Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE
16 mei 2017
In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.
Het algemene doel van deze procedure is om de structuur van macromoleculaire complexen te bepalen door middel van eenmalige deeltje-analyse van elektronencryo-microscopiegegevens met behulp van de beeldverwerkingssoftware SPHIRE. Cryo-EM met enkele deeltjes wordt een mainstream-technologie voor het bestuderen van macromoleculaire structuren met bijna atomaire resolutie. SPHIRE is een nieuwe softwarepakket dat semi-geautomatiseerde verwerking van cryo-EM-gegevens mogelijk maakt op een gebruiksvriendelijke manier.
Het belangrijkste voordeel van SPHIRE is het automatische validatiemechanisme. De meeste procedures hoeven maar één keer te worden uitgevoerd, en de resultaten zijn objectief en reproduceerbaar. Hoge resolutie cryo-EM kan worden gebruikt om individuele residuen te plaatsen, waardoor cruciaal inzicht wordt verkregen in de organisatie en functie van complexe micromoleculaire machines.
Personen die nieuw zijn in deze methode, moeten in gedachten houden dat het verkrijgen van een hoge resolutiestructuur sterk afhankelijk is van de kwaliteit van het monster en de invoergegevens. Om de SPHIRE-applicatie te beginnen, opent u de GUI vanuit de terminal. Open de UTILITIES om een cryo-microscopiebeeld weer te geven met e2display.
Gebruik de ingebouwde meettool om de langste deeltje-as te meten in angstrom per pixel. Open de Project Instellingen. Stel de CTF-venstergrootte in op ten minste de grootte van het deeltje-vak.
Stel de grootte van het deeltje-vak in op een even getal, ten minste 1 1/2 keer de diameter van het deeltje. Stel de deeltje-straal in op ten minste de helft van de gemeten lengte. Voer de puntgroepsymmetrie in, indien bekend, en de geschatte moleculaire massa.
Registreer de instellingen. Open vervolgens in het MOVIE-menu de Micrograph movie alignment. Stel de paden van de unblur en summovie uitvoerbare bestanden in.
Kies een ruwe niet-uitgelijnde micrograph movie en vervang de variabele bestandsnaam met een jokerteken om het invoerpadpatroon van de micrograph in te stellen. Geef de uitvoermap een naam. Vul het aantal movie-frames in, de microscoopspanning en de belichting per frame.
Voer het proces uit om dosis-gewogen en dosis-ongewogen bewegingsgecorrigeerde gemiddelde micrographs te genereren. Open vervolgens het CTER-menu en selecteer CTF Estimation. Stel de dosis-ongewogen micrographs als invoer in.
Geef de uitvoermap een naam en vul de gegevensverzamelparameters in. Stel de laagste frequentie in op 0285 inverse angstroms en de hoogste frequentie op 0,285 inverse angstroms. Voer het proces uit om een lijst met CTF-parameters te genereren.
Open vervolgens het WINDOW-menu en selecteer Particle Picking. Stel de dosis-gewogen micrographs als invoer in en start de e2boxer-utility. Voer deeltje-picking handmatig of automatisch uit.
Extract de gekozen deeltjes in beeldstacks en combineer de stack tot een enkele virtuele beeldstack in een BDB-database. Zodra de deeltjes zijn gekozen en gestapeld, opent u het ISAC-menu en selecteert u ISAC 2D Clustering. Stel de virtuele beeldstack in de BDB-database als invoer in.
Schat het aantal beelden per klasse. Vul de resterende parameters in en genereer de 2D klasse-gemiddelden. Zodra de 2D-classificatie voltooid is, gebruikt u de Display Data-utility om de gevalideerde reproduceerbare klasse-gemiddelden te bekijken.
Controleer of er meerdere deeltjesoriëntaties zijn vertegenwoordigd en of de klasse-gemiddelden van bevredigende kwaliteit zijn. Genereer een nieuwe virtuele beeldstack die alleen deeltjes bevat die tot de gevalideerde klasse-gemiddelden behoren. Open vervolgens het VIPER-menu en gebruik de Display Data-utility om de klasse-gemiddelden te bekijken.
Verwijder klasse-gemiddelden van slechte kwaliteit of die identieke weergaven van het deeltje tonen. Sla de resterende klasse-gemiddelden op in een nieuw bestand. Selecteer vervolgens Initial 3D Model RVIPER en gebruik de kleine selectie van klasse-gemiddelden als invoer.
Voer de opdracht uit om een aanvankelijk reproduceerbaar 3D-model van het eiwit te genereren. Inspecteer het model in het moleculaire grafische programma Chimera. Vergelijk het model met een bekende structuur van een homoloog eiwit of domein van het eiwit van belang.
Keer terug naar het VIPER-menu in SPHIRE en selecteer Create 3D Reference. Genereer een aanvankelijk 3D-referentiemodel met de juiste pixelgrootte en een 3D-masker. Open het MERIDIEN-menu en selecteer 3D Refinement.
Vul de paden van de invoer-beeldstack en het initiële 3D-referentiebestand in. Geef de uitvoermap een naam en stel het masker van het referentiemodel als 3D-masker in. Selecteer Apply hard 2D mask.
Stel de startresolutie in tussen 20 en 25 angstroms en voer de 3D-verfijning uit om de ongefilterde halve volumes te produceren. Bekijk vervolgens in ongefilterde halve volume in Chimera. Bepaal een binarisatiedrempel waarin alle eiwitdichtheden zijn verbonden, maar ruisartefacten niet.
Keer terug naar het MERIDIEN-menu van SPHIRE en open Adaptive 3D Mask. Voer de ongefilterde halve volume-invoer en binarisatiedrempel in. Geef de uitvoermasker een naam en voer het proces uit om een zachte-rand 3D-masker te genereren.
Open vervolgens Sharpening en selecteer beide ongefilterde halve volumes. Stel het zachte-rand halve volume 3D-masker als de door de gebruiker verschafte masker in. Voer het proces uit dat de halve volumes samenvoegt en vervolgens het samengevoegde volume filtert en verzacht.
Open het logbestand om de laatste resolutieschatting te bekijken. Genereer een 3D-kaart van de hoekverdeling van het deeltje van de invoer-beeldstack die tijdens de 3D-verfijning is gegenereerd. Open het verzorgde en gefilterde 3D-model in Chimera.
Inspecteer de dichtheidskaart en zijn hoge resolutie-eigenschappen. Open de hoekverdeling in Chimera en controleer of de Euler-hoeken isotropisch verdeeld zijn. Open het SORT3D-menu en selecteer 3D Variability Estimation.
Genereer een 3D-variabiliteitsmap van de virtuele stack van deeltje-beelden behorend tot de gevalideerde klasse-gemiddelden. Genereer een gebinariseerd 3D-masker uit deze vari
Overzicht
Dit document presenteert een protocol voor het verwerken van cryo-EM beelden met behulp van de software suite SPHIRE. Deze methode is toepasbaar voor single particle EM projecten die gericht zijn op bijna-atomaire resolutie.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Structuurbiologie
- Cryo-Elektronen Microscopie
- Beeldverwerking
Achtergrond
- Single particle cryo-EM is een sleuteltechnologie voor het bestuderen van macromoleculaire structuren.
- SPHIRE biedt een semi-automatische aanpak voor cryo-EM dataverwerking.
- Het protocol benadrukt het belang van monsterkwaliteit voor hoge resolutie resultaten.
- SPHIRE omvat een automatisch validatiemechanisme voor reproduceerbaarheid.
Doel van Studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het verwerken van cryo-EM beelden.
- Om de bepaling van macromoleculaire complexe structuren te vergemakkelijken.
- Om de toegankelijkheid van cryo-EM technieken voor onderzoekers te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Gebruik van SPHIRE software voor beeldverwerking.
- Handmatig en automatisch particle picking van cryo-EM beelden.
- 2D classificatie en 3D modelgeneratie.
- 3D verfijning en variabiliteitsschatting voor verbeterde resolutie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle generatie van hoog-resolutie 3D modellen van eiwitten.
- Validatie van klasse gemiddelden en deeltjesoriëntaties.
- Stabieleren van een reproduceerbaar protocol voor cryo-EM dataverwerking.
- Identificatie van structuren met hoge schijnbare resolutie.
Conclusies
- Het SPHIRE protocol stroomlijnt de cryo-EM beeldverwerking aanzienlijk.
- Hoge kwaliteit input data is cruciaal voor het bereiken van betrouwbare resultaten.
- Deze methode verbetert het begrip van complexe macromoleculaire structuren.
Veel Gestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Cryo-EM enables near-atomic resolution structural determination of macromolecular complexes, providing critical insights for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. SPHIRE streamlines this process through semi-automated workflows and objective validation, reducing barriers for novice users and enhancing reproducibility across teams. This supports predictive confidence in structural biology inputs for lead identification and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving macromolecular structures at near-atomic resolution.
- Operational Value: Provides reproducible 3D models from as few as 9,500 particles, supporting rapid target validation cycles.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by visualizing side-chain densities and conformational dynamics in toxin complexes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated, noise-free atomic models suitable for structure-based assay design.
- Operational Value: Standardizes particle picking and classification through GUI-controlled, semi-automated pipelines.
- Reproducibility: Automatic validation ensures objective results across users and sites, enabling assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical by delivering high-resolution models for docking and mutagenesis studies.
- Mechanistic Insight: Reveals localized flexibility in domains such as receptor-binding regions, informing functional assays.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of structural heterogeneity that may impact developability.
Pipeline & Workflow Integration
SPHIRE integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by delivering high-resolution structural data that informs compound design and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via 3D variability analysis and local resolution mapping to assess conformational states.
- Screening: Delivers standardized, dose-weighted micrographs and class averages for reliable particle preparation.
- Analytics: Provides quantitative outputs including resolution estimates, angular distribution, and variability maps for data-driven decisions.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by producing sharpened, locally filtered 3D models suitable for atomic model building.
- Enterprise Reuse: GUI-driven workflow allows reuse across projects with minimal retraining, promoting platform standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Near-atomic resolution models reduce mechanistic ambiguity in target engagement studies.
- Operational Value: Semi-automated processing minimizes user intervention and increases throughput.
- Strategic Value: Objective validation improves go/no-go decisions by reducing structural uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of targets with validated structural models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in structural biology and cryo-EM sample preparation.
- Depends on GPU-accelerated workstations for 3D refinement and variability analysis.
- Necessitates standardized data collection parameters (voltage, exposure, defocus) across teams.
- Performance limited by sample heterogeneity and preferential orientation.
- Relies on external tools like Chimera for visualization and validation.
