamconjugaat. Bevat cellen behandeld met gemodificeerde controle-monoklonale antilichamen.Incubeer vijf keer 10 tot de zesde antigeen-positieve cellen met de conjugaten bij

initial-evaluation-antibody-conjugates-modified-with-viral-derived

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Bron: Heidbuechel, J. P., et al. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019).Deze video demonstreert een celgebaseerde assay om de doelspecifieke immunomodulerende activiteit van een viraal gecodeerde bispecifieke T-cel-engager (BTE) te evalueren. De BTE koppelt tumorcellen die een doelreceptor tot expressie brengen aan T-cellen, waardoor tumorlyse en enzymvrijgave worden getriggerd. Een colorimetrische uitlezing, gebaseerd op...

Evaluatie van de immunomodulerende activiteit van een viraal gecodeerde bispecifieke T-cel-engager

This video demonstrates the process of assessing the intracellular distribution of virus-derived peptide-modified antibody conjugates using confocal microscopy. The viral-derived nuclear localization sequence directs antibody-conjugates within the cytoplasm, confirmed through immunostaining and fluorescence measurement.

Evaluating the Intracellular Distribution of Virus-Derived Peptide-Modified Antibody Conjugates

Hier presenteren de auteurs een eenvoudig en efficiënt protocol om een lineair antigeen epitoop te definiëren met behulp van een gezuiverd monoklonaal antilichaam en peptide scanning door dot-blot hybridisatie. De geïdentificeerde epitoop kan vervolgens worden gebruikt in therapeutische en diagnostische toepassingen.

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

We hebben de Eiwitmantel proteïne van hepatitis E virus ontworpen als een theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP assembleert zelf in een stabiele icosahedrale kooi in mucosale levering. Hier beschrijven we de wijziging van de HEVNPs voor tumor gericht op door muteert residuen oppervlak-blootgesteld aan cysteines, die conjugaat van synthetische liganden die specifiek tumorcellen binden.

Oppervlakte Functionalization van Hepatitis E Virus nanodeeltjes met behulp van methoden voor chemische Woordherkomst en-opbouw

Integratie van een cyclopropeen derivaat van lysine in antilichamen kan de sitespecifieke, snelle en efficiënte koppeling van tetrazine-bevattende moleculen voor het genereren van geconjugeerde antilichaam-drug.

Genetische codering van een niet-canonieke aminozuur voor de generatie van antilichaam-Drug conjugaten door een snel Bioorthogonal reactie

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde workflow voor de generatie en ex vivo karakterisering van oncolytische virussen voor expressie van immunomodulators, met behulp van mazelen virussen bispecifieke T cel engagers codering als een voorbeeld. Toepassing en aanpassing aan andere vector platforms en transgenen zal de ontwikkeling van nieuwe immunovirotherapeutics voor klinische vertaling versnellen.

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

In dit protocol beschrijven we de synthese van PODS, een phenyoxadiazolyl methyl-sulfon gebaseerde reagens voor de site-selectieve bevestiging van cargos aan de thiolen van biomoleculen, met name antilichamen. Daarnaast beschrijven we de synthese en de karakterisering van een Peul-bevattende bifunctionele complexvormer en zijn geconjugeerde aan een model antilichaam.

Synthese en Bioconjugation van Thiol-reactieve reagentia voor de oprichting van Site-selectief bewerkt Immunoconjugates

De in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL)-methode kan worden gebruikt om in vivo biodistributie van antilichamen en antilichaam conjugaten voor oncologische doeleinden in levende organismen te onderzoeken met behulp van een combinatie van in vivo tumor targeting en ex vivo-immunokleuring Methoden.

In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek

Hier presenteren we een protocol om de in vivo lokalisatie van antilichamen in muizen tumor xenograft modellen te bestuderen.

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

We beschrijven een protocol voor de chemische conjugatie van het modelantigeen ovalbumine naar een endocytosereceptorspecifiek antilichaam voor in vivo dendritische celtargeting. Het protocol omvat zuivering van het antilichaam, chemische conjugatie van het antigeen, evenals zuivering van het conjugaat en de verificatie van efficiënte conjugatie.

Chemische conjugatie van een gezuiverd DEC-205-gericht antilichaam met eiwit over de volledige lengte voor het richten van dendritische cellen van muizen in vitro en in vivo

Leer hoe antilichaam-conjugaten worden geëvalueerd op specificiteit en effectiviteit voor tumorgerichte accumulatie met behulp van PET-beeldvorming en celbiologische technieken. Deze methode verbetert de ontwikkeling van gerichte kankertherapieën.

Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op (Video) | JoVE Journal

Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op

Meer video's verkennen