Analyse van de beëindiging van de transcriptie gebruik van BrUTP-streng-specifieke transcriptie Run-on (TRO) Approach
12 maart 2017
We beschrijven een basisexperimentele benadering voor analyse van de terminatie van transcriptie door RNA-polymerase II in vivo met behulp van BrUTP door de strengspecifieke transcriptie run-on (TRO) benadering in knoppende gist. Dit protocol kan worden uitgebreid om de transcriptieterminatie door andere RNA-polymerasen te bestuderen, zowel in gist als in hogere eukaryoten.
Het algemene doel van deze procedure is om de terminatie van transcriptie door RNA-polymerase te bestuderen bij knopvormende gist onder in vivo-condities door de strengspecifieke transcriptierun-on-aanpak. Deze methode helpt bij het beantwoorden van de sleutelvraag of de transcriptioneel actieve polymerase die wordt gedetecteerd voorbij het drie-prime-uiteinde van het gen degene is die is geïnitieerd vanuit het promotorgebied. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat deze een MRNA-transcribeerbare polymerase kan onderscheiden van een overal transcriberende polymerase die transcripties heeft geïnitieerd en zich op het drie-prime-uiteinde van het gen zal bevinden.
Deze techniek kan worden uitgebreid om de terminatie van transcriptie door andere RNA-polymerasen en gist te bestuderen vanwege de geconserveerde aard van terminatie door verschillende polymerasen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de precieze rol van terminatiefactoren in de gisttranscriptiecyclus, kan deze ook worden uitgebreid om terminatie in hogere eukaryoten te bestuderen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen met celpermeabilisatie en transcriptierun-on-stops, omdat ze zorgvuldige uitvoering vereisen, en beginnende transcripten kunnen ook moeilijk te zuiveren zijn.
We hadden het idee voor deze methode voor het eerst vanuit de GRO-seek-aanpak die een genoombreed momentopname geeft van de positie van transcriptioneel actieve polymerasen op een strengspecifieke manier. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, aangezien de transcriptierun en RNA-zuivering moeilijk uit te voeren zijn vanwege de lage hoeveelheid en onstabiele aard van de beginnende transcripten. Voordat u begint met de transcriptierun-on-reactie, laat u exponentieel groeiende gistcellen groeien, oogsten en permeabiliseren om een gepermeabiliseerd cellenpallet te verkrijgen.
Om de reactie te starten, voegt u 150 microliter transcriptierun-on-buffer toe aan het gepermeabiliseerde cellenpalette. Gebruik een afgeknotte P-200 tip om voorzichtig te mengen door op en neer te pipetten. Plaats het monster op ijs.
Nadat alle monsters zijn opgeschort in de transcriptierun-on-buffer, incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij 30 graden Celsius in een waterbad. Stop de reactie door 500 microliter koud klaar-voor-gebruik RNA-isolatiereagens toe te voegen aan elk monster. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Begin de RNA-extractieprocedure door 200 microliter zuurgewassen glazen kralen toe te voegen aan elke cellensuspensie en krachtig te schudden in een vortexmixer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Gebruik na 20 minuten een hete 22 gauge naald om de bodem van elke microcentrifugebuis te doorboren en plaats de buis op de bovenkant van een 15 milliliter steriele conische buis. Centrifugeer gedurende één minuut bij 300 keer G bij vier graden Celsius en breng het cellysaat over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.
Voeg 500 microliter koud RNA-isolatiereagens en 200 microliter chloroform toe aan het cellysaat. Meng de inhoud op de vortexmixer en centrifugeer vervolgens gedurende 20 minuten bij 16.168 keer G bij vier graden Celsius. Breng de bovenste waterige fase over in een nieuwe microcentrifugebuis.
Voeg een gelijk volume koud fenol chloroform isoamyl alcohol toe. Schud krachtig op de vortexmixer en centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten bij 16.168 keer G bij vier graden Celsius. Breng de bovenste waterige fase die RNA bevat over in een nieuwe microcentrifugebuis.
Voeg een gelijk volume koud fenol chloroform isoamyl alcohol toe, schudt en centrifugeer opnieuw. Voeg aan de uiteindelijke RNA-bevattende waterige fase een geschikt volume van een vijf molaar natriumchloride stock toe om een uiteindelijke concentratie van 0,3 molaar te verkrijgen. Voeg drie keer het volume koud ethanol toe om de RNA te precipiteren.
Incubeer gedurende één uur, of overnacht, bij 20 graden Celsius. Wanneer de RNA-precipitatie klaar is, centrifugeer gedurende 20 minuten bij 16.168 keer G bij vier graden Celsius. Verwijder de supernatant en schud het RNA-pallet opnieuw op in 100 microliter DEPC-water.
Gebruik een RNA-isolatiekit om het RNA te scheiden van de niet-geïncorporeerde bromouridine trifosfaat nucleotiden en elueer het RNA van de kolom met 100 microliter RNAse-vrij water. Incubeer het RNA in een 65 graden Celsius waterbad gedurende vijf minuten. Breng het vervolgens over naar ijs voor minimaal twee minuten.
Begin deze procedure door de anti-bromo DU-kralen voor te bereiden terwijl het RNA wordt geprecipiteerd. Voeg voor elk monster 500 microliter 0,25 X natriumzoutwosfaat EDTA bindingsbuffer toe aan 25 microliter bezonken kralen. Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 200 keer G bij vier graden Celsius en verwijder de supernatant.
Was de kralen drie keer met de bindingsbuffer. Nadat de supernatant van de derde wassing is verwijderd, voegt u 500 microliter blokkeringsbuffer toe aan de kralen en schudt u zachtjes gedurende één tot twee uur bij vier graden Celsius op een platformschudder. Was de kralen nog twee keer met 500 microliter bindingsbuffer.
Verwijder de supernatant van de tweede wassing en voeg 400 microliter bindingsbuffer toe aan de kralen. Breng 100 microliter RNA direct over naar de kralen. Incubeer met zachtjes schudden gedurende één tot twee uur bij vier graden Celsius op een platformschudder.
Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 200 keer G bij vier graden Celsius en verwijder vervolgens de supernatant. Voeg vervolgens 500 microliter bindingsbuffer toe aan de kralen. Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 200 keer G bij vier graden Celsius en verwijder de supernatant.
Was de kralen op deze manier sequentieel met bindingsbuffer, lage zoutbuffer, hoge zoutbuffer en twee keer met TET-buffer. Om het bromouridine trifosfaat gelabelde RNA van de kralen te elueren, voegt u 150 microliter elutiebuffer toe en incubeert u gedurende vier minuten bij 42 graden Celsius in een waterbad. Spin kort neer en verzamel de supernatant.
Elueer op deze manier sequentieel twee keer met 150 microliter en eenmaal met 200 microliter elutiebuffer. Er moet ongeve
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het analyseren van de beëindiging van transcriptie door RNA-polymerase II in vivo met behulp van BrUTP en de strengspecifieke transcriptie-run-on (TRO) benadering in knopvormende gist. Het protocol kan ook worden aangepast om transcriptiebeëindiging door andere RNA-polymerasen in zowel gist als hogere eukaryoten te bestuderen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Transcriptionele regulatie
- RNA-polymerase-activiteit
- Moleculair biologie van gist
Achtergrond
- Transcriptiebeëindiging is een kritiek proces in genexpressie.
- De strengspecifieke transcriptie-run-on benadering maakt de analyse van transcriptiedynamiek mogelijk.
- Deze methode kan onderscheid maken tussen verschillende soorten RNA-polymerasen.
- Begrip van beëindigingsfactoren is essentieel voor het verduidelijken van de transcriptiecyclus in gist.
Doel van de studie
- Om de beëindiging van transcriptie door RNA-polymerase II in vivo te onderzoeken.
- Om te bepalen of transcriptioneel actieve polymerasen worden geïnitieerd vanuit de promotorregio.
- Om de bevindingen uit te breiden naar andere RNA-polymerasen in verschillende organismen.
Gebruikte methoden
- Strengspecifieke transcriptie-run-on (TRO) benadering.
- Gebruik van BrUTP voor het labelen van beginnende RNA-transcripten.
- Celpermeabilisatietechnieken voor effectieve transcriptieanalyse.
- Zuiveringsmethoden voor beginnende transcripten.
Belangrijkste resultaten
- De methode kan succesvol onderscheid maken tussen mRNA-transcribeerende polymerasen en overvloedig transcriberende polymerasen.
- Inzichten in de rol van beëindigingsfactoren in de transcriptiecyclus werden verkregen.
- De benadering kan worden aangepast voor gebruik in hogere eukaryoten.
- Uitdagingen in uitvoering, zoals celpermeabilisatie, werden geïdentificeerd voor nieuwe gebruikers.
Conclusies
- De strengspecifieke TRO-benadering is effectief voor het bestuderen van transcriptiebeëindiging.
- Begrip van transcriptiebeëindiging kan inzichten geven in genregulatie.
- Deze methode heeft brede toepassingen over verschillende soorten heen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables precise detection of transcription termination defects in vivo, addressing a key challenge in target validation where distinguishing true promoter-initiated readthrough from pervasive transcription is essential for mechanistic de-risking. By providing strand-specific, quantitative readouts of polymerase activity beyond terminator regions, it supports predictive confidence in early discovery stages focused on RNA polymerase II and termination factor biology. The approach offers translational continuity from yeast models to higher eukaryotes, facilitating cross-species target validation and preclinical pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining whether observed transcription readthrough stems from promoter-initiated polymerase activity rather than non-specific initiation.
- Operational Value: Enables functional validation of termination factors as drug targets by isolating their specific role in the transcription cycle.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing mechanistic evidence that reduces ambiguity in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces strand-specific nascent RNA signals that serve as quantitative readouts for screening compounds or genetic perturbations affecting termination.
- Operational Value: Generates reproducible, affinity-purified BrUTP-labeled RNA suitable for downstream qPCR or sequencing applications in assay development pipelines.
- Scalability: The protocol’s reliance on standardized permeabilization and purification steps enables adaptation to multi-well formats for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects termination mechanism studies in yeast to conserved pathways in higher eukaryotes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by validating target function across model systems before moving to mammalian validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes are due to specific termination factor loss versus pervasive transcriptional noise, improving target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification, particularly when termination mechanisms are under investigation, and supports handoff to preclinical teams via standardized, quantifiable outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by distinguishing promoter-driven transcription from background noise, aiding in pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Delivers assay-ready, strand-specific nascent RNA that enables reliable comparison of genetic or pharmacological conditions affecting termination efficiency.
- Analytics: Provides amplifiable cDNA from purified BrUTP-labeled RNA, enabling quantitative PCR or sequencing readouts that help teams compare termination proficiency across conditions.
- Translational Research: Connects yeast-based termination findings to higher eukaryotes through conserved polymerase mechanisms, supporting preclinical continuity only when cross-species conservation is demonstrated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for termination analysis that can be applied across multiple targets and projects within nucleic acid-targeted discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in transcription termination studies through strand-specific discrimination.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via defined permeabilization, labeling, and purification steps that minimize user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering target-specific mechanistic data, reducing late-stage biological risk in RNA-focused therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of termination factor targets based on validated, quantitative evidence of functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, RNA handling, and nucleic acid purification techniques to manage unstable nascent transcripts.
- Dependent on access to BrUTP, RNA isolation reagents, phenol-chloroform workflows, and specialized beads for affinity purification of bromouridine-labeled RNA.
- Necessitates cross-team standardization between discovery biology and analytics groups to ensure consistent RNA yield, labeling efficiency, and cDNA synthesis quality.
- Adaptation to mammalian or higher eukaryotic systems may require optimization of permeabilization conditions and validation of BrUTP incorporation efficiency.
- Practical limitations include low yield of nascent transcripts and technical difficulty in RNA purification, which may affect scalability for high-throughput applications without automation support.
