Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op

Het algemene doel van deze procedures is om de specificiteit en effectiviteit van antilichaamconjugaten te evalueren voor het accumuleren in doelcellen en tumoren tijdens de eerste ontwikkelingsfasen, zodat ze uiteindelijk in de kliniek kunnen worden gebruikt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de antwoorden van de conjugaatvelden, zoals de efficiëntie van nucleaire lokalisatie en de algehele intercellulaire accumulatie. Een voordeel van deze techniek is dat onderzoekers via PET-beeldvorming de effectiviteit en selectiviteit van kandidaat-antilichaamconjugaten kunnen beoordelen.

De implicaties van deze technieken strekken zich uit naar therapie en diagnose van kanker, omdat ineffectieve tumorcelaccumulatie een belangrijke beperking is bij deze toepassingen voor antilichaamconjugaten. Na het synthetiseren van een colicaanzuur nucleaire lokalisatiesequentie antilichaamconjugaat volgens het tekstprotocol, behandel doel-TF1A-cellen met 200 nanomolair 7G3 colicaanzuur MLS antilichaamconjugaat. Bevat cellen behandeld met gemodificeerde controle-monoklonale antilichamen.

Incubeer vijf keer 10 tot de zesde antigeen-positieve cellen met de conjugaten bij 37 graden Celsius gedurende één uur. Verwijder vervolgens het supernatant en gebruik één milliliter ijskoud PBS om de cellen drie keer te wassen. Voeg vers medium toe en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius nog een uur.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter PBS toe, dat 0,25% trypsine en EDTA bevat, en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende maximaal 30 minuten. Gebruik vervolgens 1,5 milliliter RPMI1640 medium met 10%FBS om de trypsine te neutraliseren. Centrifugeer de cellen bij 500 keer G gedurende vijf minuten, verwijder het supernatant en gebruik 0,5 milliliter ijskoud PBS om de cellen opnieuw drie keer te wassen.

Voeg 0,5 milliliter 1%PFA en 1% sucrose en PBS toe aan de cellen en plaats ze gedurende 30 minuten op ijs om ze te fixeren. Gebruik vervolgens 0,5 milliliter ijskoud PBS om de cellen drie keer te wassen en centrifugeer de monsters bij 250 keer G gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens 0,15% Triton X-100 en PBS toe aan de cellen en maak ze permeabel op ijs gedurende vijf minuten.

Was vervolgens de cellen met ijskoud PBS en herhaal de centrifugatie. Suspendeer de cellen in 0,1 milliliter PBS, dat twee microgram per milliliter van een antispiegel FC secundair polyklonaal antilichaam bevat dat geconjugeerd is met Alexa Fluor 647, en incubeer de monsters in het donker op kamertemperatuur gedurende één uur. Centrifugeer de cellen bij 250 keer G gedurende vijf minuten en gebruik 0,5 milliliter ijskoud PBS om de cellen opnieuw drie keer te wassen.

Suspendeer vervolgens de cellen in 0,5 milliliter PBS. Voeg 10 microgram per milliliter propidiumjodide toe aan de cellen. Gebruik vervolgens montagemedium om een keer 10 tot de vijfde cellen op glasplaten te monteren voordat u het monster bedekt met een glazen deksel.

Bekijk de cellen met een Plan APO 60X olie-immersieobjectief, numerieke opening 1,42, op een omgekeerde laser-scanning confocale microscoop. Detecteer PI-fluorescentie met behulp van de 488-nanometer argonlaser en het spectraal-scanning prisma ingesteld op 600 tot 650 nanometer. Voor AF 647-fluorescentie, gebruik de 633-nanometer helium-neonlaser en het spectraal-scanning prisma ingesteld op 650 tot 700 nanometer.

Verzamel afbeeldingen van PI en AF 647 sequentieel, 1024 bij 1024 pixels, met 2X lijngemiddelden, genomen met intervallen van 0,5 micrometer door de volledige cellikkte. Presenteer afbeeldingen als Z-projecties. Om de cellen te analyseren, evalueer en noteer of intracellulaire fluorescentie in het cytoplasma gegroepeerd is en nabij het celoppervlak of diffuus en homogeen.

Evalueer ook de relatieve fluorescentie-intensiteit per cel. Na het bereiden en concentreren van radioactief gelabeld colicaanzuur NLS antilichaamconjugaat volgens het tekstprotocol, bepaal de radiolabeling-efficiëntie door 0,5 microliter van 0,1-molair PH5,5 natriumcitraat of ITLC-eluïent op een ITLC-strip aan te brengen. Vorm een autordiograaf van de strip en verkrijg een digitaal beeld.

Voer densitometrie uit om de verhouding van gebonden en vrij koper-64 te verkrijgen. Als het gehalte aan vrij koper-64 groter is dan 5%concentreer het monster verder. Voor koper-64 cellulaire accumulatiestudies, behandel cellen met 100 nanomolair koper-64-gelabelde A14-conjugaten bij 37 graden Celsius gedurende één, zes en 24 uur, zoals eerder beschreven.

Behandel de cellen met ongewijzigde A14 om IL5R-alphacyten te blokkeren en bij vier graden Celsius om receptor-gemedieerde internalisatie te blokkeren. Na het wassen van de cellen en incuberen met vers medium, zoals eerder in deze video is aangetoond, voeg 0,5 milliliter PBS toe dat 0,25% trypsine en EDTA bevat, en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Voeg vervolgens, na het neutraliseren en wassen van de cellen zoals voorheen, plasmamembraan-lysebuffer toe aan de cellen en incubeer ze gedurende 10 minuten op ijs.

Centrifugeer de plasmamembraan-lysde cellen bij 90 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en breng het over naar een verse buis. Dit vertegenwoordigt de cytoplasmatische fractie.

Gebruik vervolgens ijskoud PBS om de kernen drie keer te wassen en voeg de wasbeurten toe aan de cytoplasmatische fractie. Zorg ervoor dat de flesjes met de nucleaire en cytoplasmatische fracties zijn afgesloten en plaats ze vervolgens in een gammateller gekalibreerd voor koper-64 om de ruwe tellingen om te zetten in megabecaril. Bepaal de kwaliteit van de nucleaire isolatie door Western-Blot-analyse uit te voeren voor lamin AC, een beperkt nucleair eiwit;en Rab-7, een overvloedig cytoplasmatisch eiwit, op groothandelslysaat, nucleair en cytoplasmatisch fracties.

Behandel vijf keer