Name: Analyse van de beëindiging van de transcriptie gebruik van BrUTP-streng-specifieke transcriptie Run-on (TRO) Approach (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Leer transcriptiebeëindiging analyseren in gist met behulp van de BrUTP-streng-specifieke transcriptie run-on (TRO) methode. Deze aanpak onderscheidt mRNA-transcriberende polymerasen van pervasief transcriberende polymerasen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek in het Ansari-lab werd ondersteund door de onderzoekssubsidie (nr. MCB 1020911) van de National Science Foundation.

Opmerking: Deze werkwijze werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in artikel Medler, S en Ansari, A. 2. 1. Het kweken en oogsten van de cellen <ol><li> Start een 5 ml kweek van cellen in YPD-medium (10 g / l gistextract, 20 g / l pepton, 2% dextrose) uit een vers uitgestreken plaat Saccharomyces cerevisiae. </li><li> Groeien de cellen overnacht in een orbitale schudder bij 30 ° C en 250 rpm. </li><li> Verdun de nacht gegroeide kweek 100 keer tot een eindvolume van 100 ml in YPD medium in een 250-ml kolf war. LET OP: Een totaal van 100 ml van de cultuur is nodig per TRO reactie; Als meerdere reacties nodig zijn, moet een groter volume kweek worden gebruikt. </li><li> Groeien de cellen tot een optische dichtheid van 0,8-1,0 bij 600 nm (600 A ~ 0,8-1,0). </li><li> Oogst de cellen door centrifugatie bij 820 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C in een steriele 50 ml conische buis. </li><li> Resuspendeer de cellen in 10 ml ijskoude TMN buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl) en incubeer op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 820 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de cellen te pelleteren. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie. </li></ol> 2. permeabilisatie en Voorbereiden Cellen voor Run-on Assay <ol><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml 0,6% sarkosyl oplossing op en neer pipetteren zachtjes met een afgeknot P 1000 tip. Breng de celsuspensie aan een gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Schud de cellen voorzichtig bij 4 ° C gedurende 25 min op een platform shaker. OPMERKING: Reactievaatjes moet worden verpakt in een 50 ml conische buis met ijs om een ​​lage temperatuur te handhaven op het vermijden van elke nieuwe initiatie gebeurtenissen in de promoter in dit stadium. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 1200 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C met een tafelblad gekoelde centrifuge. </li><li> Zuig het supernatant om de overtollige vloeistof uit de per verwijderenmeabilized cel pellet. </li></ol> 3. transcriptie Run-on Reaction <ol><li> Voeg 150 ul van transcriptie oploopvlak buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCI, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT (dithiothreitol), 0,75 mM elk van ATP, CTP, GTP en BrUTP, 200 U RNase inhibitor) aan de gepermeabiliseerde cel pellet. </li><li> Meng voorzichtig door en neer te pipetteren met behulp van een afgeknotte P 200 tip. LET OP: Als de verwerking van meerdere monsters, houden alles op ijs tot alle monsters zijn klaar en ga dan verder naar de volgende stap. </li><li> Incubeer gedurende 5 minuten bij 30 ° C in een waterbad. LET OP: Stel de incubatietijd tussen 1 en 5 minuten om een ​​optimale integratie van BrUTP te garanderen in de ontluikende RNA. </li><li> Stop de reactie door toevoeging van 500 pi koude kant-en-klare RNA-isolatie reagens. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol> 4. RNA-extractie <ol><li> Voeg 200 pl zuur gewassen glasparels aan de cel ophanging,on (stap 3.4) en schud krachtig gedurende 20 minuten bij 4 ° C in een vortex mixer. </li><li> Doorboren de bodem van de microcentrifugebuis met een hete 22 G naald en plaats het op de top van een 15 ml steriele conische buis. </li><li> Centrifugeer bij 300 xg gedurende 1 min bij 4 ° C om het cellysaat te verzamelen. Breng de cellysaat een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 500 ul koud RNA-isolatie reagens en 200 pl chloroform aan het cellysaat. Meng de inhoud van een vortex mixer en centrifugeer bij 16.168 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe microcentrifugebuis. </li><li> Voeg een gelijk volume van koude fenol / chloroform / isoamylalcohol (125: 24: 1) pH 4-5. Schud op een vortex mixer en centrifugeer bij 16.168 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Breng de bovenste waterige fase die RNA naar een nieuwe microcentrifugebuis. Herhaal stap 4.6 nog twee keer. </li><li> Om de finale RNA-bevattende waterfase, voeg 5 M NaCl stock om een ​​eindconcentratie van 0,3 M. Voeg 3 maal het volume koude ethanol om het RNA te precipiteren. <ol><li> Incubeer gedurende 1 uur of overnacht bij -20 ° C. OPMERKING: Voer de stappen 4,9-4,11 terwijl de anti-BrdU korrels worden gedurende het blokkeren (zie stap 5.3). </li></ol></li><li> Centrifugeer bij 16.168 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de RNA pellet in 100 ul van DEPC (diethylpyrocarbonaat) water. </li><li> Gebruik een RNA-isolatie mini kit om het RNA te scheiden van de niet opgenomen nucleotiden BrUTP. Elueer het RNA uit de kolom met 100 gl RNase-vrij water. </li><li> Incubeer de RNA in een 65 ° C waterbad gedurende 5 minuten en vervolgens over ijs gedurende ten minste 2 min. </li></ol> 5. affiniteitszuivering van BrUTP-gelabelde RNA <ol><li> Tot 25 pl anti-BrdU vaste parels, voeg 500 ul van 0,25x SSPE (Natrium Saline fosfaat EDTA) bindingsbuffer (20x SSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH 2 PO 4 </sub&gt;, 0,02 M EDTA, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 37,5 mM NaCl). Centrifugeer bij 200 xg gedurende 30 seconden bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof. </li><li> Herhaal stap 5,1 driemaal. </li><li> Voeg 500 pl blokkerende buffer (1x bindingsbuffer, 0,1% polyvinylpyrrolidon, 1 mg ultrazuivere runderserumalbumine (BSA)) aan de korrels en schud voorzichtig gedurende 1-2 uur bij 4 ° C op een platform shaker. </li><li> Was de korrels nog tweemaal met 500 ul bindingsbuffer, zoals beschreven in stap 5.1. </li><li> Voeg 400 ul bindingsbuffer aan de korrels. </li><li> Breng 100 pi van RNA (van stap 4,11) rechtstreeks aan de korrels. Incubeer onder voorzichtig schudden gedurende 1 - 2 uur bij 4 ° C op een platform shaker. </li><li> Was de kralen achtereenvolgens met 500 ul bindingsbuffer, 500 pl buffer met laag zoutgehalte (0,2X SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween), 500 ul buffer met hoog zoutgehalte (0,25x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 100 mM NaCl), en tweemaal met 500 ul van TET buffer (1x tE, 0,05% Tween), spinnen bij200 g gedurende 30 seconden bij 4 ° C tussen elke wassing. </li><li> Elueer het BrUTP-gemerkte RNA parels achtereenvolgens tweemaal met 150 ul en eenmaal met 200 ui elutiebuffer (20 mM DTT, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), door incubatie gedurende 4 min bij 42 ° C in een waterbad, gevolgd door kort centrifugeren tot korrels te scheiden van het supernatant. </li></ol> 6. Neerslag van BrUTP gelabelde RNA <ol><li> Voeg 500 ul koud fenol / chloroform / isoamylalcohol (125: 24: 1) pH 4-5 om de affiniteit gezuiverde BrUTP gelabeld RNA. Mengen op een vortex mixer en centrifugeer bij 16.168 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 5 M NaCl voorraad tot een eindconcentratie van 0,3 M en 3 maal het volume koude ethanol naar het RNA te precipiteren. </li><li> Incuberen bij -20 ° C overnacht. </li><li> Verzamel het neergeslagen RNA door centrifugatie bij 16.168 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en de pellet aan de lucht drogen gedurende 10 min. </li><li> Resuspendeer de RNA pellet in 26 ul DEPC water. </li><li> Bepaal de uiteindelijke RNA-concentratie door meting van de absorptie bij 260 nm met een spectrofotometer. Ook bepaalt de verhouding 260/280. Een verhouding ~ 2 duidt op een pure RNA monster. </li><li> Bewaar de RNA monsters in aliquots bij -80 ° C totdat ze nodig voor cDNA-synthese. </li></ol> 7. Reverse transcriptie van BrUTP-gelabelde RNA <ol><li> Pas de RNA-concentratie tot 100 ng / ul met behulp van DEPC water. Gebruik 0,5 ug RNA voor elk cDNA-synthesereactie. Opmerking: De concentratie van RNA-matrijs kan variëren 0,5-1,0 ug tot optimale cDNA-synthese te bereiken. </li><li> Reverse transcriberen het RNA met meerdere omgekeerde primers stroomafwaarts van het poly (A) website (stopplaats) zoals getoond in figuur 3A. </li><li> Aan elke reverse transcriptie reactie, voeg 5 ul RNA template (0,5 ug), 1 uL dNTP mix (10 mM elk), 2 pl reverse primer C, D, E, F of G (50 uM elk) (zie figuur 3A) en nuclease vrij water. Het uiteindelijke reactievolume in elke buis 13 pi. Opmerking: Het aantal reverse transcriptie reacties zullen afhangen van het aantal omgekeerde primers voor cDNA-synthese. Bijvoorbeeld, voor ASC1 vijf reverse primers werden gebruikt en dus werden vijf reverse transcriptie reacties opgezet. Label de buizen als C, D, E, F en G aan de hand van de reverse primer voor cDNA-synthese. </li><li> Incubeer de buizen met RNA-matrijs, dNTP mix en primers in een thermocycler bij 65 ° C gedurende 5 minuten aan een secundaire structurele conformatie te verwijderen, en daarna afkoelen tot 4 ° C gedurende ten minste 2 min. </li><li> Voeg 1 pl reverse transcriptase (200 U / pl), 4 ui buffer en 2 ui 0,1 M DTT aan elke buis met het RNA-matrijs en primer (stap 7,4). Meng door pipetteren voorzichtig op en neer. </li><li> Uitvoeren reverse transcriptie door het incuberen van het reactiemengsel in een thermocycler bij 42 ° C gedurende 60 minuten. </li><li> Inactiveren reverse transcriptase bij 65 ° C gedurende 20 min. </li><li> Bewaar de cDNA bij -20 ° C of naar de volgende stap. </li></ol> 8. Amplificatie van cDNA <ol><li> Voer de PCR-reactie voor amplificatie van elke cDNA-preparaat (aangeduid C, D, E, F en G ASC1) vanaf stap 7,8 als volgt: 3,0 pi cDNA sjabloon in stap 7,8, 1,0 pl voorwaartse primer B (10 uM), 1,0 ul reverse primer C of D of E of F of G (10 uM), 2,5 ui 10x polymerase PCR-buffer, 0,5 uL dNTP mix (10 mM elk), 1,0 pl MgCl2 (2,5 mM), 15,5 ui PCR kwaliteit water en 0,5 pl thermostabiele polymerase enzym. OPMERKING: Verschillende verdunningen van cDNA template variërend van 1: 5 tot 1: 100 te worden getest om de productopbrengst PCR optimaliseren. Een enkele promoter-proximale forward primer gebruikt om cDNA te amplificerenverkregen met verschillende reverse primers. Bijvoorbeeld, één voorwaartse primer B vlakbij het promoter werd gebruikt in combinatie met vijf reverse primers van C naar G ASC1. BC, BD, BE, BG BF en werden in buizen respectievelijk aangeduid als C, D, E, F en G zoals getoond in figuur 3A. </li><li> Voer het PCR met de volgende thermische cyclus parameters: 1 cyclus 95 ° C gedurende 2 min (warme start voor het activeren van polymerase), 30 - 40 cycli 95 ° C gedurende 30 s (denaturatie), 54 ° C gedurende 15 s (hybridisatie) , 68 ° C gedurende 1 min (extensie), en 1 cyclus 68 ° C gedurende 5 min (laatste verlenging). OPMERKING: De annealing temperatuur zal variëren afhankelijk van de specifieke primers wordt gebruikt en de verlenging zal variëren afhankelijk van de verwachte productgrootte. </li><li> Scheid het PCR product door elektroforese op 0,8%, 1,5% of 2% agarosegels afhankelijk van de verwachte grootte van het product. </li><li> Kwantificeren PCR product zoals beschreven in El Kaderi et al. , 2012 11. LET OP: U kunt ook gebruik maken van real-time RT-qPCR strategie om het bedrag van de ontluikende transcripten te kwantificeren. </li></ol>

<ol><li>Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+termination+of+transcription+to+messenger+RNA+maturation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast.</a> Science. 280 (5361), 298-301 (1998).</li>
<li>Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+looping+facilitates+TFIIH+kinase-mediated+termination+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription.</a> Sci Rep. 5, 12586(2015).</li>
<li>Richard, P., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+by+nuclear+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription termination by nuclear RNA polymerases.</a> Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).</li>
<li>Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disengaging+polymerase%3A+terminating+RNA+polymerase+II+transcription+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).</li>
<li>Porrua, O., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+and+the+control+of+the+transcriptome%3A+why%2C+where+and+how+to+stop%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).</li>
<li>Jacquier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+eukaryotic+transcriptome%3A+unexpected+pervasive+transcription+and+novel+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs.</a> Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+promoters+generate+pervasive+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).</li>
<li>Neil, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+bidirectional+promoters+are+the+major+source+of+cryptic+transcripts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reality+of+pervasive+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The reality of pervasive transcription.</a> PLoS Biol. 9 (7), e1000625(2011).</li>
<li>Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+antisense+transcription+is+evolutionarily+conserved+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast.</a> Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).</li>
<li>El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+genomic+loci+through+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15(2012).</li>
<li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De streng-specifieke TRO protocol hier gebruikt werd aangepast van het protocol dat wordt gebruikt voor het GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) analyse in zoogdiercellen 12. We hebben met succes het protocol aangepast om ontluikende transcriptie studeren in gist. Om specifiek wat de transcriptie beëindiging defect, aangepast we het protocol verder door zich te ontdoen van de RNA-hydrolyse stap. Dit liet ons toe om specifiek detecteren volledige lengte ontluikende transcripten die geïnitieerd vanaf...

De eukaryotische transcriptie cyclus bestaat uit drie belangrijke stappen; initiatie, verlenging en beëindiging. De beëindiging van de transcriptie door RNA-polymerase II bestaat uit twee afzonderlijke, onderling afhankelijke stappen 3. De eerste stap is splitsing en afgifte polyadenylatie van mRNA uit de matrijs en wordt onmiddellijk gevolgd door de tweede stap, gekenmerkt door losmaken van polymerase van de sjabloon. Juiste afsluiting is cruciaal voor de recycling van de polymerase bij aanvang / her-initiatie van transcriptie, het voorkomen interferentie met de transcriptie van downstream genen, en het bijhouden van afwijkende transcriptie controle door het beperken transcriptie van doordringende niet-coderende RNA 4, 5. Ondanks recente vooruitgang beëindiging veruit de minst begrepen stap van het RNA polymerase II de transcriptie cyclus. Een betrouwbare beëindiging test is essentieel voor het bestuderen van het mechanisme underlying beëindiging van transcriptie door RNA polymerase II in vivo. Een aantal experimentele benaderingen worden gebruikt om de beëindiging defect in een actief transcriberen gen onder fysiologische ziektebeelden. Deze omvatten Northern blot, beëindiging factor chip (Chromatine Immunoprecipitatie) en de traditionele TRO test. Elk van deze technieken heeft voordelen als nadelen. De traditionele TRO assay gebruikt om de meest betrouwbare en gevoelige benadering voor de detectie van een transcriptie terminatie defect in vivo 1 zijn. Deze test lokaliseert het transcriptioneel actieve polymerase moleculen op verschillende gebieden van een gen in de cel. Onder normale omstandigheden het assay toont gekoppelde transcriptie polymerase moleculen strikt verdeeld tussen de promoter en terminator van het gen (Figuur 1A). Na beëindiging defecte echter het polymerase in staat is de beëindiging uitgelezen signaalen wordt gedetecteerd in het gebied stroomafwaarts van het 3&#39;-uiteinde van het gen (Figuur 1B). Een transcriptieterminatiesequentie defect manifesteert in aanwezigheid van een sense-transcriptie polymerase dat geïnitieerd van de promoter-proximale gebied, en niet in staat om de beëindiging uitgelezen signaal blijft transcriptie van het gebied stroomafwaarts van het 3&#39;-uiteinde van een gen zoals getoond in figuur 2A. Met het besef dat de eukaryote genoom vertoont overweldigend alomtegenwoordig transcriptie in zin evenals anti-sense richtingen in en rond een gen 6, 7, 8, 9, 10, werd al snel duidelijk dat de traditionele TRO test niet kan detecteren of de polymerase signaal stroomafwaarts van een gen betekent een promotor geïnitieerd transcript (Figuur 2A) of een afwijkende RNA dat som ingeleidewhere in het midden van het gen of stroomafwaarts van de terminator element (figuur 2B) of de polymerase transcriptie van de antisense richting vanaf het 3 &#39;uiteinde van het gen (Figuur 2C). De streng-specifieke TRO assay gebruikt BrUTP beschreven kunnen onderscheiden of de waargenomen readthrough polymerase-promoter representeert geïnitieerde verlengde sense mRNA of een antisense transcript dat stroomafwaarts van het gen onderzochte ingeleid. We hebben met succes deze benadering gebruikt om de rol van Kin28 kinase beëindiging van transcriptie aangetoond in gist 2. Gebruikmakend van de aanpak hier laten we zien dat Rna14 nodig is voor de beëindiging van de transcriptie van ASC1 in gist.

<table><tbody><tr><td>Fenol-chloorform-isoamylalcohol mengsel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td>pH 4-5</td></tr><tr><td>TRIzol reagens</td><td>Life technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor, menselijke placenta</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU kralen</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32323AC</td><td></td></tr><tr><td>Protoscript II</td><td>New England Biolabs</td><td>M03368L</td><td>of een gelijkwaardig enzym</td></tr><tr><td>Advantage 2 polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>of een gelijkwaardig enzym</td></tr><tr><td>5-Bromouridine 5' trifosfaat natriumzout</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-214314A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0451AA</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td></td><td>N0454AA</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td></td><td>N0452AA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-pure bovien serum albumine (BSA)</td><td>MC Labs</td><td>UBSA-100</td><td></td></tr><tr><td>Asc1 B</td><td></td><td></td><td>AGATTCGTCGGTCACAAGTCC</td></tr><tr><td>Asc1 C</td><td></td><td></td><td>GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC</td></tr><tr><td>Asc1 D</td><td></td><td></td><td>TGTACATATGTATTTTCGCAGCA</td></tr><tr><td>Asc1 E</td><td></td><td></td><td>GCCAAGGAGACTGAATTTAATG</td></tr><tr><td>Asc1 F</td><td></td><td></td><td>CTATGGAATGGGGGTTTTAAG</td></tr><tr><td>Asc1 G</td><td></td><td></td><td>GGTTATGGCAGACATGCCAC</td></tr><tr><td>5s cDNA</td><td></td><td></td><td>AGATTGCAGCACCTGAGT</td></tr><tr><td>5&rsquo; 5s omgekeerd</td><td></td><td></td><td>GGTTGCGGCCATATCTAC</td></tr><tr><td>3&rsquo; 5s omgekeerd</td><td></td><td></td><td>TGAGTTTCGCGTATGGTC</td></tr></tbody></table>

analyse van de beëindiging van de transcriptie gebruik van brutp-streng-specifieke transcriptie run-on (tro) approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Dit manuscript beschrijft een protocol voor het detecteren transcriptieterminatie defect in vivo. De streng-specifieke TRO protocol gebruikt BrUTP beschreven is een krachtige experimentele benadering voor het analyseren van de transcriptie beëindiging defect onder fysiologische omstandigheden. Als de traditionele TRO assay is gebaseerd op de aanwezigheid van een transcriptioneel actieve polymerase voorbij het 3 &#39;uiteinde van het gen als een indicator van een transcriptie terminatie defect 1. Het overwint twee grote problemen met de traditionele TRO test. Ten eerste kan het detecteren of het polymerase lezen door het terminatiesignaal is die transcriptie geïnitieerd van de promoter-proximale regio, of simpelweg vertegenwoordigt een pervasively transcriberen polymerase die aspecifiek geïnitieerd ergens in het lichaam of het 3&#39; uiteinde van het gen. Ten tweede kan onderscheiden of het transcriptioneel actieve polymerase-signaal buiten hetterminatorgebied werkelijk de readthrough sense mRNA transcriberen polymerase of een terminator geïnitieerde niet-coderende antisense RNA signaal. Kort samengevat, het protocol omvat permeabilisatie de exponentieel groeiende gistcellen, waardoor de transcripten die in vivo gestart te rekken in aanwezigheid van de BrUTP nucleotide zuiveren BrUTP gelabelde RNA met de affiniteit benadering reverse transcriberen het gezuiverde ontluikende RNA en amplificatie van het cDNA met behulp strengs specifieke primers aan weerszijden van de promoter en terminator gebieden van het gen 2.

Om de toepasbaarheid van de BrUTP-streng-specifieke TRO procedure aan te tonen in het detecteren van een transcriptie terminatie defect, gebruikten we een beëindiging-defect is, temperatuurgevoelige mutant van RNA14 genoemd rna14-1. De rol van Rna14 in de beëindiging van de transcriptie door RNA-polymerase II werd aangetoond met behulp van de traditionele TRO test die RNA in de terminator-proximale gebied van geselecteerde genen 1 gedetecteerd. D...

We beschrijven een basisexperimentele benadering voor analyse van de terminatie van transcriptie door RNA-polymerase II in vivo met behulp van BrUTP door de strengspecifieke transcriptie run-on (TRO) benadering in knoppende gist. Dit protocol kan worden uitgebreid om de transcriptieterminatie door andere RNA-polymerasen te bestuderen, zowel in gist als in hogere eukaryoten.

Analyse van de beëindiging van de transcriptie gebruik van BrUTP-streng-specifieke transcriptie Run-on (TRO) Approach

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Het algemene doel van deze procedure is om de terminatie van transcriptie door RNA-polymerase te bestuderen bij knopvormende gist onder in vivo-condities door de strengspecifieke transcriptierun-on-aanpak. Deze methode helpt bij het beantwoorden van de sleutelvraag of de transcriptioneel actieve polymerase die wordt gedetecteerd voorbij het drie-prime-uiteinde van het gen degene is die is geïnitieerd vanuit het promotorgebied. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat deze een MRNA-transcribeerbare polymerase kan onderscheiden van een overal transcriberende polymerase die transcripties heeft geïnitieerd en zich op het drie-prime-uiteinde van het gen zal bevinden.Deze techniek kan worden uitgebreid om de terminatie van transcriptie door andere RNA-polymerasen en gist te bestuderen vanwege de geconserveerde aard van terminatie door verschillende polymerasen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de precieze rol van terminatiefactoren in de gisttranscriptiecyclus, kan deze ook worden uitgebreid om terminatie in hogere eukaryoten te bestuderen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen met celpermeabilisatie en transcriptierun-on-stops, omdat ze zorgvuldige uitvoering vereisen, en beginnende transcripten kunnen ook moeilijk te zuiveren zijn.We hadden het idee voor deze methode voor het eerst vanuit de GRO-seek-aanpak die een genoombreed momentopname geeft van de positie van transcriptioneel actieve polymerasen op een strengspecifieke manier. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, aangezien de transcriptierun en RNA-zuivering moeilijk uit te voeren zijn vanwege de lage hoeveelheid en onstabiele aard van de beginnende transcripten. Voordat u begint met de transcriptierun-on-reactie, laat u exponentieel groeiende gistcellen groeien, oogsten en permeabiliseren om een gepermeabiliseerd cellenpallet te verkrijgen.Om de reactie te starten, voegt u 150 microliter transcriptierun-on-buffer toe aan het gepermeabiliseerde cellenpalette. Gebruik een afgeknotte P-200 tip om voorzichtig te mengen door op en neer te pipetten. Plaats het monster op ijs.Nadat alle monsters zijn opgeschort in de transcriptierun-on-buffer, incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij 30 graden Celsius in een waterbad. Stop de reactie door 500 microliter koud klaar-voor-gebruik RNA-isolatiereagens toe te voegen aan elk monster. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Begin de RNA-extractieprocedure door 200 microliter zuurgewassen glazen kralen toe te voegen aan elke cellensuspensie en krachtig te schudden in een vortexmixer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Gebruik na 20 minuten een hete 22 gauge naald om de bodem van elke microcentrifugebuis te doorboren en plaats de buis op de bovenkant van een 15 milliliter steriele conische buis. Centrifugeer gedurende één minuut bij 300 keer G bij vier graden Celsius en breng het cellysaat over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.Voeg 500 microliter koud RNA-isolatiereagens en 200 microliter chloroform toe aan het cellysaat. Meng de inhoud op de vortexmixer en centrifugeer vervolgens gedurende 20 minuten bij 16.168 keer G bij vier graden Celsius. Breng de bovenste waterige fase over in een nieuwe microcentrifugebuis.Voeg een gelijk volume koud fenol chloroform isoamyl alcohol toe. Schud krachtig op de vortexmixer en centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten bij 16.168 keer G bij vier graden Celsius. Breng de bovenste waterige fase die RNA bevat over in een nieuwe microcentrifugebuis.Voeg een gelijk volume koud fenol chloroform isoamyl alcohol toe, schudt en centrifugeer opnieuw. Voeg aan de uiteindelijke RNA-bevattende waterige fase een geschikt volume van een vijf molaar natriumchloride stock toe om een uiteindelijke concentratie van 0,3 molaar te verkrijgen. Voeg drie keer het volume koud ethanol toe om de RNA te precipiteren.Incubeer gedurende één uur, of overnacht, bij 20 graden Celsius. Wanneer de RNA-precipitatie klaar is, centrifugeer gedurende 20 minuten bij 16.168 keer G bij vier graden Celsius. Verwijder de supernatant en schud het RNA-pallet opnieuw op in 100 microliter DEPC-water.Gebruik een RNA-isolatiekit om het RNA te scheiden van de niet-geïncorporeerde bromouridine trifosfaat nucleotiden en elueer het RNA van de kolom met 100 microliter RNAse-vrij water. Incubeer het RNA in een 65 graden Celsius waterbad gedurende vijf minuten. Breng het vervolgens over naar ijs voor minimaal twee minuten.Begin deze procedure door de anti-bromo DU-kralen voor te bereiden terwijl het RNA wordt geprecipiteerd. Voeg voor elk monster 500 microliter 0,25 X natriumzoutwosfaat EDTA bindingsbuffer toe aan 25 microliter bezonken kralen. Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 200 keer G bij vier graden Celsius en verwijder de supernatant.Was de kralen drie keer met de bindingsbuffer. Nadat de supernatant van de derde wassing is verwijderd, voegt u 500 microliter blokkeringsbuffer toe aan de kralen en schudt u zachtjes gedurende één tot twee uur bij vier graden Celsius op een platformschudder. Was de kralen nog twee keer met 500 microliter bindingsbuffer.Verwijder de supernatant van de tweede wassing en voeg 400 microliter bindingsbuffer toe aan de kralen. Breng 100 microliter RNA direct over naar de kralen. Incubeer met zachtjes schudden gedurende één tot twee uur bij vier graden Celsius op een platformschudder.Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 200 keer G bij vier graden Celsius en verwijder vervolgens de supernatant. Voeg vervolgens 500 microliter bindingsbuffer toe aan de kralen. Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 200 keer G bij vier graden Celsius en verwijder de supernatant.Was de kralen op deze manier sequentieel met bindingsbuffer, lage zoutbuffer, hoge zoutbuffer en twee keer met TET-buffer. Om het bromouridine trifosfaat gelabelde RNA van de kralen te elueren, voegt u 150 microliter elutiebuffer toe en incubeert u gedurende vier minuten bij 42 graden Celsius in een waterbad. Spin kort neer en verzamel de supernatant.Elueer op deze manier sequentieel twee keer met 150 microliter en eenmaal met 200 microliter elutiebuffer. Er moet ongeve

analysis-termination-transcription-using-brutp-strand-specific

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Telomeren zijn essentieel voor chromosoom stabiliteit en de telomeer G-overhang structuur is essentieel voor telomerase-gemedieerde telomeren onderhoud. We hebben onlangs twee methoden voor het detecteren van de telomeer G-overhang structuur...

Onderzoek van de telomeren G-overhang Structuur in Trypanosoma brucei</em

RNA polymerase II synthetiseert een precursor RNA dat buiten de 3 'uiteinde van het rijpe mRNA. Het uiteinde van het rijpe RNA cotranscriptionally gegenereerd op een plaats bepaald door RNA-sequenties, via de endonuclease activiteit van de splitsing complex. Hier hebben we detail de methode om splitsingreacties studeren in vitro.

Analyse van RNA processing Reacties Met behulp van Cell Free Systems: 3 &#39;End Splitsing van pre-mRNA Substrates<em&gt; In vitro</em

We beschrijven hier een op fluorescentie gebaseerde primer-extensiemethode om transcriptionele startpunten van bacteriële transcripten en RNA-verwerking in vivo te bepalen met behulp van een geautomatiseerde gel-sequencer.

Fluorescentie gebaseerde primer Extension Techniek om Transcriptioneel uitgangspunten en Splitsing Sites van RNases Bepaal In Vivo

Dit protocol maakt gebruik van Golden Gate Assembly en de plasmide pGR-blue om snel de sterkte van terminatoren te kwantificeren die in silico gevonden worden.

Rapid Verificatie van Terminators Met behulp van de PGR-Blue Plasmid en Golden Gate Assembly

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Toeprinting wil het vermogen meten van in vitro Getranscribeerd RNA naar formulier vertaling initiatie complexen met ribosomen onder een aantal voorwaarden. Dit protocol wordt een methode beschreven voor de toeprinting zoogdieren RNA en kan worden gebruikt voor het bestuderen van de GLB-afhankelijke zowel IRES gestuurde vertaling.

Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs

We presenteren een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie door het combineren van circulaire RT-PCR, kwantitatieve RT-PCR, RNA 5 ' poly hosphatase-Treatment, en Northern Blot. Dit protocol bevat een normalisatie stap om de invloed van onstabiel 5 ' trifosfaat te minimaliseren, en het is geschikt voor het discrimineren en in kaart brengen van de primaire en verwerkte transcripten die stabiel zijn verzameld in maïs-mitochondrion.

Discriminatie en mapping van de primaire en verwerkte transcripten in maïs-mitochondrion met behulp van een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie

Intrinsiek ongeordende domeinen zijn belangrijk voor de functie van de oncogene fusietranscriptiefactor. Om deze eiwitten therapeutisch te targeten, is een meer gedetailleerd begrip van de regulerende mechanismen die door deze domeinen worden gebruikt, vereist. Hier gebruiken we transcriptomics om belangrijke structurele kenmerken van het intrinsiek ongeordende EWS-domein in Ewing-sarcoom in kaart te brengen.

Het in kaart brengen van de structuur-functierelaties van ongeordende oncogene transcriptiefactoren met behulp van transcriptomische analyse

Dit protocol leidt beginners in de bio-informatica door een inleidende CUT&amp;RUN-analysepijplijn die gebruikers in staat stelt om een eerste analyse en validatie van CUT&amp;RUN-sequencinggegevens te voltooien. Het voltooien van de hier beschreven analysestappen, in combinatie met stroomafwaartse piekannotatie, stelt gebruikers in staat om mechanistische inzichten te verkrijgen in chromatineregulatie.

Inleidende analyse en validatie van CUT&#38;RUN-sequencinggegevens

In dit manuscript beschrijven we een protocol om transcriptie en de remmende activiteit van antibacteriële middelen die zich richten op bacteriële transcriptie functioneel te onderzoeken.

In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery

Leer transcriptiebeëindiging analyseren in gist met behulp van de BrUTP-streng-specifieke transcriptie run-on (TRO) methode. Deze aanpak onderscheidt mRNA-transcriberende polymerasen van pervasief transcriberende polymerasen.

Analyse van de beëindiging van de transcriptie gebruik van BrUTP-streng-specifieke transcriptie Run-on (TRO) Approach

Meer video's verkennen