Name: Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Leer hoe je met high-content microscopy tegelijkertijd ROS-niveaus en mitochondriële morfofunctie kwantificeert in levende adherente cellen. Deze methode maakt robuuste redox-profiling mogelijk voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door de Universiteit Antwerpen (TTBOF/29267, TTBOF/30112), het Bijzonder Onderzoeksfonds van de Universiteit Gent (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Projectcode 01-MR0110) en de CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiatief van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO; Nr: CSBR09/013V). Delen van dit manuscript zijn aangepast van een andere publicatie1, met toestemming van Springer. De auteurs danken Geert Meesen voor zijn hulp met de widefield microscoop.

<ol><li>Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+High-Content+Quantification+of+Intracellular+ROS+Levels+and+Mitochondrial+Morphofunction%5BTitle%5D)+AND+%22AAEC%22%5BJournal%5D)">Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction.</a> AAEC. 219, 149-177 (2016).</li>
<li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-ros+crosstalk+in+the+control+of+cell+death+and+aging%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Signal+Transduct%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging).</a> J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).</li>
<li>Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+protonic+potential+actuates+a+mechanism+of+production+of+reactive+oxygen+species+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+lett%22%5BJournal%5D)">High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.</a> FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).</li>
<li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+matrix+reactive+oxygen+species+production+is+very+sensitive+to+mild+uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling.</a> Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).</li>
<li>Verkaart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+production+is+inversely+related+to+complex+I+activity+in+inherited+complex+I+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-GEN+SUBJECTS%22%5BJournal%5D)">Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).</li>
<li>Lebiedzinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-dependent+p66Shc+phosphorylation+in+skin+fibroblasts+of+children+with+mitochondrial+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-GEN+SUBJECTS%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).</li>
<li>Forkink, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+hyperpolarization+during+chronic+complex+I+inhibition+is+sustained+by+low+activity+of+complex+II%2C+III%2C+IV+and+V%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-BIOENERGETICS%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V.</a> BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).</li>
<li>Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Homeostasis+and+Mitochondrial+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics.</a> Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).</li>
<li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+deficiency%3A+radical+changes+in+mitochondrial+morphology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).</li>
<li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics--mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li>
<li>Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+network+formation+protects+mitochondria+from+autophagosomal+degradation+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).</li>
<li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17066472">Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 &#34;,7 -&#34;dichlorofluorescein.</a> Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).</li>
<li>Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-content+analysis+of+mitochondrial+morphofunction+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy.</a> Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).</li>
<li>Sieprath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+accumulation+of+prelamin+A+and+depletion+of+lamin+A%2FC+both+cause+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+but+induce+different+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates.</a> Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).</li>
<li>Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuiderveld%2C+K+%22Graphics+gems+IV%22">Graphics gems IV</a>. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).</li>
<li>Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChang%2C+W+%22shiny%3A+Web+Application+Framework+for+R.+R+package+version+0.14.2%22">shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=shiny ">https://CRAN.R-project.org/package=shiny </a> (2017).</li>
<li>Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. <a target="_blank" href="https://www.jstatsoft.org/article/view/v064i09">nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals.</a> J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).</li>
<li>Estaquier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+antiretroviral+drugs+on+human+immunodeficiency+virus+type+1-induced+CD4%28%2B%29+T-cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death.</a> J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).</li>
<li>Matarrese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+hyperpolarization+hijacks+activated+T+lymphocytes+toward+the+apoptotic-prone+phenotype%3A+homeostatic+mechanisms+of+HIV+protease+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors.</a> J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).</li>
<li>Roumier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+protease+inhibitors+and+cytomegalovirus+vMIA+induce+mitochondrial+fragmentation+without+triggering+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis.</a> Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).</li>
<li>Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+protease+inhibitor+induced+oxidative+stress+suppresses+glucose+stimulated+insulin+release%3A+protection+with+thymoquinone%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone.</a> Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).</li>
<li>Touzet, O., Philips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+protects+against+protease+inhibitor-induced+reactive+oxygen+species+production%2C+reticulum+stress+and+lipid+raft+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation.</a> AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).</li>
<li>Bociąga-Jasik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+effects+of+the+HIV+protease+inhibitor--saquinavir+in+differentiating+human+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes.</a> Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).</li>
<li>Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nelfinavir%2C+an+HIV+protease+inhibitor%2C+induces+apoptosis+and+cell+cycle+arrest+in+human+cervical+cancer+cells+via+the+ROS-dependent+mitochondrial+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway.</a> Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).</li>
<li>Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+small+molecule+phenotypic+effects+using+mitochondrial+morpho-functional+fingerprinting+and+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning.</a> Sci. Rep. 5, 8035(2015).</li>
<li>Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , 
 <a target="_blank" href="https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf ">https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf </a> (2006).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Convenient+Technique+to+Fix+Suspension+Cells+on+a+Coverslip+for+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy.</a> Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).</li>
<li>Deutsch, M., Deutsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+miniature+cell+retainer+for+correlative+high-content+analysis+of+individual+untethered+non-adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells.</a> Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).</li>
<li>Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+new+method+for+immobilising+kinetoplastid+parasites+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging.</a> Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).</li>
<li>Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+changes+in+plasma+membrane+potential+via+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+at+individual+cell+resolution+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22JBO%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension.</a> JBO. 18 (12), (2013).</li>
<li>Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+cellular+oxygen+and+analysis+of+metabolic+responses+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells.</a> Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).</li>
<li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+spinning+disk+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Live cell spinning disk microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).</li>
<li>Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+live+fluorescence+imaging+of+cellular+dynamics+using+Bessel+beam+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy.</a> Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).</li>
<li>Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+plate+reader-based+methods+with+fluorescence+microscopy+for+measurements+of+intracellular+calcium+levels+for+the+assessment+of+in+vitro+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).</li>
<li>Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+standard+microtiter+plate+reading+versus+imaging+in+cellular+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+drug+development+technologies%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays.</a> Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).</li>
<li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).</li>
</ol>

De auteurs stellen dat er geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten zijn. De bijbehorende auteur zorgt er ook voor dat alle auteurs gevraagd zijn om alle belangenconflicten bekend te maken.

Dit document beschrijft een microscopiemethode met hoge inhoud voor de gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus en mitochondriale morfofunctie in NHDF. Zijn prestatie werd aangetoond met een casestudy over SQV-behandelde NHDF. De resultaten ondersteunen eerder bewijs uit de literatuur waarin verhoogde ROS niveaus of mitochondriale dysfunctie zijn waargenomen na behandeling met type 1 HIV protease remmers, zij het in afzonderlijke experimenten 19 , ...

<html> De concentratie van intracellulaire ROS wordt nauwgezet gereguleerd door een dynamisch wisselwerking tussen ROS-producerende en ROS-defusing systemen. Onevenwicht tussen de twee veroorzaakt een staat van oxidatieve stress. Onder de belangrijkste bronnen van ROS zijn mitochondriën 1 . Gezien hun rol in cellulaire ademhaling, zijn ze verantwoordelijk voor het grootste deel van intracellulaire superoxide (O 2 • - ) moleculen 2 . Dit komt voornamelijk uit elektronleklek op O2 bij complex 1 van de elektron transportketting onder omstandigheden van sterk negatief innerlijk mitochondriaal membraanpotentieel (ψψ m ), dat wil zeggen mitochondriale hyperpolarisatie. Aan de andere kant is mitochondriale depolarisatie ook gecorreleerd met verhoogde ROS-productie die wijst op meerdere werkingsmethoden 3 , 4 , 5 ,&gt; 6 , 7 , 8 . Door middel van redoxmodificaties in eiwitten van de splitsingsfusie-machines coördineren ROS de mitochondriale morfologie 9. Bijvoorbeeld, fragmentatie is gecorreleerd met verhoogde ROS-productie en apoptose 10 , 11 , terwijl filamente mitochondriën zijn gekoppeld aan voedingshongersnood en bescherming tegen Mitofagie 12 . Gezien de ingewikkelde relatie tussen cellulaire ROS en mitochondriale morfofunctie, zouden beide ideaal gelijktijdig in levende cellen gekwantificeerd moeten worden. Om dit precies te doen, werd een hoogwaardige beeldbepalingstest ontwikkeld op basis van geautomatiseerde widefieldmicroscopie en beeldanalyse van aanhechtende celculturen die gekleurd zijn met de fluorescerende probes CM-H 2 DCFDA (ROS) en TMRM (mitochondriale Δψ m en morfologie). High-content beeldvorming verwijst naar de extractie van spAtiotemporally rich ( dat wil zeggen een groot aantal beschrijvende eigenschappen) informatie over cellulaire fenotypen met behulp van meerdere complementaire markers en geautomatiseerde beeldanalyses. In combinatie met geautomatiseerde microscopie kunnen veel monsters parallel worden gescreend ( dwz hoge doorvoer), waardoor de statistische kracht van de test wordt verhoogd. Inderdaad, een belangrijk voordeel van het protocol is dat het gelijktijdige kwantificering van meerdere parameters in dezelfde cel mogelijk maakt, en dit voor een groot aantal cellen en condities. Het protocol is verdeeld in 8 delen (in detail beschreven in het protocol hieronder): 1) Zaadcellen in een 96-putjesplaat; 2) Bereiding van voorraadoplossingen, werkoplossingen en afbeeldingsbuffer; 3) Opstelling van de microscoop; 4) Laden van de cellen met CM-H2 DCFDA en TMRM; 5) Eerste live imaging ronde om basale ROS niveaus en mitochondriale morphofunction te meten; 6) Tweede live imaging ronde na toevoeging van tert -butylPeroxide (TBHP) om geïnduceerde ROS niveaus te meten; 7) Automatische beeldanalyse; 8) Gegevensanalyse, kwaliteitscontrole en visualisatie. De test werd oorspronkelijk ontwikkeld voor normale humane dermale fibroblasten (NHDF). Aangezien deze cellen groot en plat zijn, zijn ze goed geschikt voor het beoordelen van mitochondriale morfologie in 2D breedbeeldbeelden 13 , 14 . Echter, met kleine wijzigingen, is deze methode van toepassing op andere aanhechtende celtypes. Bovendien, naast de combinatie van CM-H 2 DCFDA en TMRM, voldoet de workflow aan een verscheidenheid aan fluorescerende kleurstofparen met verschillende moleculaire specificaties 1 , 15 .

<table><tbody><tr><td>Reagenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchloraat (TMRM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA (Algemene oxidatieve stressindicator)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C6827</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma)Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>MatriPlate 96-Well Glasbodem MicroWell Plate 630 &micro;L-Zwart 0,17 mm Lage Glazen Deksel</td><td>Brooks life science systems</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS zonder Fenol Rood 500 mL</td><td>Lonza</td><td>BE10-527F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM hoge glucose met L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline (PBS) zonder Ca en Mg</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 500 mL</td><td>Lonza</td><td>17-737F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-Versene (EDTA) Oplossing</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Ezel Anti-Konijn IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-166-152</td><td>Antilichaam gebruikt voor het verkrijgen van flat-field beeld</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Ezel Anti-Konijn IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-546-152</td><td>Antilichaam gebruikt voor het verkrijgen van flat-field beeld</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti eclipse widefield microscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfect Focus System (PFS)</td><td>Nikon</td><td></td><td>hardware-gebaseerde autofocus systeem</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 20X objectief</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 met JOBS module</td><td>Nikon</td><td></td><td>Deze software wordt gebruikt om de microscoop te besturen en het automatische beeldacquisitieprotocol te programmeren/uit te voeren</td></tr><tr><td>ImageJ (FIJI) Versie 2.0.0-rc-43/1.50g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RStudio Versie 1.0.44</td><td>Rstudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R versie 3.3.2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cellular redox profiling met high-content microscopy

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) regelen essentiële cellulaire processen, waaronder genuitdrukking, migratie, differentiatie en proliferatie. Overmatige ROS-niveaus veroorzaken echter een toestand van oxidatieve stress, die gepaard gaat met onomkeerbare oxidatieve schade aan DNA, lipiden en eiwitten. Zo geeft kwantificering van ROS een directe proxy voor cellulaire gezondheidstoestand. Aangezien mitochondriën tot de belangrijkste cellulaire bronnen en doelstellingen van ROS behoren, is gezamenlijke analyse van mitochondriale functie en ROS-productie in dezelfde cellen van cruciaal belang voor het beter begrijpen van de interconnectie in pathofysiologische omstandigheden. Daarom is een microscopie gebaseerde strategie ontwikkeld voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS niveaus, mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨ m ) en mitochondriale morfologie. Het is gebaseerd op geautomatiseerde widefield fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse van levende aanhechtende cellen, gegroeid in platen met meerdere putjes en staineD met de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen CM-H 2 DCFDA (ROS) en TMRM (ΔΨ m en mitochondriale morfologie). In tegenstelling tot fluorimetrie of flowcytometrie, kan deze strategie kwantificering van subcellulaire parameters op het niveau van de individuele cel met hoge spatiotemporale resolutie, zowel voor als na experimentele stimulatie. Belangrijk is dat de beeldgebaseerde aard van de werkwijze het mogelijk maakt om morfologische parameters te extraheren naast signaalintensiteiten. De gecombineerde funktieset wordt gebruikt voor exploratieve en statistische multivariate data-analyse om verschillen tussen subpopulaties, celtypes en / of behandelingen te detecteren. Hier wordt een gedetailleerde beschrijving van de analyse verstrekt, samen met een voorbeeld-experiment dat zijn potentieel voor ondubbelzinnige discriminatie tussen cellulaire staten bewijst na chemische verstoring.

De test is getest met behulp van verschillende controle experimenten, waarvan de resultaten worden beschreven in Sieprath et al. 1 . In het kort is de fluorescentie reactie van CM-H2 DCFDA en TMRM op extrane geïnduceerde veranderingen in respectievelijk intracellulaire ROS en Δψm , gekwantificeerd om het dynamische bereik te bepalen. Voor CM-H 2 DCFDA vertoonde NHDF een lineaire toename in fluorescentiesignaal wanneer behandeld met t...

In dit artikel wordt een microscopie-werkstroom voor hoge inhoud voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus aangeboden, evenals mitochondriale membraanpotentiaal en morfologie - gezamenlijk aangeduid als mitochondriale morfofunctie - in levend aanhechtende cellen met behulp van de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen 5- (en- 6) -chloormethyl-2 &#39;, 7&#39;-dichloordihydrofluoresceendiacetaat, acetylester (CM-H2 DCFDA) en tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Het algemene doel van deze op high-content microscopie gebaseerde methode is om gelijktijdig de mitochondriale morfo-functie en de cellulaire niveaus van reactieve zuurstofspecies te kwantificeren, teneinde een robuuste redox-vingerafdruk vast te stellen voor cellijnen die zijn blootgesteld aan verschillende experimentele verstoringen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de redoxbiologie, zoals of pathogene condities of behandeling met verbindingen oxidatieve stress veroorzaken en in welke mate de mitochondriale vorm en functie worden beïnvloed. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat alle parameters gelijktijdig in dezelfde cel kunnen worden gemeten.Om de procedure te starten, zaait u 8.000 tot 10.000 humane dermale fibroblasten in 60 binnenputjes van een zwarte 96-wellplaat met een dunne, doorlopende bodem van polystyreen of glas. Verdeel bij het gebruik van verschillende condities, behandelingen of cellijnen de zaailocaties homogeen over de plaat om plaaiteffecten te minimaliseren. Zaai vervolgens nog eens 8.000 tot 10.000 cellen in putje B01 om te gebruiken voor de focusinstelling.Vul vervolgens de lege buitenste putjes met medium om de gr

cellular-redox-profiling-using-high-content-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Reactive oxygen species niveau wordt verhoogd wanneer de cellen tegenkomen stress. Hier laten we het voorbeeld van 3'-3 'diaminobenzidine vlekken en cysTMT etikettering en massaspectrometrie om de redox proteoom profileren...

Profilering Thiol Redox Proteome Met behulp van Isotope Tagging massaspectrometrie

Source: Katsalifis, A., et al. Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the imaging of mitochondrial redox state in primary neurons using a ratiometric fluorescent indicator. By applying two excitation wavelengths under a fluorescence microscope, the fluorescence intensity ratio is measured to assess mitochondrial oxidation. The protocol includes N-methyl-D-aspartate (NMDA) stimulation...

Imaging the Mitochondrial Redox State in Primary Neurons Using a Ratiometric Indicator

Dit manuscript beschrijft het gebruik van genetisch-gecodeerde fluorogenic verslaggevers in een toepassing voor live-cel imaging voor de behandeling van xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. Deze experimentele aanpak biedt ongeëvenaarde Spatio resolutie, gevoeligheid en specificiteit terwijl het vermijden van veel van de tekortkomingen van conventionele methoden voor de detectie van toxicologische oxidatieve stress.

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

Hier presenteren we een protocol om de totale cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFH-DA). Deze methode kan cellulaire ROS lokalisatie visualiseren in aanhangende cellen met een fluorescentiemicroscoop en ros intensiteit kwantificeren met een fluorescentieplaatlezer. Dit protocol is eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief.

Detectie van totale reactieve zuurstofsoorten in aanhangende cellen door 2',7'-Dichloododihydrofluorescein Diacetate Kleuring

Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.

Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

We beschrijven protocollen voor het meten van pH, oxidatieve gebeurtenissen en eiwitvertering in individuele macropinosomen in levende cellen. De nadruk wordt gelegd op dual-fluorofoor ratiometrische microscopie en de voordelen die het biedt ten opzichte van populatiegebaseerde technieken.

Het meten van de pH, redoxchemie en degradatieve capaciteit van macropinosomen met behulp van dual-fluorofoor ratiometrische microscopie

Dit artikel beschrijft een protocol om verschillen in basale redoxtoestand en redoxresponsen op acute verstoringen in primaire hippocampus- en corticale neuronen te bepalen met behulp van confocale levende microscopie. Het protocol kan met minimale aanpassingen worden toegepast op andere celtypen en microscopen.

Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator

Dit protocol beschrijft fluorescentiebeeldvorming en analyse van de endogene metabole co-enzymen, gereduceerd nicotinamide-adenine (fosfaat) dinucleotide (NAD (P) H) en geoxideerd flavine-adenine dinucleotide (FAD). Autofluorescentie beeldvorming van NAD(P)H en FAD biedt een labelvrije, niet-destructieve methode om het cellulaire metabolisme te beoordelen.

Autofluorescentie beeldvorming om cellulair metabolisme te evalueren

Hier stellen we een gesystematiseerd, toegankelijk en reproduceerbaar protocol voor om cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in Müller gliacellen (MGC's). Deze methode kwantificeert de totale cellulaire ROS-niveaus met een flowcytometer. Dit protocol is zeer eenvoudig te gebruiken, geschikt en reproduceerbaar.

Kwantificering van reactieve zuurstofsoorten met behulp van 2′,7′-dichlorofluoresceïnediacetaatsonde en flowcytometrie in Müller-gliacellen

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren met behulp van dihydroethidium (DHE) als fluorescentiekleurstofsonde met behulp van een high-throughput screeningbenadering. Het protocol beschrijft de methoden voor kwantitatieve beoordeling van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de drie verschillende hepatocellulaire carcinoomcellijnen.

High Throughput Screening Assessment van het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof

Door gebruik te maken van een multimodaal platform dat labelvrije optische beeldvormingsmodaliteiten combineert, hebben we een protocol ontwikkeld voor het visualiseren en kwantificeren van cellulaire dynamiek en metabolisme. Door middel van beeldvorming via multifotonfluorescentie, tweede harmonische generatie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kunnen we een holistisch overzicht van de cellulaire en moleculaire omgeving genereren.

Multimodaal optisch beeldvormingsplatform voor het bestuderen van cellulair metabolisme

Leer hoe je met high-content microscopy tegelijkertijd ROS-niveaus en mitochondriële morfofunctie kwantificeert in levende adherente cellen. Deze methode maakt robuuste redox-profiling mogelijk voor celbiologisch onderzoek.

Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy

Meer video's verkennen