Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy
May 14th, 2017
In dit artikel wordt een microscopie-werkstroom voor hoge inhoud voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus aangeboden, evenals mitochondriale membraanpotentiaal en morfologie - gezamenlijk aangeduid als mitochondriale morfofunctie - in levend aanhechtende cellen met behulp van de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen 5- (en- 6) -chloormethyl-2 ', 7'-dichloordihydrofluoresceendiacetaat, acetylester (CM-H2 DCFDA) en tetramethylrhodamine methylester (TMRM).
Het algemene doel van deze op hoogwaardige microscopie gebaseerde methode is om gelijktijdig de morfofunctie van mitochondriën en de cellulaire niveaus van reactieve zuurstofsoorten te kwantificeren om een robuuste redox-vingerafdruk vast te stellen voor cellijnen die zijn blootgesteld aan verschillende experimentele verstoringen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in redoxbiologie, zoals of pathogene omstandigheden of verbindingsbehandelingen oxidatieve stress veroorzaken en in welke mate mitochondriële vorm en functie worden beïnvloed. Het grote voordeel van deze techniek is dat alle parameters tegelijkertijd in dezelfde cel kunnen worden gemeten.
Om de procedure te starten, zaai acht tot 10.000 menselijke dermale fibroblasten in 60 binnenste putjes van een zwarte 96-putjesplaat met een dunne continue polystyreen- of glazen bodem. Wanneer verschillende omstandigheden, behandelingen of cellijnen worden gebruikt, verdeel hun zaai-locaties homogeen over de plaat om de plaateffecten te minimaliseren. Zaai vervolgens nog eens acht tot 10.000 cellen in put B01 om te worden gebruikt voor focusaanpassing.
Vervolgens vult u de lege buitenste putjes met medium om de gradiënten tussen de putjes en de omgeving te minimaliseren. Tik voorzichtig drie keer op de plaat voordat u deze terug in de incubator plaatst om te voorkomen dat de cellen in patches groeien. Kweek de cellen gedurende 24 uur of tot ze 70% confluency bereiken.
Bewaar daarna de behandelingsinformatie voor het experiment in een spreadsheet genaamd setup. Om de microscoop in te stellen, kalibreert u eerst de XY-stage met behulp van de software. Maak vervolgens een beeldprotocol voor een multi-putjesplaat met behulp van de acquisitiesoftware.
Dit protocol maakt automatische acquisitie mogelijk van ingestelde posities en geselecteerde putjes van een 96-putjesplaat. Selecteer nu het juiste type multi-putjesplaat uit een lijst met beschikbare platen die binnen de software wordt aangeboden. U kunt ook het formaat van de multi-putjesplaat definiëren met behulp van de plaat- en putafmetingen.
Vervolgens lijnt u de putjesplaat uit door twee hoeken van de vier buitenste hoekputjes te definiëren. Selecteer daarna de putjes die moeten worden verkregen en definieer een acquisitieprotocol bestaande uit een sequentiële golflengteaquisitie. Zorg ervoor dat de GFP-kanaal eerst is ingesteld.
Vervolgens definieert u een putjesplaatloop om vier regelmatig gespreide niet-overlappende afbeeldingen te verkrijgen die zijn gepositioneerd rond het centrum van elk geselecteerd putje met behulp van het gedefinieerde acquisitieprotocol. Bereid in deze stap de kleuringsoplossing voor voor 60 putjes door CM-H2DCFDA en TMRM-voorraadoplossing toe te voegen aan HBSS HEPES-buffer. Gooi vervolgens het kweekmedium van de cellen af door de plaat in een vloeiende beweging ondersteboven te draaien.
Was de cellen voorzichtig twee keer met HH-buffer. Vergeet put A01 met de cellen die voor focusaanpassing worden gebruikt niet. Gooi de HH-buffer weg tussen de wasstappen door.
Laad vervolgens de cellen met CM-H2DCFDA en TMRM door 100 microliter van de kleuringsoplossing aan elke put toe te voegen. Vergeet weer put A01 niet. Incubeer de cellen gedurende 25 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
Na 25 minuten, was de cellen twee keer met 100 microliter HH-buffer en voeg 100 microliter HH-buffer toe aan alle 60 binnenste putjes. Om de werkelijke meting uit te voeren, installeert u de plaat op de microscoop. Schakel vervolgens het op autofocus gebaseerde hardwaresysteem in en pas de autofocus-offset aan met behulp van put B01 en het TMRM-kanaal totdat u een scherpe afbeelding hebt.
Voer vervolgens het beeldprotocol uit. De resulterende beeldgegevensset zal informatie verschaffen over basale ROS-niveaus, mitochondriaal membraanpotentiaal en mitochondriale morfologie. Om vervolgens de geïnduceerde ROS-niveaus te meten, verwijdert u voorzichtig de 96-putjesplaat van de microscoop.
Voeg 100 microliter TBHP-oplossing toe bij 40 micromolar aan elke put en wacht minimaal drie minuten om de volledige reactie van de TBHP met de CM-H2DCFDA mogelijk te maken. Voeg gedurende deze tijd 100 microliter van de antilichaamwerkoplossing toe aan put A01. Monteer nu de plaat terug op de microscoop en controleer de focus opnieuw met behulp van put B01.
Verkrijg vervolgens dezelfde posities als in de eerste beeldacquisitieronde met behulp van hetzelfde beeldacquisitieprotocol. De resulterende beeldgegevensset zal informatie verschaffen over de geïnduceerde ROS-niveaus. Verkrijg vervolgens platte veldafbeeldingen in put A01.
Zorg ervoor dat de signalen binnen het dynamische bereik vallen. Pas de acquisitie-instellingen aan. Exporteer vervolgens de verkregen gegevenssets in een enkele map als individuele TIFF-bestanden met behulp van gestandaardiseerde nomenclatuur.
Dat omvat verwijzingen naar de plaat, voor of na TBHP-behandeling, put, veld en kanaal gescheiden door underscores. Bewaar ook de platte veldafbeeldingen in dezelfde map als individuele TIFF-bestanden met behulp van de gestandaardiseerde nomenclatuur. Open in deze stap de beeldverwerkingssoftware en installeer redox-metriek macroset.
Open vervolgens de setup-interface om de analyse-instellingen in te stellen door op de S-knop te klikken. Selecteer het beeldtype, het aantal kanalen en de put die werd gebruikt voor het verkrijgen van de platte veldafbeeldingen. Geef vervolgens aan welk kanaal cellen of mitochondriën bevat.
Vink de aanvinkvakjes voor achtergrond en verbeteren aan om respectievelijk achtergrondsubtractie en contrastbeperkte adaptieve histogram-gelijkmaking uit te voeren. Definieer vervolgens een sigma voor Gaussiaanse en vervaging van de cellen en laplaciaanse verbetering van mitochondriën. Selecteer een automatische drempelalgoritme en vul de grootte-uitsluitingslimieten in.
Test vervolgens de segmentatie-instellingen op een paar geselecteerde afbeeldingen van de verkregen gegevenssets door ze te openen en de C- of M-knoppen in het menu te klikken voor respectievelijk cel- of mitochondria-segmentatie. Klik vervolgens vanuit de batchanalyse op de map van
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit document presenteert een high-content microscopy workflow voor de gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus en mitochondriale morfofunctie in levende aderente cellen. De methode gebruikt celdoorlatende fluorescente reportermoleculen om dit te bereiken.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Redoxbiologie
Achtergrond
- Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een cruciale rol in cellulaire signalering en homeostase.
- Mitochondriale functie is nauw verbonden met oxidatieve stress en cellulaire gezondheid.
- Inzicht in mitochondriale morfofunctie kan inzicht bieden in verschillende pathologische aandoeningen.
- High-content microscopy maakt gedetailleerde analyse van cellulaire parameters in real-time mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om een robuust redoxvingerafdruk te vestigen voor cellijnen onder verschillende experimentele omstandigheden.
- Om de effecten van pathogene omstandigheden of behandelingen op oxidatieve stress te onderzoeken.
- Om mitochondriale vorm en functie gelijktijdig binnen dezelfde cel te meten.
Gebruikte methoden
- High-content microscopy workflow voor het kwantificeren van ROS en mitochondriale parameters.
- Gebruik van fluorescente reportermoleculen CM-H2DCFDA en TMRM.
- Aanleggen van humane dermale fibroblasten in een 96-wellplaat voor analyse.
- Focusaanpassing met behulp van een aparte celpopulatie in het experiment.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt gelijktijdige meting van ROS-niveaus en mitochondriale functie mogelijk.
- Het biedt inzicht in hoe verschillende behandelingen cellulaire oxidatieve stress beïnvloeden.
- Alle parameters kunnen binnen dezelfde cel worden beoordeeld, waardoor de betrouwbaarheid van de gegevens wordt verbeterd.
- Stelt een kader op voor toekomstige studies in redoxbiologie.
Conclusies
- Deze high-content microscopy method is effectief voor het bestuderen van mitochondriale morfofunctie.
- Het kan helpen de relatie tussen oxidatieve stress en mitochondriale gezondheid te verduidelijken.
- De aanpak is waardevol voor onderzoekers die redoxbiologie in verschillende contexten onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This high-content microscopy method enables simultaneous quantification of intracellular ROS levels and mitochondrial morphofunction, providing a robust redox fingerprint for cellular health assessment. By measuring multiple parameters within the same cell, it enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking during early discovery. The approach supports data-driven go/no-go decisions by linking oxidative stress responses to mitochondrial function in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by establishing redox fingerprints that differentiate cellular states after chemical perturbation.
- Operational Value: Enables functional target validation through correlated ROS and mitochondrial membrane potential measurements in live cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by detecting subpopulation heterogeneity via multivariate analysis of ROS, mitochondrial morphology, and membrane potential.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows using automated widefield fluorescence microscopy in multi-well plates.
- Quantitative Outputs: Delivers high spatiotemporal resolution data on basal and induced ROS levels, mitochondrial membrane potential, and morphology for compound screening.
- Platform Reuse: Enables scalable, reproducible screening campaigns with standardized image acquisition and analysis protocols across cell lines and treatments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses human dermal fibroblasts to model oxidative stress responses, providing a translatable system for preclinical target validation.
- Mechanistic De-risking: Links compound-induced ROS elevation to mitochondrial fragmentation and membrane potential changes, clarifying pathophysiological interconnections.
- Translational Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by generating multivariate redox profiles that correlate with cellular health outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling mechanistic de-risking before preclinical investment by establishing causal links between redox state and mitochondrial function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how pathogenic conditions or treatments affect oxidative stress and mitochondrial form/function in the same cell.
- Screening: Delivers assay readiness through automated acquisition of ROS and mitochondrial parameters, ensuring reproducible quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of conditions via principal component analysis on five parameters, generating sensitive redox profiles for subpopulation discrimination.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by aligning redox fingerprints with mitochondrial morphofunction changes relevant to pathological conditions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for redox profiling across diverse adherent cell types, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through simultaneous ROS and mitochondrial measurement.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via automated microscopy and standardized image analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking oxidative stress biomarkers to mitochondrial health, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through multivariate redox profiling that detects treatment-induced cellular state changes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-content microscopy, fluorescent probe handling, and image-based data analysis.
- Needs widefield fluorescence microscopy with environmental control, autofocus, and multi-well plate compatibility.
- Demands cross-team standardization of staining protocols, acquisition settings, and analysis macros for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for non-adherent or primary cell types beyond human dermal fibroblasts.
- Includes practical limitations such as phototoxicity from illumination, necessitating minimized and constant exposure conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
10:38
Conclusion
9:35
Results: Effect of Saquinavir on Primary Human Fibroblasts
0:47
Seeding Cells in a 96-well Plate
1:48
Setting Up the Microscope and Acquisition Protocol
3:10
Loading of the Cells with CM-H2DCFDA and TMRM
4:18
First and Second Live Imaging Rounds
6:22
Image Processing and Analysis
