Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

Het algemene doel van dit protocol is om het hart van een muis chemisch te ontdoen, met een geïnduceerde hartritmestoornis voor een visuele weergave van het hele orgaan van het leukocyten hartinfiltraat door Fluorescerende Lichtblad Microscopie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van hele orgaanonderzoek over prothesen en structuren op cellulair niveau. Het grote voordeel van deze techniek is dat het zowel de kwantificering als de lokalisatie van ontsteking in hele organen mogelijk maakt.

Diepgaande inzichten geven in neurologische prothesen. We hadden het idee voor deze methode voor het eerst toen we dringend een visualisatietool nodig hadden om cellulaire verklaringen voor hartritmestoornissen in het depletiemodule te identificeren. Na het blootleggen van het hart van een muis van acht tot 10 weken oud, gebruik een 21 gauge katheter en penetreer het rechter ventrikel.

Snijd de aorta in om bloedafvoer mogelijk te maken en perfundeer vervolgens met vijf milliliter PBS plus EDTA, met een langzame constante druk. Volg de PBS EDTA met vijf milliliter van 4% paraformaldehyde. Aan het einde van de perfusie, gebruik getande forceps om het gefixeerde hart voorzichtig vast te pakken en trek het orgaan iets omhoog om alle weefselverbindingen door te snijden.

Inclusief de binnenkomende en uitgaande slagaders en aders. Bewaar vervolgens het hart vier uur in verse 4% PFA voor verdere fixatie. Om het weefsel te dehydrateren, incubeer het hart in een stijgende ethanolreeks, in zwarte vijf milliliter polypropyleen reactiebuizen in het donker, met constante langzame rotatie op een buisrotator, om luchtbellevorming te voorkomen.

Maak vervolgens het weefsel helder met een 98% dibenzyl ether incubatie met constante rotatie 's nachts. Om Lichtblad Fluorescerende Microscopie uit te voeren, plaats eerst gedehydrateerde agarose blokken in de standaard steekhouder, om het monster op zijn plaats te houden. Breng vervolgens het monster over naar de steekhouder.

Breng vervolgens de steekhouder over in een geschikt formaat dibenzyl ether gevulde cuvet. Gebruik de juiste excitatie en emissie filterinstellingen om de gewenste fluorescentiesignalen te detecteren. Dus correcte positionering en fixatie van het monster is fundamenteel om schaduweffecten tijdens beeldvorming te minimaliseren.

Bovendien kan een los specimen bewegende artefacten veroorzaken, die moeilijk te verlichten zijn tijdens nabewerking. Nadat alle beelden zijn vereist, opent u de geschikte 3D en 4D beeldverwerkingsanalysesoftware en selecteert u surpass. Kies bestand en open, en selecteer de map met de gegevens van het eerste verkregen kanaal om de beeldstacks te openen.

Selecteer bewerken en kanalen toevoegen, om de juiste verworven fluorescentiekanaalgegevens toe te voegen. Klik vervolgens op bewerken en selecteer afbeeldingseigenschappen om de x, y en z voxel dimensies te corrigeren. Pas de parameters aan in het nieuw geopende venster.

Om de fluorescentiesignalen aan te passen, opent u eerst het bewerkingsmenu en selecteert u, weergave aanpassing tonen. Een nieuw venster zal alle open kanalen weergeven. Om het autofluorescentiekanaal naar grijsschaal te wijzigen, selecteert u het autofluorescentiekanaal, kiest u de witte weergavestijl en klikt u op oké.

Vervolgens past u de weergave aan door het raster te verwijderen. Zoom vervolgens in en deselecteer een kanaal. Pas vervolgens de zwartniveauwaarde aan om ongewenste achtergrondsignalen die de monsterstructuren niet vertegenwoordigen, de signaalintensiteit en het contrast uit te sluiten.

Pas het antilichaamstandkanaal aan ten opzichte van het herziene autofluorescentiekanaal signaal. Stel de kanaalmodus in, vuur om de visualisatie van het antilichaam signaal in een heatmap kleurenlookuptabel te stellen. Selecteer vervolgens de mengmodus om de weefselstructuren in detail te visualiseren.

Om het orgaan virtueel open te snijden, voordat de 3D scène wordt geëxporteerd, selecteert u het knipvlaktepictogram in de objectenlijst. Een gele frame en een witte spindelmanipulator verschijnen in de beeldweergave. Gebruik de muis om de spindel aan het dunnere uiteinde te draaien om de oriëntatie van het knipvlakte te veranderen, en verplaats het dikkere middelste deel van de spindel om de gewenste knipdiepte te selecteren.

Vink vervolgens de respectieve selectievakjes uit om het frame en de manipulator te verbergen en de gewenste momentopnamen te maken. De verwerving van een hele beeldstack, bestaande uit twee fluorescentiekanaalsignalen, veroorzaakt een kunstmatige 3D weergave, waarin de leukocytenverdeling wordt weergegeven in een heatmap weergave. De sterk ontstoken gebieden van harten van een Diphtherie toxine behandeld dier kunnen worden waargenomen door hun roodachtige, witachtige uiterlijk.

Met name in de regio's van het hartgeleidingssysteem, zoals het atrium ventrikel bundje en de Purkinje vezels. In tegenstelling tot de harten van gecontroleerde PBS behandelde dieren, vertonen ze dit patroon van ontsteking niet. Eenmaal beheerst, maakt deze techniek de digitale klaar analyse van een doelorgaan mogelijk, vanaf het oogsten tot de computerondersteunde weergave in vier tot vijf dagen.

Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van emmenologie om cellulaire verdelingspatronen in hele muizenorganen te verkennen. Dit kan leiden tot de analyse en de behandeling van een verscheidenheid aan pathofysiologische ziekteprothesen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u hele muizenorganen kunt voorbereiden voor Fluorescerende Lichtblad Microscopie en hoe u 3D datastacks kunt genereren en verwerken.