Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy

Het algemene doel van deze op high-content microscopie gebaseerde methode is om gelijktijdig de mitochondriale morfo-functie en de cellulaire niveaus van reactieve zuurstofspecies te kwantificeren, teneinde een robuuste redox-vingerafdruk vast te stellen voor cellijnen die zijn blootgesteld aan verschillende experimentele verstoringen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de redoxbiologie, zoals of pathogene condities of behandeling met verbindingen oxidatieve stress veroorzaken en in welke mate de mitochondriale vorm en functie worden beïnvloed. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat alle parameters gelijktijdig in dezelfde cel kunnen worden gemeten.

Om de procedure te starten, zaait u 8.000 tot 10.000 humane dermale fibroblasten in 60 binnenputjes van een zwarte 96-wellplaat met een dunne, doorlopende bodem van polystyreen of glas. Verdeel bij het gebruik van verschillende condities, behandelingen of cellijnen de zaailocaties homogeen over de plaat om plaaiteffecten te minimaliseren. Zaai vervolgens nog eens 8.000 tot 10.000 cellen in putje B01 om te gebruiken voor de focusinstelling.

Vul vervolgens de lege buitenste putjes met medium om de gradiënten tussen de putjes en de omgeving te minimaliseren. Tik zachtjes drie keer op de plaat voordat u deze terugplaatst in de incubator om te voorkomen dat de cellen in platen groeien. Kweek de cellen gedurende 24 uur, of totdat ze een confluentie van 70% bereiken.

Sla vervolgens de behandelingsinformatie voor het experiment op in een spreadsheet genaamd setup. Calibreer voor de installatie van de microscoop eerst de XY-tafel met behulp van de software. Maak daarna een beeldvormingsprotocol voor een multi-wellplaat aan met de acquisitiesoftware.

Dit protocol maakt de automatische acquisitie van ingestelde posities en geselecteerde putjes van een 96-wellplaat mogelijk. Selecteer nu het juiste type multi-wellplaat uit een lijst met beschikbare platen die in de software wordt aangeboden. Definieer alternatief het formaat van de multi-wellplaat met behulp van de afmetingen van de plaat en de putjes.

Lijn vervolgens de wellplaat uit door twee hoeken van de vier buitenste hoekwells te definiëren. Selecteer daarna de wells die moeten worden vastgelegd en definieer een acquisitieprotocol dat bestaat uit een sequentiële golflengteacquisitie. Zorg ervoor dat het GFP-kanaal als eerste is ingesteld.

Definieer vervolgens een wellplate-lus om vier regelmatig verdeelde, niet-overlappende beelden te verkrijgen die rond het centrum van elke geselecteerde well zijn gepositioneerd met behulp van het gedefinieerde acquisitieprotocol. Bereid in deze stap de kleuringsoplossing voor 60 wells voor door CM-H2DCFDA en TMRM-stamoplossing toe te voegen aan HBSS HEPES-buffer. Verwijder vervolgens het kweekmedium van de cellen door de plaat in één vloeiende beweging omgekeerd te houden.

Was de cellen voorzichtig twee keer met HH-buffer. Vergeet well A01 niet, met de cellen die voor de focusinstelling zijn gebruikt. Verwijder de HH-buffer tussen de wasstappen door.

Laad vervolgens de cellen met CM-H2DCFDA en TMRM door 100 µL van de kleuringsoplossing aan elke well toe te voegen. Vergeet hierbij opnieuw well A01 niet. Incubeer de cellen gedurende 25 minuten in het donker bij kamertemperatuur.

Was na 25 minuten de cellen tweemaal met 100 µL HH-buffer en voeg 100 µL HH-buffer toe aan alle 60 binnenwells. Plaats de plaat in de microscoop om de eigenlijke meting uit te voeren. Zet vervolgens het hardwarematige autofocus-systeem aan en stel de autofocus-offset in met behulp van well B01 en het TMRM-kanaal totdat er een scherp beeld wordt verkregen.

Voer vervolgens het imaging-protocol uit. De resulterende dataset met beelden zal informatie verschaffen over de basale ROS-niveaus, het mitochondriale membraanpotentiaal en de mitochondriale morfologie. Verwijder daarna, om de geïnduceerde ROS-niveaus te meten, voorzichtig de 96-wells plaat uit de microscoop.

Voeg 100 µL TBHP-oplossing met een concentratie van 40 µM toe aan elke put en wacht ten minste drie minuten om volledige reactie van het TBHP met het CM-H2DCFDA mogelijk te maken. Voeg tijdens deze tijd 100 µL van de werkoplossing van het antilichaam toe aan put A01. Plaats de plaat nu terug op de microscoop en controleer de focus opnieuw met behulp van put B01.

Verkrijg vervolgens dezelfde posities als in de eerste imagingsronde met behulp van hetzelfde imagingprotocol. De resulterende set beeldgegevens zal informatie verschaffen over de geïnduceerde ROS-niveaus. Verkrijg daarna flat-fieldbeelden in well A01.

Zorg ervoor dat de signalen ruim binnen het dynamische bereik vallen door de acquisitie-instellingen aan te passen. Exporteer vervolgens de verkregen datasets in één enkele map als individuele TIFF-bestanden met behulp van een gestandaardiseerde nomenclatuur.

Dit omvat een referentie naar de plaat, vóór of na TBHP-behandeling, de put, het veld en het kanaal, gescheiden door underscores. Bewaar daarnaast de flat-field afbeeldingen in dezelfde map als afzonderlijke TIFF-bestanden met behulp van de gestandaardiseerde nomenclatuur. Open in deze stap de software voor beeldbewerking en installeer de redox metrics macroset.

Open vervolgens de instellingeninterface door op de S-knop te klikken om de analyse-instellingen te configureren. Selecteer het beeldtype, het aantal kanalen en de well die is gebruikt voor het verkrijgen van de flat-field beelden. Geef daarna aan welk kanaal cellen of mitochondria bevat.

Vink de vakjes voor achtergrondcorrectie en verbetering aan om respectievelijk achtergrondsubtractie en contrastbeperkte adaptieve histogramequalisatie uit te voeren. Definieer vervolgens een sigma voor de Gaussische vervaging van de cellen en de Laplacian-verbetering van de mitochondriën. Selecteer een automatisch drempelwaarde-algoritme en vul de limieten voor grootte-exclusie in.

Test vervolgens de segmentatie-instellingen op een paar geselecteerde afbeeldingen van de verworven datasets door deze te openen en in het menu respectievelijk op de C- of M-knoppen te klikken voor cel- of mitochondriële segmentatie. Voer daarna de batchanalyse uit op de betreffende map door op de hash-knop te klikken en de map met de afbeeldingen te selecteren. Controleer de instellingen en druk op oké.

Verifieer na de batchanalyse visueel de segmentatieprestaties op een verificatiestack door op de V-knop te klikken en de map met afbeeldingen te selecteren. Loop door de verificatiestack om te bevestigen of de segmentatie succesvol was. De initiële analyse van de geëxtraheerde gegevens wordt automatisch uitgevoerd met een bijbehorende Shiny-applicatie.

Dit maakt een snelle interpretatie van de resultaten mogelijk. Open ter begin de applicatie in R Studio. Kies ervoor om deze in een externe browser uit te voeren.

Select op de invoerpagina de map waarin de resultaatbestanden zich bevinden. Zorg ervoor dat het configuratiebestand ook in deze map aanwezig is. De resultaatbestanden en de configuratie-informatie worden automatisch geïmporteerd, gecompileerd en gevisualiseerd.

De pagina met de experimentele opstelling toont de indeling van het experiment. De volgende pagina geeft de ROS-niveaus en verschillende mitochondriale parameters voor elke plaat afzonderlijk weer. Selecteer de plaat die u wilt visualiseren via het vervolgkeuzemenu.

De gegevens worden weergegeven in een multi-wellplaatformaat, alsook in boxplots waarbij uitschieters zijn gelabeld met het well- en afbeeldingnummer. De pagina met resultaten van het gehele experiment toont de genormaliseerde resultaten van alle gecombineerde platen, samen met een basisstatistische analyse. Indien er via de invoerpagina een drop-bestand wordt aangeleverd, worden de gespecificeerde datapunten uitgesloten.

Op de pagina voor clusteranalyse wordt een gevoelig redoxprofiel samengesteld met behulp van een hoofdcomponentenanalyse op basis van gegevens van vijf parameters. Ten slotte maakt de pagina voor gegevensdownload het mogelijk om de verwerkte en herschikte gegevens op te slaan voor verder gebruik. Hier worden de resultaten getoond van een experiment waarin humane dermale fibroblasten werden behandeld met de HIV-proteaseremmer Saquinavir.

Met gebruik van het beschreven protocol werd een significante toename gedetecteerd voor zowel de basale als de geïnduceerde ROS-niveaus, in vergelijking met de controlecellen die met DMSO waren behandeld. Saquinavir had daarnaast een significant effect op de mitochondriale morfofunctie.

Het mitochondriale membraanpotentiaal, gemeten als het gemiddelde TMRM-signaal per mitochondriale pixel, nam significant toe. Daarnaast vertoonden de mitochondriën een sterk gefragmenteerd patroon, wat kwantitatief werd aangetoond door een hogere circulariteit en een kleinere gemiddelde grootte van individuele mitochondriën. Bij het combineren van de bovengenoemde parameters middels principale componentenanalyse konden zowel de controleconditie als de Saquinavir-conditie duidelijk van elkaar worden onderscheiden op basis van hun redox-vingerafdrukken.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de belichting zelf oxidatieve stress veroorzaakt. Daarom moeten de blootstellingscondities worden geminimaliseerd en gedurende het hele experiment constant worden gehouden. Zodra de methode onder controle is, kunnen er tot 20 platen van 96 wells op één dag worden gekleurd en vastgelegd.

Na de tweede imagiserond kunnen de cellen worden gefixeerd en gebruikt voor een daaropvolgende immunofluorescentiekleuring. Dit verhoogt het aantal gemeten parameters op exact dezelfde cellen en maakt het mogelijk om aanvullende vragen te beantwoorden. Na het bekijken van deze video moet u in staat zijn om de gecombineerde metingen van ROS en mitochondriale morfofunctie in adherente celculturen uit te voeren met behulp van high-content microscopie.