Name: Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Leer een protocol voor het opsporen van DNA-besmetting in RNA-monsters met behulp van ribosomale DNA-primers. Deze methode verbetert de gevoeligheid van kwantitatieve real-time PCR voor eukaryote en prokaryote soorten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gesteund door de genetische en agrarische biotechnologie Instituut van Tabarestan (GABIT), Sari landbouwwetenschappen en natuurlijkehulpbronnen Universiteit (SANRU). De junior onderzoeksgroep abiotische Stress Genomics werd gefinancierd door IZN (Interdisciplinair Centrum voor gewas plantenonderzoek, Halle (Saale), Duitsland. Wij danken Rhonda Meyer voor kritische lezing van het manuscript.

Opmerking: Elke weefsel kan worden gebruikt.
1. nucleïnezuur extractie
<ol><li>100 mg weefselsteekproeven te zetten in een tube 2,0 mL, Voeg twee 5 mm roestvrij staal kralen en meng het weefsel bij 25-30 Hz voor 30 s (homogenisering duur en frequentie afhankelijk van weefseltype) voor zowel RNA en DNA.</li>
	<li>Isoleren totaal RNA volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Isoleren van totale DNA volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Bepalen de zuiverheid en de hoeveelheid van de RNA-monsters door het meten van de absorptie bij 260 en 280 nm.</li>
	<li>Bepalen de zuiverheid en de kwantiteit van de DNA-monsters door het meten van de absorptie bij 260 en 280 nm. Opmerking: Terwijl nucleïnezuren absorberen licht met een golflengte van 260 nm (A260), de absorptie van licht bij de golflengte 280 (A280) kan worden gebruikt voor het meten van de hoeveelheid eiwitten en fenolen aanwezig in het monster. Daarom kan de verhouding van A260/A280 nm worden gebruikt om te evalueren van de zuiverheid van DNA en RNA die uit het monster geëxtraheerd. A260/280 waarden in het bereik van ≥1.8 en > 2.0 worden over het algemeen beschouwd als "zuivere" voor DNA en RNA, respectievelijk. Lagere waarden van de A260/280 kunnen duiden op besmetting door eiwit of organische chemische stoffen.</li>
	<li>Test de kwaliteit van DNA door het uitvoeren van een 0,7% agarose gelelektroforese. Voorbereiding van de gel en uitgevoerd in 1 x TRIS-boorzuur EDTA-buffer (TBE: 89 mM Tris, boorzuur 89 mM en 2 mM EDTA) bij 100 V voor 30 min. hoge kwaliteit gDNA wordt weergegeven als een scherpe, hoog-moleculair-gewicht (HMW) band met geen uitstrijkjes in het bereik van laag molecuulgewicht (LMW) moleculen.</li>
	<li>Selectievakje geïsoleerd RNA voor kwantiteit, zuiverheid en integriteit onder denaturerende omstandigheden door een guanidine kaliumthiocyanaat (GTC) agarose gelelektroforese of door capillaire elektroforese chip, volgens de instructies van de fabrikant.<ol>
<li>Bereiden de GTC gel door toevoeging van 5 mM AV aan een standaard 1 x TBE 1% agarose gel na afkoeling van de agar tot 60 ° C. Opmerking: AV is giftig, dus afzien van het in een zuurkast en passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen.</li>
		<li>Bereiden van RNA denaturering laden buffer: 95% formamide, 10 mM EDTA pH 8.0, 0,1% bromophenol blauw, 0,1% xyleen cyanole en 10 µL ethidiumbromide. Opmerking: Formamide en ethidium bromide zijn giftig, en moet worden afgeleverd in een zuurkast.</li>
		<li>Laden 1-5 µg totaal RNA in RNA denaturering laden buffer, warmte het mengsel gedurende 5 minuten bij 70 ° C, plaatst u deze op het ijs alvorens het te laden op een gel, en weer RNA worden gescheiden op GTC gel bij 100 V voor 45 min. Load DNA of RNA molecuulgewicht marker als een standaard naast het monster van RNA.</li>
		<li>De gels met ethidiumbromide vlek en visualiseren van de bands met behulp van image capture systemen onder UV-licht. In eukaryoten, intact totaal RNA draaien op de denaturering voorwaarden zal het tonen van ten minste twee scherpe en heldere rRNA bands (28 en 18S) met een intensiteit van 2:1 ratio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijderen van sporen van gDNA door behandeling met DNase (DNase ik RNase-gratis). Toevoegen aan een RNase-gratis buis in 10 µL totale volume: 0,1 - 1 µg totaal RNA, één eenheid van DNase ik en 1 µL van 10 x reactie buffer met MgCl2. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Het beëindigen van de reactie door toevoeging van 1 µL van 50 mM EDTA en incuberen bij 65 ° C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Verwijder sporen van RNA uit extracten van de gDNA met behulp van DNase gratis RNase A, volgens protocol van de fabrikant. Voeg 5 µL van RNase 10 mg/mL tot het totale DNA en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h. extracten van de winkel RNA en DNA bij-80 ° C.</li>
</ol>2. primer Design van rDNA regio voor gDNA Assay
Opmerking: De volledige reeks van rDNA bevat twee regio's (ITS1 en ITS2), die in het volwassen rRNA molecuul worden verwijderd door een reeks van endonucleolytic breuklijnen en vervolgens afgebroken (Figuur 1).
<ol><li>De volgorde van de nucleotide rDNA ophalen NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) voor de soorten van belang. De beste sleutelwoorden voor het zoeken in de database is "interne getranscribeerde spacer."</li>
	<li>Ingang de doelgroep nucleotide sequentie in het zoeken van een BLASTn voor regio's vinden van interne getranscribeerde spacer regio's (ITS), SSU LSU bewaard.</li>
	<li>Selecteer inleidingen dat ofwel een reeks ITSs flank of die ITSs sequenties die niet aanwezig in de volwassen rRNA zijn versterken.<ol>
<li>Ontwerpen van inleidingen, de ITS1 of ITS2 opeenvolgingen flankerend: de geconserveerde gebieden van verschillende soorten door ClustalW uitlijnen. Ontwerp primers specifiek voor de begeleidende regio na taxa specifieke/Kruis-soorten analyse met AlleleID software. De twee primer paren uitdeinende SSU-5.8S en 5.8S-LSU waarbij kan worden ontworpen op basis van de flankerende gebieden van ITS1 en ITS2, respectievelijk. Omdat deze waarbij spanning in de hele regio ITS, de lengte van de amplicon zal worden verhoogd voor ten minste 300 bp in waarbij van gDNA. Deze stijging vermindert de gevoeligheid.<ol>
<li>Flankerende ITS1: Selecteer SSU en 5.8S rRNA volgorde. Geselecteerde inleidingen voor grassenfamilie zijn: SSU, SF: CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG, R: GGTTCACGGGATTCTGCAAT. Dit paar primer (SF: vooruit en R: omgekeerde) versterkt de gedeeltelijke regio van SSU, de gemiddelde lengte van ITS1 en de gedeeltelijke regio van 5.8S rDNA.</li>
			<li>Flankerende ITS2: Selecteer 5.8S en LSU volgorde. Geselecteerde inleidingen voor grassenfamilie zijn: F: ATTGCAGAATCCCGTGAACC LSU consensus volgorde, LR: TGCTTAAAYTCAGCGGGTAGYC. Dit paar primer versterkt de gedeeltelijke regio van 5.8S en de lengte van de ITS2, en de gedeeltelijke provincie LSU (Figuur 1). Opmerking: In het geval van primer ontwerp op basis van ITSs flankerende regio, de zeer geconserveerde gebieden van SSU, 5.8S en LSU werden geïdentificeerd. De voorwaartse en omgekeerde inleidingen van 5.8S rRNA werden ontworpen op basis van een geconserveerde motief in bedektzadigen14. De voorwaartse en omgekeerde inleidingen werden ontworpen gebaseerd op SSU en LSU geconserveerd regio's in de grassenfamilie, respectievelijk. Het verschil tussen SSU en LSU inleidingen voor elke soort is opgenomen in tabel 1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inleidingen een reeks ITSs frequentiebanden te versterken: In dit protocol, ontwerp ITS1 primers op basis van Aeluropus de volgorde (NCBI taxid nummer: 110873). Voor primers, gebruiken: vooruit: GGTATGGCGTCAAGGAACACT, Reverse: ATAGCATCGCTGCAAGAGGT. Volgens de waarbij gegenereerd door de primer paren in silico, moet de grootte variëren van 60 tot 200 bp. Dit is tevens het aanbevolen formaat voor qPCR analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kies de inleidingen bij het bestuderen van deze aanbevelingen: GC inhoud: 40-60%, primer lengte: 18-23 base, PCR product lengte: 60-160 bp (speciaal voor haar primer), smelttemperatuur (Tm): 60 ° C, de definitieve Tm voor beide inleidingen onderling geen verschillen meer dan 5 ° C en de prim ers zijn niet complementair is aan zichzelf of partner van inleidingen.</li>
	<li>Primer specificiteit en kopie nummer te controleren. In silico analyse van de geselecteerde primer volgorde uitvoeren door primer-blast programma (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).<ol>
<li>Open de pagina Primer-BLAST indienen. Voer beide primer sequenties in de sectie parameters primer van het formulier. In de primer paar specificiteit sectie parameters controleren, voer een naam van het organisme (of de naam van de groep van het organisme) en selecteer het genoom Database. Deze instellingen geven de specificiteit-informatie over de volgorde en primer uitkomstmaten met inbegrip van product lengte, positie op chromosoom, en nummer kopiëren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Voer qPCR stap voor de validatie van rDNA gebaseerde Primers met DNA-sjablonen
Opmerking: De functionaliteit van de ontworpen inleidingen moet worden gevalideerd door het uitvoeren van qPCR met behulp van gDNA als een sjabloon. Te voeren verschillende parallelle reacties en pipetting fouten verminderen, wordt de voorbereiding van een master mix aanbevolen. Voorbereiding voor een master mix, een volume gelijk is aan het totale aantal reactie mix plus ~ 10%.
<ol><li>Bereid een master mix door het mengen van alle onderdelen van de reactie met uitzondering van de DNA-sjabloon in de buis van een PCR-reactie. Upscale zo nodig uit een reactie voor te bereiden op de Master-mix: 5 µL SYBR groen (SYBR) master mix (2 x), 0,3 µL primer (0,3 µM elke voorwaartse en omgekeerde primer), en het uiteindelijke volume aan 10 µL met RNase-gratis water. Gebruik ongeveer ≤200 ng in 1 µL van sjabloon gDNA voor analyse. Opmerking: Ontdooien, assembleren en houden alle reagentia, componenten en reactie mixes op ijs.</li>
	<li>Aliquot de Master mix in een optische 96-wells-plaat. Pipetteer 1 µL van gDNA aan elk putje en vervolgens bedekken met optische plaat verzegeling film. Spin en breng in cycler.</li>
	<li>Uitvoeren van de bepaling van de qPCR op een real-time thermische cycler onder de volgende voorwaarden: 10 min bij 95 ° C gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 min. uitvoeren data-acquisitie bij de 60 ° C gloeien/polymerisatie stap.</li>
	<li>Nadat de procedure is versterking, onderwerp alle PCR reacties op een smeltende analyse van de curve met continue fluorescentie-meting van 55 ° C tot 95 ° C. Typisch, verzamelen één gegevenspunt elke cyclus door een stapsgewijze verhoging van de temperatuur met 0.5 ° C per cyclus. Opmerking: Ten minste 2 niet-template besturingselementen (NTC) bevatten voor elke primer paar master mix. Alle testen in ten minste drie replicaties uitvoeren.</li>
	<li>Bevestig de specificiteit van de primer via de analyse van de kromme smelt. Analyseren van bochten met de drempel van één cyclus en afgetrokken kromme passen methode. Opmerking: Het uiterlijk van een scherpe individuele piek geeft een uniforme individuele amplicon. Primer dimeer producten kunnen worden weergegeven als afzonderlijke pieken bij lagere temperaturen.</li>
	<li>De grootte van elke amplicon valideren door agarose gelelektroforese.<ol>
<li>Bereid een 3% agarose gel door het mengen van 3 g agarose met 100 mL TBE buffer (TBE: 89 mM Tris, boorzuur 89 mM en 2 mM EDTA).</li>
		<li>Meng 5-10 µL van het PCR-product met DNA en 1-2 µL van 6 x laden buffer. Laden van PCR product naast een DNA-ladder op 3% agarose gel. Voer een elektroforetische scheiding in 1 x TRIS-boorzuur EDTA-buffer bij 100 V voor 45 min.</li>
		<li>De gels met ethidiumbromide of elke andere intercalating agent vlek en visualiseren van de bands met behulp van image capture systemen onder UV-licht. Opmerking: DNA intercalating agenten (b.v., ethidiumbromide) zijn kankerverwekkende en moeten worden met zorg behandeld en afzonderlijk aangeboden. Het uiterlijk van een unieke scherpe band (met betrekking tot de grootte en zonder primer-dimeer of kunstmatige achtergrond amplificatie) bevestigt de specificiteit van de amplicon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. gDNA besmetting Assay Procedure met RNA sjablonen
Opmerking: Na behandeling met DNase, de gezuiverde RNA monster wordt getest door rDNA-specifieke primers. Als gevolg van de verwerking van de intron-achtige functie van ITSs wanneer deze regio's worden gebruikt voor amplificatie, geen versterking signaal moet worden gevonden in RNA DNA-gratis monsters. Op basis van deze, als een signaal versterking in qPCR wordt gevonden of een band in de agarose gel met de verwachte grootte (naar schatting door in silico analyse) waargenomen, dat dit zou te wijten zijn aan gDNA besmetting. De stappen in dit gedeelte uitgevoerd zijn vergelijkbaar met sectie 3, behalve dat van alle monsters cDNA wordt gebruikt als sjabloon in plaats van gDNA.
<ol><li>Bereid een master mix door het mengen van alle onderdelen van de reactie met uitzondering van RNA sjabloon in de buis van een PCR-reactie. Meester mix combinatie voor een reactie: 5 µL SYBR master mix (2 x), 0,3 µL primer (0,3 µM elke voor voorwaartse en omgekeerde primer mix), en het uiteindelijke volume aan 10 µL met RNase-gratis water. Gebruik ongeveer 500 ng sjabloon RNA in 1 µL volume voor analyse.</li>
	<li>Aliquot de master mix in een optische 96-wells-plaat. Pipetteer 1 µL RNA aan elk putje en vervolgens bedekken door optische plaat verzegeling film. Centrifuge en plaats in de cycler. Opmerking: Omvatten ten minste twee besturingselementen van de NTC en twee positieve gDNA voor elke assay. Alle testen in drie technische replicaties uitvoeren.</li>
	<li>Uitvoeren van de bepaling van de qPCR op een Real-time thermische cycler onder de volgende voorwaarden: 10 min bij 95 ° C gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 min. uitvoeren data-acquisitie bij de 60 ° C gloeien/polymerisatie stap.</li>
	<li>Nadat de procedure is versterking, onderwerp alle PCR reacties op een smeltende analyse van de curve met continue fluorescentie-meting van 55 ° C tot 95 ° C. Meestal, verzamelen één gegevenspunt elke cyclus door een stapsgewijze verhoging van de temperatuur met 0.5 ° C per cyclus.</li>
	<li>Controleer alle PCR producten door te voeren op 3% agarose gel elektroforese. Opmerking: De verschijning van de band of de piek in de reactie van de NTC is waarschijnlijk gerelateerd aan primer-dimeer vorming die meestal bij lage temperaturen in de smeltende curve, gezien wordt terwijl de aanwezigheid van een band of piek in RNA monsters het resultaat van gDNA besmetting is. Het is aanbevolen om de eerste testopnames alle RNA door rDNA gebaseerde inleidingen, en dan niet-DNA-monsters besmet worden gebruikt voor downstream toepassingen zoals cDNA synthese, gen expressie analyse, enz.</li>
</ol>5. RT-PCR stap voor cDNA synthese en qPCR analyse
<ol><li>Ontdooien DNase-RNA en de cDNA synthese reagentia behandeld bij kamertemperatuur. Na het ontdooien, spin down de reagentia. Voeg 1 µg voor RNA en 1 µL van Oligo (dT) 18 primer in een buis nuclease-vrij. Het totale volume van 12 µL met RNase-gratis water, meng zachtjes, en sla op ijs.</li>
	<li>Smelten van secondaire structuren van RNA sjabloon door het broeden van de reactie bij 65 ° C gedurende 5 min. Spin down en koel het flesje op ijs.</li>
	<li>Bereiden de reactie master mix (eindvolume 20 µL voor elke reactie) als volgt: 1 µL van reverse-transcriptase (200 U/µL), 4 µL van reactie buffer (5 x), 1 µL van RNase remmer (20 U/µL) en 2 µL van dNTP Mix (10 mM). Meng voorzichtig en koel het flesje op ijs. Voeg 19 µL in de bereid buis met RNA.</li>
	<li>Incubeer de reactie voor 60 min op 42 ° C, en vervolgens uit te broeden bij 70 ° C gedurende 5 minuten tot beëindiging van de activiteit van de reverse-transcriptase. Plaats de RT-reacties op het ijs en ga naar gen expressie analyse door routine qPCR procedure (zoals uitgelegd in sectie 3 en 4).</li>
</ol>

<ol><li>Bustin, S. A., Nolan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+of+quantitative+real-time+reverse-transcription+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction.</a> J Biomol Tech. 15 (3), 155-166 (2004).</li>
<li>Gutierrez, L., Mauriat, M., Pelloux, J., Bellini, C., Van Wuytswinkel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+systematic+validation+of+references+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Towards a systematic validation of references in real-time RT-PCR.</a> Plant Cell. 20 (7), 1734-1735 (2008).</li>
<li>Hashemi, S. H., Nematzadeh, G., Ahmadian, G., Yamchi, A., Kuhlmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+Aeluropus+littoralis+reference+genes+for+Quantitative+Real-Time+PCR+Normalization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Res+%28Thessalon%29%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of Aeluropus littoralis reference genes for Quantitative Real-Time PCR Normalization.</a> J Biol Res (Thessalon). 23 (1), 18(2016).</li>
<li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays.</a> J. Mol. Endocrinol. 25 (2), 169-193 (2000).</li>
<li>Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+real-time+quantitative+reverse+transcription-PCR+data%3A+a+model-based+variance+estimation+approach+to+identify+genes+suited+for+normalization%2C+applied+to+bladder+and+colon+cancer+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets.</a> Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Laurell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+RT-qPCR+data+for+genomic+DNA-derived+signals+with+ValidPrime%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Correction of RT-qPCR data for genomic DNA-derived signals with ValidPrime.</a> Nucleic Acids Res. 40 (7), e51(2012).</li>
<li>Galiveti, C. R., Rozhdestvensky, T. S., Brosius, J., Lehrach, H., Konthur, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+housekeeping+npcRNAs+for+quantitative+expression+analysis+of+human+transcriptome+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Application of housekeeping npcRNAs for quantitative expression analysis of human transcriptome by real-time PCR.</a> RNA. 16 (2), 450-461 (2010).</li>
<li>Laurell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+RT-qPCR+data+for+genomic+DNA-derived+signals+with+ValidPrime%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Correction of RT-qPCR data for genomic DNA-derived signals with ValidPrime.</a> Nucleic Acids Res. 40, e51(2012).</li>
<li>Caldana, C., Scheible, W. R., Mueller-Roeber, B., Ruzicic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+RT-PCR+platform+for+high-throughput+expression+profiling+of+2500+rice+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A quantitative RT-PCR platform for high-throughput expression profiling of 2500 rice transcription factors.</a> Plant Methods. 3 (1), 7(2007).</li>
<li>Lawrence, R. J., Pikaard, C. S. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.4161/cc.3.7.983">Perspectives Chromatin Turn Ons and Turn Offs of Ribosomal RNA Genes.</a> Cell Cycle. 3 (7), 880(2004).</li>
<li>Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://image.sciencenet.cn/olddata/kexue.com.cn/upload/blog/file/2008/8/200882721210225871.pdf">The multifunctional nucleolus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).</li>
<li>Alvarez, I., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+ITS+sequences+and+plant+phylogenetic+inference%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Phylogenet+Evol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference.</a> Mol Phylogenet Evol. 29 (3), 417-434 (2003).</li>
<li>Jobes, D. V., Thien, L. B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1007462330699">A conserved motif in the 5.8 S ribosomal RNA (rRNA) gene is a useful diagnostic marker for plant internal transcribed spacer (ITS) sequences.</a> Plant Mol Biol Report. 15 (4), 326-334 (1997).</li>
<li>Padhi, B. K., Singh, M., Huang, N., Pelletier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR-based+approach+to+assess+genomic+DNA+contamination+in+RNA%3A+Application+to+rat+RNA+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A PCR-based approach to assess genomic DNA contamination in RNA: Application to rat RNA samples.</a> Anal Biochem. 494, 49-51 (2016).</li>
<li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+housekeeping+genes+for+normalizing+RNA+expression+in+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR.</a> Biotechniques. 37 (1), 112-114 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Gen expressie analyse door kwantitatieve PCR heeft grote schaal toegepast in de afgelopen jaren. Het belangrijkste voordeel van deze snelle, rendabele en geautomatiseerde methode is het precies en nauwkeurig resultaat. Het verkrijgen van optimale voordelen van deze voordelen vereist echter een duidelijk inzicht in de installatie van de parameters die worden gebruikt voor de qPCR-experiment. Voor het ontvangen van een betrouwbaar resultaat in qPCR gen expressie analyse, is het noodzakelijk om te voorkomen dat de niet-specifieke versterking die uit verontreiniging van de primer-dimeer of gDNA in de RNA monster3,15 voortvloeit. Verwacht wordt dat de RNA transcriptie niveaus onder gDNA besmetting8zal worden overschat. Hier, de unieke kenmerken van een gen rDNA werd geacht voor een gDNA besmetting assay in RNA monsters.
Basiseigenschappen van het rDNA in dit protocol gebruikt: Ribosomal genen bestaan uit de twee ITSs, namelijk ITS1 en ITS2 en de drie codering rRNA-genen, 17-18S, 5.8S, en 25-28 subeenheid12. De twee ITS regio's maken geen deel uit van de codering opeenvolging van de ribosomal subeenheden. Ze worden verwijderd door ten minste drie enzymatische activiteiten voor het verwerken van de voorloper om oudere rRNA: een endonuclease, helicase en exonuclease activiteit. Zoals het ribosomaal RNA wordt omgezet als een afschrift van het polycistronic, is een primair product met de ITSs zeker aanwezig. De verwerking is erg snel en in de nucleolus plaatsvindt, en het bedrag van de voorloper van de detecteerbare moleculen bevat de ITS lager is dan de detectiegrens van de qPCR-methode. Daarom, wanneer ITS1 of ITS2 worden versterkt door ITS flankerende inleidingen, geen versterking kan worden opgespoord in RNA monsters tenzij gDNA besmetting aanwezig is. Het aantal rDNA genen in de genoom van eukaryote organismen werd geraamd op maximaal duizend exemplaren, die zijn gerangschikt in enkele of tandem arrays op de chromosomen11bevatten. In dit protocol stellen we een alternatieve manier, in plaats van NRT, om het detecteren van gDNA vervuiling, die wordt gebruikt in elke reactie/assay.
Voordelen en beperkingen met betrekking tot bestaande methoden: NRT wordt meestal gebruikt om te testen of het voorbereide monster van RNA schoon of daarmee verontreinigd gDNA is. Aangezien gDNA besmetting is niet gelijkmatig verdeeld tussen de verschillende monsters van RNA, en de reactie gevoeligheid voor gDNA wordt sterk beïnvloed door de genen geanalyseerd, zijn NRT-besturingselementen vereist voor elk monster/assay paar7,15. Dit zal aanzienlijk kosten toevoegen en arbeid bij het verwerken van vele monsters tegelijk3,9. Andere alternatieve methoden beschreven in de literatuur omvatten het gebruik van intron specifieke primers voor de detectie van gDNA, of ontwerpen inleidingen die een intron flank of omvatten een exon-exon-knooppunt. De beperkingen van deze methoden vloeien voort uit de onbeschikbaarheid van intron opeenvolgingsinformatie onvolledig aantekening van intron/exon structuur en het ontbreken van introns in genen of pseudogenes voor belang1,4,10 . Als gevolg van de evolutie bestaan rDNA genen als multigene en zeer geconserveerde gene gezinnen. Ze zijn zeer overvloedig in het genoom en op verschillende chromosomen13aanwezig. Vergeleken met andere genen coderen of nonconding, Toon de genen rDNA het beste geschikt voor detectie van gDNA besmetting. In de vergelijkende transcriptomic analyses, de normalisering van de qPCR gegevens door rRNA kalibrator is niet aanbevolen voor enkele problemen, zoals verschillen in cDNA voorbereiding (polyA priming vs. willekeurige hexamer priming), grote verschillen in overvloed rRNA en mRNA , en verschillende biogenese die misleidende genereren kan resultaten10,16. De problemen die we hebben zojuist genoemd zijn echter een voordeel voor de gDNA besmetting assay. Bijvoorbeeld met betrekking tot hogere targeting site overvloed in het genoom, en lokalisatie op verschillende chromosomen verbeteren rDNA gebaseerde inleidingen aanzienlijk de gevoeligheid van de detectie van gDNA in vergelijking met bestaande methoden.
Versality van het rDNA gebaseerde aan andere organisme: rDNA genen zijn een familie van de goed bestudeerde gen geïdentificeerd in de meeste organismen. De voorgestelde rDNA gebaseerde methode vertegenwoordigt een eenvoudige, zeer gevoelige en economische systeem voor gDNA besmetting testen die kan gemakkelijk aangepast aan andere eukaryotische en prokaryote organismen (Protocol 2 - 5 worden). Als een case-studie, we hebben hier laten zien het nut van deze methode in sommige soorten van de Poceae (Figuur 4 en Figuur 5). De gebruikte inleidingen tonen een hoge mate van overdraagbaarheid naar andere soorten van de Poceae als gevolg van de zeer geconserveerde structuur van rDNA subeenheden tussen soorten. Dit probleem wordt nog belangrijker wanneer voldoende genomic opeenvolgingsinformatie niet beschikbaar voor primer design is. ITS-begeleidende inleidingen ontworpen voor één soort kunnen dus worden gebruikt in een verwante soorten. Ook de 5.8S-F/R inleidingen werden geplukt op basis van een geconserveerde motief waarin hoge gelijkenis in meeste bedektzadigen14. Hoewel high throughput sequencing technieken permanent het aantal bekende genoom verhogen, de exon-intron aantekening van de meeste organismen is niet voltooid, en dus is het vaak niet mogelijk om het ontwerpen van inleidingen over een exon-exon grens worden verdeeld. Onze methode wordt uitgelegd hoe rDNA gebaseerde inleidingen voor de gDNA besmetting assay in qPCR analyse van prokaryoten en eukaryoten, met het doel van de afschaffing van de dure NRT besturingselementen in elke combinatie assay/primer kan worden toegepast.

Het verkennen van transcriptionele regulering van interessante gene sets of signalering van netwerken is essentieel om te begrijpen van het complexe moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij biologische gebeurtenissen1. Analyse van de qPCR is momenteel de meest gebruikte aanpak voor gen expressie studies die kunnen gericht zijn op DNA (het genoom) of RNA (transcriptome) die het mogelijk maken van methylome en transcriptome analyse, respectievelijk. Omgekeerde transcriptie (RT) gevolgd door qPCR wordt veel gebruikt voor analyse van de transcriptome dat gen expressie meten in verschillende gebieden van biologisch onderzoek2. Ten opzichte van andere methoden zoals de traditionele Noord hybridisatie, weefsel specifieke detectie via in situ hybridisatie, ribonuclease bescherming assays (RPA) en semi-RT-PCR, de nauwkeurigheid, gemak, snelheid en breed dynamisch bereik van qPCR gebaseerde tests zijn hoogst merkwaardige3,4. Er zijn meerdere belangrijke factoren die worden beschouwd voor een betrouwbare kwantificering van boodschapper-RNA (mRNA) moeten, met inbegrip van de kwaliteit en kwantiteit van RNA grondstof. Bovendien moeten de niet-specifieke versterking, de efficiëntie van de RT-qPCR en efficiëntie van de PCR beschouwd5,6.
De aanwezigheid van gDNA wil een inherent probleem tijdens de RNA extractie, gedeeltelijk vanwege de vergelijkbare fysische en chemische eigenschappen van DNA en RNA7. Vanwege de identiteit van de reeks van gDNA en cDNA (cDNA) afgeleid van de mRNA monsters, kan niet-specifieke versterking optreden, die de nauwkeurigheid van de resultaten van de RT-qPCR zal beïnvloeden. De resterende gDNA leidt tot overschatting van de overvloed aan mRNA in gen expressie analyse8richten.
Kortom, de niet-specifieke amplicon meestal ontstaat uit de primer-dimeer vorming of aspecifieke achtergrond versterking als gevolg van gDNA, die beide kunnen worden beoordeeld met behulp van passende controlemonsters. Deze monsters zijn geen sjabloon controle (NTC) en oncontroleerbaar reverse-transcriptase (NRT), respectievelijk. Aangezien de niveaus van gDNA besmetting in de monsters die worden onderzocht verschillend zijn en de gevoeligheid naar gDNA sterk tussen de genen geanalyseerd verschilt, zijn de NRT-besturingselementen vereist voor elk monster/assay-paar. Hoewel dit aanzienlijk kosten en arbeid in de RT-qPCR profiling studies verhoogt, zijn deze controles vereiste7,9.
Alternatieve methoden behandelen gDNA verontreiniging omvatten het gebruik van primerparen gloeien intergenic regio's of een intron van het gen van belang10, en het gebruik van inleidingen die beslaan een exon-exon junction, d.w.z. hetzij een grote intron flank de onthardende sites zijn afwezig in de volwassen mRNA volgnummer1,4. Intron/exon aantekeningen voor alle genen van vele gewerveld dier, bacteriën, protist, schimmels, planten en ongewervelde metazoan soorten zijn echter nog bekend. Bovendien hebben vele eukaryotische organismen pseudogenes afgeleid van duplicatie gebeurtenissen. Primer ontwerp over introns garandeert verder niet niet-amplificatie van gDNA. Als de chromatine toegankelijkheid van genomic regio's DNase ik varieert, is het aangeraden om te ontwerpen verschillende primerparen targeting verschillende chromosomen10.
Het genoom van eukaryote organismen kunnen omvatten tot duizend exemplaren van rDNA genen coderend voor ribosomal subeenheden nodig voor de vorming van de ribosomen. Deze rDNA-genen zijn vaak ingedeeld in enkele of tandem repeat arrays11. Polycistronic rRNAs (Figuur 1) met inbegrip van de grote subeenheid (LSU) en kleine subeenheid (SSU) worden getranscribeerd door RNA-polymerase I (RNA pol ik). De resulterende pre-rRNAs zijn verder verwerkt door het elimineren van de twee interne getranscribeerde spacer-regio's ITS1 en ITS2. Als eindproducten, drie oudere rRNAs, 17-18S rRNA (SSU), 5.8S en 25-28 rRNA (LSU) zijn gegenereerde12. rDNA genen zijn typische vertegenwoordigers van een multigene familie met zeer geconserveerde sequenties. Ze optreden met een hoge frequentie in het genoom en zijn potentieel aanwezig op meer dan één chromosomale locatie13. De verwerking van het rRNA en de aantasting van de getranscribeerde spacers is een snel proces in de nucleolus. Vanwege de hoge mate van herhaling, is de verhouding van genomic exemplaaraantal en aantoonbaar onbewerkt RNA premolecules lager ten opzichte van de lage-kopie intron sequenties en unspliced precursoren. Deze eigenschappen maken rDNA genen geschikt voor betrouwbare en zeer gevoelige detectie van gDNA besmetting in meeste eukaryoten en prokaryoten3.
Hier wordt een nieuwe procedure voor het opsporen van gDNA besmetting in RNA monsters beschreven. Een set universele inleidingen op basis van de volgorde van rDNA bewaard wordt gepresenteerd voor gDNA testen in de verschillende soorten van de grassenfamilie. De specificiteit en de universaliteit van de voorgestelde inleidingen werden getest door smelt kromme analyse met behulp van DNA als een sjabloon. Ons protocol is niet alleen van toepassing voor de grassenfamilie, maar kan ook gemakkelijk worden aangepast aan andere eukaryotische en prokaryotische soorten.

<table><tbody><tr><td>Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0221</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1631</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0321</td><td></td></tr><tr><td>96 well WHT/CLR</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Microseal B film</td><td>Bio-Rad</td><td>MJ-0558</td><td></td></tr><tr><td>Low tube strip CLR</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>Flat cap strips</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Peqlab</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Ambion</td><td>9780</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase en Protease-vrij</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNase-vrij</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>TRIZOL Reagent</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>BIO RAD</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube, 0.2 mL, RNase-vrij</td><td>Stratagene</td><td>Z376426</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinethiocyanaat voor moleculaire biologie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9277</td><td></td></tr><tr><td>Agarose - Nucleïnezuurelektroforese</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur voor moleculaire biologie</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>bromofenolblauw</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>ethediumbromide</td><td>AppliChem</td><td>A1151</td><td></td></tr><tr><td>Geldocumentatiesysteem</td><td>BIO RAD</td><td>Gel Doc 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van dna besmetting in rna samples gebaseerd op ribosomal dna

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Een methode voor de kwantificering van gen expressie veranderingen en transcript abundanties op grote schaal gebruikt is omgekeerde-transcriptie kwantitatieve PCR in real time (RT-qPCR). Het biedt nauwkeurige, gevoelige, betrouwbare en reproduceerbare resultaten. Verschillende factoren kunnen van invloed zijn op de gevoeligheid en de specificiteit van de RT-qPCR. Residuele genomic DNA (gDNA) besmetten van RNA monsters is een van hen. In gen expressie analyse, niet-specifieke versterking als gevolg van verontreiniging van de gDNA zal het overschatten van de overvloed van transcript niveaus en kan invloed hebben op de resultaten van de RT-qPCR. In het algemeen gDNA wordt gedetecteerd door qRT-PCR gebruikt primer paren gloeien intergenic regio's of een intron van het gen van belang. Helaas, intron/exon aantekeningen zijn nog niet bekend voor alle genen van gewervelde, bacteriën, protisten, schimmels, planten en ongewervelde metazoan soorten.
Hier presenteren we een protocol voor de detectie van gDNA besmetting in RNA samples met behulp van ribosomal DNA (rDNA)-op basis van inleidingen. De methode is gebaseerd op de unieke kenmerken van rDNA: hun multigene natuur, zeer geconserveerde sequenties en hoge frequentie in het genoom. Ook als een case-studie, een unieke reeks inleidingen werden ontworpen op basis van de geconserveerde regio van ribosomal DNA (rDNA) de grassenfamilie (Poaceae). De universaliteit van deze primerparen werd getest door smelt kromme analyse en agarose gelelektroforese. Hoewel onze methode wordt uitgelegd hoe rDNA gebaseerde inleidingen kunnen worden toegepast voor de gDNA besmetting assay de grassenfamilie (Poaceae), het gemakkelijk kan worden gebruikt om andere soorten prokaryote en eukaryote

Wij stellen voor het gebruik van rDNA gebaseerde inleidingen voor het valideren van de afwezigheid van besmetting van de gDNA in RNA monsters van weefsel van het blad. Het stroomdiagram van qPCR analyse en gDNA besmetting assay is afgebeeld in Figuur 2. In het voorgestelde protocol, twee complementaire strategieën werden gebruikt voor primer rDNA gebaseerde ontwerp: 1) soortspecifieke inleidingen werden geselecteerd uit ITSs sequenties en 2) universele inleidingen werden geselecteerd uit ITSs flankerende gebieden. Voor bewijs-van-concept ontwierpen we primers specifiek voor Aeluropus littoralis, en universele inleidingen op basis van de grassenfamilie soorten, als bepaald in het protocol. De 5.8S voorwaartse en omgekeerde inleidingen werden geselecteerd op basis van een geconserveerde 14 basenpaar (bp) motief dat gelijkenis tussen bloeiende planten, bryophytes en meerdere orders van algen en schimmels14 toont. De kenmerken van ontworpen inleidingen zijn gegeven in tabel 2. De universaliteit van SSU, 5.8S en LSU primer werden gecontroleerd door BLASTn en primer homologie resultaten worden gepresenteerd in Figuur 3 als een motief-logo. De lijst van soorten opgenomen in de analyse van de homologie, alsmede de uiteenlopende inleidingen voor elke soort worden gegeven in tabel 1. Primer specificiteit was controle door Primer-BLAST. Voor de soorten waar het hele genoom beschikbaar is, werd de chromosomale locatie van rDNA genen geschat. Bijvoorbeeld, in Oryza sativa en Arabidopsis thaliana, rDNA bevinden genen zich op twee verschillende chromosomen, en in Zea mays op drie verschillende chromosomen.
qPCR validatie van rDNA gebaseerde primers werd uitgevoerd met het smelten van de kromme analyse van ITS1 en ITS2-flank waarbij DNA als sjabloon gebruiken. Zoals gepresenteerd in Figuur 4 en Figuur 5, primer specificiteit werd experimenteel bevestigd door de waarneming van een enkele scherpe piek met geen primer-dimeer vorming in verschillende grassenfamilie plantensoorten, waaronder Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Oryza sativa, en in de dicots Medicago sativa, Cucumis sativus, Nicotiana tabacum Trifolium alexandrinum, Vicia fabaen Arabidopsis thaliana. De nieuwe test van de amplificatie producten door de grootte van de elektroforetische scheiding toonde een unieke band. Zoals verwacht, de banden afgeleid van monsters van de verschillende soorten variëren in grootte (figuur 6A en 6B). Interessant is dat het gebruik van de universele inleidingen, speciaal ontworpen voor de drie soorten van de grassenfamilie zijn niet alleen nuttig voor andere soorten van de grassenfamilie, maar ook voor andere plantensoorten zoals A. thaliana, en voor een endophytic schimmel viz. Piriformospora indica.
De geldigheid van de ontworpen specifieke primer (ITS1) werd ook bevestigd door qPCR in A. littoralis gDNA als sjabloon gebruiken. Een enkele piek met geen primer-dimeer vorming werd waargenomen. Verrassend, de A. littoralis ITS1 primer (als de specifieke primer) gegenereerd een enkele scherpe band niet alleen in A. littoralis, maar ook voor alle andere soorten getest met uitzondering van Nicotiana tabacum en Trifolium alexandrinum, die geproduceerd twee bands (Figuur 6 c). De gDNA besmetting assay werd uitgevoerd door ITS of ITS-begeleidende inleidingen in alle RNA monsters. Een schematische weergave van de plaat van de versterking in de gDNA besmetting bepaling en de interpretatie van resultaten is gepresenteerd in Figuur 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55451/55451fig1.jpg"> Figuur 1: Het algemene patroon van eukaryotische rDNA reeks organisatie. De eukaryotische rDNA segment bevat 17-18S (rood), 5.8S (blauw) en 25-28 rRNA (roze). De interne getranscribeerde spacers (ITS) worden aangeduid als zwarte lijnen. 5´and 3´ geven de richting van de DNA-molecule. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55451/55451fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55451/55451fig2.jpg"> Figuur 2: Workflow voor een RT-qPCR en gDNA besmetting assay. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55451/55451fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55451/55451fig3.jpg"> Figuur 3: Motif logo van A. SSU, B. 5.8S en C. LSU primer homologie. Voor SSU, 5.8S, en LSU primers, het motief-logo werd gebouwd door de BLASTn op basis van 2.000 groene plant records (NCBI taxid nummer: 33090) met een licht-donkerscheiding e-waarde ≤10-10. A-Adenine, Thymine-T, G-Guanine, C-Cytosine. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55451/55451fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55451/55451fig4.jpg"> Figuur 4: De smelt kromme analyse van ITS1-begeleidende amplicon in verschillende soorten. Deze amplicon, versterkt door SSU en 5.8S-R primers, bevat een deel van de reeks van de 17-18S coderen regio, de hele reeks van ITS1 en partiële sequentie van 5.8S. Getoond worden de smeltende curven van waarbij gegenereerd (roze) en NTC (rood) vanaf Triticum aestivum Hordeum vulgare, Oryza sativa, Medicago truncatula, Cucumis sativus, Nicotiana tabacum, Trifolium alexandrinum, Vicia fabaen Arabidopsis thaliana, Piriformospora indica. De vlakke vet lijn geeft de drempel van de basislijn. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55451/55451fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55451/55451fig5.jpg"> Figuur 5: De smelt kromme analyse van ITS2-begeleidende amplicon in verschillende soorten. Deze amplicon wordt gegenereerd door het gebruik van 5.8S-F en LSU inleidingen. De beschreven amplicon bevat sequenties van deel van 5,8 S, de hele reeks ITS2 en een partiële sequentie van 25-28. Getoond worden de smeltende curven van waarbij (groen) en NTC (rood) gegenereerd op basis van Triticum aestivum Hordeum vulgare, Oryza sativa, Medicago truncatula, Cucumis sativus, Nicotiana tabacum, Trifolium alexandrinum, Tuinboon, Arabidopsis thaliana en Piriformospora indica. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55451/55451fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55451/55451fig6.jpg"> Figuur 6: Agarose gel analyse van rDNA gebaseerde PCR product. De amplicon van ITS1-flanken (A), ITS2-flanken (B), en ITS1 (C) werden uitgevoerd op 3% agarose gel. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55451/55451fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55451/55451fig7.jpg"> Figuur 7: Intron-achtige kenmerken van ITSs kunnen worden beschouwd als ontwerpen van inleidingen die gDNA besmetting kunnen detecteren. Een piek of de band met de verwachte grootte in qPCR analyse geven gDNA besmetting in het RNA-monster. UNK: onbekend monster, pos: positieve controle, NTC: niet-sjabloon controle. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55451/55451fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer</td>
			<td>Geslacht</td>
			<td>Taxid ID</td>
			<td colspan="2">Soorten</td>
			<td colspan="2">Uiteenlopende primer</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="10">SSU</td>
			<td>Arabidopsis</td>
			<td>3701</td>
			<td colspan="2">
kamchatica, thaliana en lyrata
</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vicia</td>
			<td>3904</td>
			<td colspan="2">
villosa americana, unijuga, amoenane, amurensis, craccamal, pseudo-orobus, multicaulis, japonica, ramuliflora en faba
</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>Trifolium</td>
			<td>3898</td>
			<td colspan="2">
Alexandrinum, montanum resupinatum en repens
</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotiana</td>
			<td>4085</td>
			<td colspan="2">
tabacum, benthamiana, otophora, picilla, bigelovii, palmeri, tomentosiformis, tomentosa, digluta, kawakamii, clevelandii, nesophila, solanifolia, cordifolia, debneyi, arentsii, thyrsiflora, wigandioides, undulata, Els, noctiflora, petunioides, obtusifolia, miersii, pauciflora, verzachten, acuminata linearis alata, sylvestris, rustica en suaveolens
</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cucumis</td>
			<td>3655</td>
			<td colspan="2">
anguria, melo en sativus
</td>
			<td colspan="2">CGTAACAAGGTTTCCGTAGGKG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aeluropus</td>
			<td>110873</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Geen primer gevonden</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rupsklaver</td>
			<td>3877</td>
			<td colspan="2">
Sativa, lupulina, pamphylica, lunata, rostrate, plicata en truncatula
</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oryza</td>
			<td>4597</td>
			<td colspan="2">
Sativa, glumipatula, rufipogon barthii glaberrima punctate, longistaminata, olifant, nivara, olifant en longistaminata
</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Triticum</td>
			<td>4564</td>
			<td colspan="2">
aestivum urartu en monococcum
</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hordeum</td>
			<td>4512</td>
			<td colspan="2">
vulgare bulbosum, marinum, brevisubulatum en bogdanii
</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="11">LSU</td>
			<td>Arabidopsis</td>
			<td>3701</td>
			<td colspan="2">
petraea thaliana en lyrata
</td>
			<td colspan="2">TGCTTAAACTCAGCGGGTAATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vicia</td>
			<td>3904</td>
			<td colspan="2">
sylvatica, tetrasperma, sativa, oorlogszuchtig, sepium, parviflora, cracca, lathyroides, orobus, orobus, bithynica en faba
</td>
			<td colspan="2">TGCTTAAATTCAGCGGGTAGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trifolium</td>
			<td>3898</td>
			<td colspan="2">
pretentie nigrescens, resupinatum, occidentale, klaver, strictum, ochroleucon, glomeratum, squamosum, ornithopodioides en repens
</td>
			<td colspan="2">TGCTTAAATTCAGCGGGTAGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotiana</td>
			<td>4085</td>
			<td colspan="2">
tabacum, benthamiana, otophora, picilla, bigelovii, palmeri, tomentosiformis, tomentosa, digluta, kawakamii, clevelandii, nesophila, solanifolia, cordifolia, debneyi, arentsii, thyrsiflora, wigandioides, undulata, Els, noctiflora, petunioides, obtusifolia, miersii, pauciflora, verzachten, acuminata linearis, alata, sylvestris en suaveolens
</td>
			<td colspan="2">TGCTTAAACTCAGCGGGTAGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cucumis</td>
			<td>3655</td>
			<td colspan="2">
Melo, ritchiei en javanica
</td>
			<td colspan="2">TGCTTAAACTCAGCGGGTAGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aeluropus</td>
			<td>110873</td>
			<td colspan="2">
lagopoide pungens en littoralis
</td>
			<td colspan="2">TGCTTAAATTCAGCGGGTAATC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Rupsklaver</td>
			<td rowspan="2">3877</td>
			<td colspan="2">
ruthenica sativa lupulina, arabica, polymorpha en minima
</td>
			<td colspan="2">TGCTTAAATTCAGCGGGTAGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
pamphylica lunata, rostrate en plicata
</td>
			<td colspan="2">TGCTTAAACTCAGCGGGTAGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oryza</td>
			<td>4597</td>
			<td colspan="2">
Sativa, glumipatula, rufipogon, barthiial, glaberrima, australiensis, officinalis australiensis, ridleyi, malampuzhaensis, alta, nivara, rufipogon, olifant en longistaminata
</td>
			<td colspan="2">TGCTTAAACTCAGCGGGTAGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Triticum</td>
			<td>4564</td>
			<td colspan="2">
aestivum, Spelta, turgidum, dicoccoides, petropavlovskyi, urartu en monococcum
</td>
			<td colspan="2">TGCTTAAACTCAGCGGGTAGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hordeum</td>
			<td>4512</td>
			<td colspan="2">
Margriet, bulbosum, murinum, secalinum, brevisubulatum en bogdanii
</td>
			<td colspan="2">TGCTTAAACTCAGCGGGTAGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">Een gedegenereerde primer is gedefinieerd als IUPAC-systeem voor nucleotide nomenclatuur</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: De lijst van soorten beschouwd voor het plukken van rDNA gebaseerde inleidingen. SSU bindende site in vergelijking met de LSU bindende site toonde hogere reeks homologie over gegeven geslacht.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Amplicon lengte</td>
			<td>Gebied van de versterking</td>
			<td colspan="2">Volgorde</td>
			<td>De naam van de primer</td>
			<td>Amplicon</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">332 - 405 bp</td>
			<td rowspan="2">Partiële sequentie van SSU, hele opeenvolging van ITS1 en partiële sequentie van 5.8S</td>
			<td colspan="2">CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG</td>
			<td>SSU</td>
			<td rowspan="2">ITS1-flanken</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GGTTCACGGGATTCTGCAAT</td>
			<td>5.8S-R</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">318 - 361 bp</td>
			<td rowspan="2">Partiële sequentie van 5.8S, hele opeenvolging van ITS2 en partiële sequentie van LSU</td>
			<td colspan="2">ATTGCAGAATCCCGTGAACC</td>
			<td>5.8S-F</td>
			<td rowspan="2">ITS2-flanken</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TGCTTAAAYTCAGCGGGTAGYC</td>
			<td>LSU</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">100 - 200 bp</td>
			<td rowspan="2">ITS1</td>
			<td colspan="2">GGTATGGCGTCAAGGAACACT</td>
			<td>ITS1-F</td>
			<td rowspan="2">ITS1</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ATAGCATCGCTGCAAGAGGT</td>
			<td>ITS1-R</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Primer sequenties.

Hier presenteren we een protocol voor het traceren van genomic DNA (gDNA) verontreiniging in RNA monsters. De onderhavige methode maakt gebruik van primers specifiek voor de interne getranscribeerde spacer regio (ITS) van ribosomal DNA (rDNA) genen. De methode is geschikt voor betrouwbare en gevoelige detectie van DNA besmetting in meeste prokaryoten en de eukaryoten.

Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Het algemene doel van deze methode is het opsporen van contaminatie van genomisch DNA in RNA-monsters verkregen uit plantenweefsel voor kwantitatieve real-time PCR. De methode maakt gebruik van de internal transcribed spacer-regio van ribosomale genen voor de betrouwbare en gevoelige detectie van DNA-contaminatie binnen de Poaceae-familie. Deze methode kan bijdragen aan de verbetering van de veelgebruikte methode van reversed transcription kwantitatieve real-time PCR.De belangrijkste voordelen zijn het gebruik van multicopy-genen om de detectiegevoeligheid bij eukaryote en prokaryote soorten te verbeteren en het feit dat het een kostenefficiënte methode is. Ribosomale genen bestaan uit de twee ITS'en, namelijk ITS1 en ITS2, en de drie RNA-coderende genen: de 17-18S, 5.8S en 25-28S subunits. Hier presenteren wij een protocol voor de detectie van DNA-contaminatie in RNA-monsters van de Poaceae-soort Aeluropus littoralis.In het gepresenteerde protocol zijn twee complementaire strategieën gebruikt voor het ontwerp van rDNA-gebaseerde primers. Ten eerste werden soortspecifieke primers geselecteerd uit ITS-sequenties en ten tweede werden universele primers geselecteerd uit sequenties die de ITS'en flankeren. Voor de validatie van de toepasbaarheid van de primers moet genomisch DNA ook worden opgenomen in de qRT-PCR-workflow, parallel aan de RNA-isolatie en validatie.Nadat het DNA en RNA zijn geïsoleerd, wordt er onder denaturerende omstandigheden een guanidiniumthiocyanaat-agarosegel gedraaid om de kwantiteit, zuiverheid en integriteit van het uit bladweefsels geïsoleerde RNA te controleren. Om de gel te maken, wordt de agar eerst afgekoeld tot 60 °C, waarna vijf millimolair guanidiniumthiocyanaat wordt gemengd met een standaard 1x TBE 1% agarosegel. Bereid vervolgens de denaturerende RNA-laadbuffer.Voeg één tot vijf microgram totaal RNA en RNA-denaturerende laadbuffer toe. Verwarm het mengsel vervolgens gedurende vijf minuten bij 70 graden Celsius en bewaar het op ijs voordat het op de gel wordt geladen. Laad het monster en laat de gel 45 minuten lopen bij 100 volt.Om twee verschillende RNA-banden te zien, gebruikt u een beeldcapturesysteem onder ultraviolet licht. Verwijder sporen van genomisch DNA uit RNA in een RNase-vrije buis door één unit DNASE1 en magnesiumchloride met 10-voudige reactiebuffer toe te voegen aan 0,1 tot één microgram totaal RNA. Incubeer het mengsel vervolgens 30 minuten bij 37 °C.Stop de reactie door één µL 50 mM EDTA toe te voegen. Incubeer het mengsel vervolgens 10 minuten bij 65 °C. Om sporen van RNA uit het genomisch DNA-extract te verwijderen, voegt u vijf µL RNase A (10 mg/mL) toe aan het totaal DNA en incubeert u dit één uur bij 37 °C.Bewaar vervolgens de RNA- en DNA-extracten bij -80 °C. De functionaliteit van de ontworpen primers moet worden gevalideerd door qPCR uit te voeren met gDNA als template. Bereid de PCR-mastermix voor in een buisje op ijs door alle reagentia, behalve het DNA-template, te mengen. Verdeel de mastermix over een optische 96-well plaat. Voeg vervolgens één µL genomisch DNA toe aan elke well en dek de plaat af met optische plaatsealdichtfilm. Centrifugeer de plaat en plaats deze in een thermocycler.Stel een programma in voor 40 cycli en start de real-time thermocycler. Voer de data-acquisitie uit bij 60 graden Celsius. Om de specificiteit van de primers te bevestigen, analyseert u de smeltcurvegegevens met de single-threshold cycle en de subtracted curve fit-methode.Een scherpe individuele piek vertegenwoordigt een enkel uniform amplicon. Gebruik een 3% agarosegel om de grootte van elk amplicon te valideren. Meng vijf tot 10 µL PCR-product met zesvoudige ladingsbuffer en breng de monsters aan naast de DNA-ladder op de agarosegel.Voer elektroforese uit bij 100 volt gedurende 45 minuten in een eenvoudige tris-boraat-EDTA-buffer. Hier is het schema van de amplificatieplaat en de assay voor gDNA-contaminatie. Voer alle assays uit in ten minste drie replicaten.Controleer de RNase met ten minste één universele of specifieke rDNA-gebaseerde primer. Voeg voor elke mastermix van primerparen positief controle-genomisch DNA toe. Voeg voor elke mastermix van primerparen controles zonder template toe.Bereid de PCR-mastermix voor in een buis op ijs door alle reagentia te mengen, behalve het RNA-sjabloon. Verdeel de mastermix in een optische 96-wellplaat. Voeg vervolgens één microliter RNA toe aan elke well en dek de plaat af met optische plaatsealingfilm.Centrifugeer en plaats de plaat in de thermocycler. Stel een programma van 40 cycli in en start de real-time thermocycler. Analyseer de gegevens bij 60 °C.Valideer alle ampliconen door een 3% agarosegel te draaien. Ontdooi het met DNase behandelde RNA en de reagentia voor cDNA-synthese bij kamertemperatuur. Centrifugeer de reagentia na het ontdooien.Voeg vervolgens in een nuclease-vrije buis één microgram RNA en één microliter oligo-deoxythymidine 18-primer toe, ook wel Oligo(dT) genoemd, en vul het uiteindelijke volume aan tot 12 microliters met RNase-vrij water. Meng de reagentia voorzichtig en bewaar ze op ijs. Incubeer de reactie bij 65 degrees Celsius gedurende vijf minuten om de secundaire structuren van het RNA te denatureren.Centrifuge vervolgens de monsters en plaats het vial onmiddellijk op ijs. Voeg de reagentia voor cDNA-synthese toe aan een buisje dat op ijs bewaard wordt. Meng de reagentia voorzichtig.Voeg vervolgens 19 µL master mix toe aan een PCR-buis met RNA. Incubeer de reactie 60 minuten bij 42 °C. Incubeer daarna vijf minuten bij 70 °C om de activiteit van de reverse transcriptase te stoppen.Houd de buisjes vervolgens op ijs. Voer een routineanalyse van de genexpressie uit voor alle PCR-reacties door de smeltcurves te analyseren en de amplicons te valideren op een 3% agarosegel. Een BLAST-zoekopdracht om de sequentie-uitlijning voor de primers van de kleine subunit 5.8S en de grote subunit te extrapoleren, toont een motief op basis van de sequentiehomologie van 2.000 groene plantensoorten.Representatieve smeltcurves waarop enkele scherpe pieken te zien zijn voor de flankerende amplicons van de internal transcribed spacer-one in verschillende Poaceae-soorten. De X-as van de smeltcurve geeft de temperatuur aan en de Y-as verwijst naar het verschil in fluorescentie. De roze pieken vertegenwoordigen de amplicons en de rode lijn vertegenwoordigt de controles zonder template in elk van de grafieken.Representatieve smeltcurves die de aanwezigheid van scherpe pieken zonder primer-dimeren laten zien voor amplicons flankerend aan de internal transcribed spacer-two in verschillende Poaceae-soorten. De X-as van de smeltcurve geeft de temperatuur aan, en de Y-as verwijst naar het verschil in fluorescentie. De groene pieken representeren de amplicons, en de oranje pieken representeren de controles zonder template in elk van de grafieken.Een representatieve 3% agarosegel waarop ribosomaal DNA-gebaseerde PCR-producten naast een 100-BP DNA-ladder zijn weergegeven. De DNA-banden in paneel A vertegenwoordigen het amplicon van de flankerende regio van internal transcribed spacer-one. DNA-banden in paneel B en C vertegenwoordigen amplicons van de flankerende regio van internal transcribed spacer-two.Een internal transcribed spacer-one regio voor verschillende soorten. De aanwezigheid van een knik of piek in RNA-monsters is het resultaat van gDNA-contaminatie, terwijl het verschijnen van een knik of piek in de NTC-reactie waarschijnlijk gerelateerd is aan de vorming van primerdimeren. Het wordt aanbevolen om eerst alle RNA-monsters te testen met rDNA-gebaseerde primers om te garanderen dat gecontamineerde monsters niet worden gebruikt voor downstream toepassingen.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen acht uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Deze methode heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om mRNA te kwantificeren via kwantitatieve real-time PCR. Na het bekijken van deze video zou men een goed begrip moeten hebben van hoe contaminaties met genomisch DNA kunnen worden gedetecteerd met behulp van onze voorgestelde methode.Vergeet niet dat het werken met guanidiniumthiocyanaat en ethidiumbromide extreem gevaarlijk is en dat u altijd beschermende kleding moet dragen en beschermende maatregelen moet nemen.

assessment-of-dna-contamination-in-rna-samples-based-on-ribosomal-dna

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Een stap voor stap-protocol om het isoleren en identificeren van RNA bijbehorende complexen door middel van RIP-Chip.

Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

Een reeks colorimetrische testen beschreven voor het snel onderscheiden eiwitten, RNA, DNA, en opnieuw in ducing suikers mogelijk heterogene biomoleculaire monsters.

Snelle Colorimetrische Testen om kwalitatief onderscheid RNA en DNA in Biomoleculaire Monsters

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

Hier beschrijven we een methode die zich lenen voor het gelijktijdig kwantificeren en genoom-brede kaart ribonucleotides in zeer intact DNA op single-nucleotide de resolutie, enzymatische splitsing van genomic DNA te combineren met de alkalische hydrolyse en de daaropvolgende 5´-end sequencing.

Gelijktijdige Mapping en kwantificatie van Ribonucleotides in menselijke mitochondriaal DNA

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Ribonucleotides behoren tot de meest voorkomende niet-canonieke nucleotiden in het genoom opgenomen tijdens de eukaryote nucleair DNA-replicatie. Als het niet correct is verwijderd, kan ribonucleotides DNA-beschadiging en mutagenese veroorzaken. Hier presenteren we twee experimentele benaderingen die worden gebruikt voor het beoordelen van de overvloed van ribonucleotide opneming in DNA en zijn mutagene effecten.

Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

Hier presenteren we een protocol voor DNAzyme-afhankelijke splijting van RNA. Dit maakt een snelle en site-afhankelijke analyse van RNA 2 '-O-Methylation mogelijk. Deze aanpak kan worden gebruikt voor de voorlopige of belangrijke beoordeling van de activiteit van snoRNA.

DNAzyme-afhankelijke analyse van rRNA 2 '-O-methylatie

Hier beschrijven we de immunopreciatie van riosomen en bijbehorend RNA uit geselecteerde populaties volwassen mannelijke muizenkiemcellen met behulp van het RiboTag-systeem. Strategische veredeling en zorgvuldige immunoneerslag resulteren in schone, reproduceerbare resultaten die informeren over het vertalen van de kiemcel en inzicht geven in de mechanismen van gemuteerde fenotypes.

RiboTag immunoprecipitatie in de kiemcellen van de mannelijke muis

Hier beschrijven we de stadia van monsterverzameling en voorbereiding voor RIBO-seq bij bacteriën. Sequencing van de bibliotheken die volgens deze richtlijnen zijn opgesteld, resulteert in voldoende gegevens voor een uitgebreide bio-informatische analyse. Het protocol dat we presenteren is eenvoudig, maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en duurt zeven dagen van lysis tot het verkrijgen van bibliotheken.

RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing

Dit protocol maakt een eerste kwaliteitscontrole mogelijk voor RNA-seq-experimenten voor wet-lab biologen met beperkte bio-informatica-ervaring.

Rup (RNA-seq Usability Assessment Pipeline) - Kwaliteitscontrole voor bulk RNA-seq-experimenten in eukaryoten

Leer een protocol voor het opsporen van DNA-besmetting in RNA-monsters met behulp van ribosomale DNA-primers. Deze methode verbetert de gevoeligheid van kwantitatieve real-time PCR voor eukaryote en prokaryote soorten.

Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA

Meer video's verkennen