Name: Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Leer een high-throughput assay voor het testen van geneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis in macrofaagaggregaten. Deze BSL-2 compatibele methode voorspelt in vivo werkzaamheid betrouwbaarder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Frank Wolschendorf voor toegang tot de Cytation 3 geautomatiseerde beeldvormingsplaatlezer. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door NIH-subsidie R01-AI104499 aan OK. Delen van het werk werden uitgevoerd in de UAB CFAR-faciliteiten en door de UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, die worden gefinancierd door NIH/NIAID P30 AI027767 en door NIH 5P30 AR048311.

LET OP: Als M. tuberculosis mc 2 6206 is een avirulente stam 17, 18, kunnen alle werkzaamheden in dit protocol worden uitgevoerd in een Biosafety Level 2-faciliteit (BSL-2). 1. Cultuur Voorwaarden voor Green Fluorescent Protein Het uiten van M. tuberculosis mc 2 6206 (MTB-GFP) LET OP: De M. tuberculosis H37Rv afkomstig auxotroof stam mc 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) getransformeerd met de GFP tot expressie plasmide pMN437 wordt in dit protocol 16 gebruikt. Het is mogelijk om het Mtb-GFP-stam te vervangen door niet-GFP tot expressie brengende wildtype gemakkelijker toegankelijkheid van de stam voor onderzoekers mogelijk. Echter, GFP expressie is wenselijk om visuele bevestiging van fagocytose en de vorming van MTB / macrofaag aggregaten mogelijk te maken. voor long termijnopslag, Mtb-GFP werden ingevroren bij -80 ° C in volledige 7H9 medium (in stap 1.1 beschreven) aangevuld met 20% glycerol. <ol><li> Bereid volledige Mtb GFP media (7H9-C) door aanvulling 7H9-medium met 10% Middlebrook OADC, 0,02% tyloxapol, 24 ug / ml D-pantotheenzuur, 50 ug / mL L-leucine en 50 ug / ml hygromycine B. </li><li> Dooi een flacon van MTB-GFP en toe te voegen aan 10 ml van 7H9-C in een 30 ml vierkante bodem PETG kolf. </li><li> Incubeer bij 37 ° C op roterende schudmachine (50 rpm). Neem metingen van optische dichtheid (OD 600) om de paar dagen tot OD 600 1,0 (ongeveer 5-8 dagen) bereikt. </li><li> Verdunnen en passage cultuur als nodig is om een OD 600 te handhaven tussen 0,2-1,0. </li><li> Voor infectie, gebruik van een gevestigde cultuur van de MTB-GFP in de logaritmische groeifase (OD 600 van 0,6-1). Om clumpy culturen voorkomen, ultrasone trillingen de cultuur kolf Mtb in een waterbad (130 W, 3 x 5 en peulvruchten) ONCe of twee keer per week </li></ol> 2. Cultuur Voorwaarden voor THP-1 cellen <ol><li> Bereid volledige THP-1 celmedium (RPMI-C) door toevoeging RPMI 1640 medium met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine en 10 mM HEPES. </li><li> Incubeer cellen in een T-75 kolf bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. </li><li> Aantal cellen met een hemocytometer of flowcytometrie om de dag te handhaven en THP-1 cellen bij een dichtheid tussen 0,1-0.600.000 per mL. </li></ol> 3. Infectie Protocol bij MTB / macrofaag Aggregate Structures Genereer <ol><li> THP-1 celpreparaat (per 96 putjes) <ol><li> Centrifugeer 7 x 10 6 THP-1 cellen bij 250 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer in 7 ml RPMI-C. </li></ol></li><li> Mtb-GFP voorbereiding <ol><li> Centrifuge 2,8 x 10 8 MTB-GFP bij 3200 xg gedurende 5 minuten in een swingende-bucket centrifuge uzingen een omzetting van OD 600 1,0 = 3 x 10 8 bacteriën / ml. </li><li> Was eenmaal met RPMI-C en gecentrifugeerd zoals in stap 3.2.1. </li><li> Resuspendeer in 7 ml RPMI-C en vortex gedurende 10 s. </li></ol></li><li> Infectie OPMERKING: Zie figuur 1 voor de template. <ol><li> Bereid een 96-well plaat door toevoeging van 200 pl steriel water in rijen A en H en kolommen 1 en 12 een rand water om verdamping van kweekmedium voorkomen. </li><li> Voeg 200 ul RPMI-C kolom 2 (B2 G2) voor de achtergrond controle (blanco). </li><li> Te infecteren, voeg Mtb GFP suspensie (stap 3.2) aan THP-1 cel suspensie (stap 3.1) en meng goed door pipetteren. De uiteindelijke THP-1 celdichtheid 5 x 10 5 per ml en de overeenkomstige multipliciteit van infectie 40. </li><li> Giet de THP-1 / MTB-GFP ophanging in een 25 ml reservoir. </li><li> Voeg 200 ul van THP-1 / Mtb GFP suspensie alle resterende 96 putjes (B3 tot G11) usinga multi-channel pipet. Opmerking: Als het werken met meerdere 96-well platen, regelmatig resuspendeer de resterende THP-1 / Mtb suspensie in het reservoir om een gelijkmatige mengsel wordt aan elk putje toegevoegd. </li><li> Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 7-10 dagen. </li><li> Veranderen media elke 2 dagen door langzaam verwijderen 100 pi bracht inhoud van de bovenkant van elk putje en voorzichtig toevoegen van 100 ul voorverwarmde RPMI-C een multi-kanaal pipet. Niet putjes resuspendeer verstoren de Mtb / macrofaag aggregaten op de bodem van de putjes. </li><li> Visueel onderzoek van de putten door fluorescentie microscopie (4-10X doelstelling) per dag, rekening houdend met de omvang van de MTB / macrofaag aggregaten. Per dag 7-10, moet MTB / macrofaag aggregaten voldoende groot zijn (zie figuur 2 voor de referentie) om door te gaan naar de werkzaamheid van drugs testen (hoofdstuk 4). </li><li> Indien gewenst, foto&#39;s maken van de 96-wells met behulp van een geautomatiseerd cell imaging-systeem gemonteerdmet heldere veld en GFP filter sets te MTB / macrofaag aggregaat vorming documenteren. LET OP: Als gebruikers geen toegang hebben tot een geautomatiseerd imaging systeem kunnen beelden van representatieve putten worden genomen met behulp van een geschikte microscoop met GFP en heldere veld mogelijkheden. </li></ol></li></ol> 4. Groei Remming Assay te beoordelen Drug werkzaamheid tegen Mtb Afgeleid van MTB / macrofaag Aggregaten <ol><li> Bereiding geneesmiddel (triplo voorwaarden voor twee geneesmiddelen) OPMERKING: Zie figuur 1A voor template. <ol><li> In een afzonderlijke 96-well plaat, voeg 125 ul van 7H9-C media B2 tot G10. </li><li> Bereid twee geneesmiddelen dubbel zo hoog gewenste eindconcentratie in 1 ml van 7H9-C die overeenkomt met het verdunning in stap 4.2.4. </li><li> Voeg 250 ul van elk geneesmiddel te putten B11-C11-D11 en E11-F11-G11, respectievelijk drievoud behandelingen. </li><li> Een multi-kanaal pipet, serieel dilute de test drugs tweevoudige door het bewegen van 125 pi van B11-G11 in B10-G10. Meng door pipetteren 5 keer bij elke stap. </li><li> Verder 125 ul van kolom naar kolom (van rechts naar links) over de plaat en stoppen na kolom 4. </li><li> Na het mengen kolom 4, gooi 125 ul in een afvalcontainer. Kolommen 2 en 3 mogen geen drugs bevatten om voor gebruik als een achtergrond (lege) en positieve controles groei. NB: Als alternatief, volg sjabloon in figuur 1B voor het testen van drugs bibliotheken. Elke 96-putjesplaat kan geschikt 58 geneesmiddelen bij één concentratie. Bereid deze drug plaat met behulp van het dubbele van de gewenste uiteindelijke concentratie, omdat het in de helft zal worden verdund in stap 4.2.4. </li></ol></li><li> Behandeling met geneesmiddelen: <ol><li> Haal de 96-well plaat met de Mtb geïnfecteerde macrofagen (MTB / macrofaag aggregaten). </li><li> decanteren zorgvuldig alle relevante bronnen (B2 door middel van G11) met een multi-channel pipet.Voer deze in een twee-staps manier: eerste 150 ul verwijderen zonder het kantelen van de plaat en verwijder de resterende media (~ 50 pi) door het kantelen van de plaat en het plaatsen van de pipet tip om de onderste rand van de put. Zoals Mtb / macrofaag aggregaten aanhanger van de bodem van de put, mag geen materiaal verloren. </li><li> Zachtjes 100 ul van 7H9-C media toe te voegen aan alle relevante bronnen (B2 door middel van G11) van de plaat met de MTB / macrofaag aggregaten. </li><li> Een multi-kanaal pipet, breng 100 ui van de geneesmiddel bevattende 96 putjes (stap 4,1) in de overeenkomstige putjes van de plaat infectie. </li><li> In een afgesloten zak en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Het kwantificeren van de werkzaamheid van het geneesmiddel met behulp van de Resazurin Microtiterplaten Assay <ol><li> Bereid Resazurin voorraadoplossing bij een uiteindelijke concentratie van 0,8 mg / ml in H2O gefiltreerd door 0,22 urn poriegrootte PVDF membraan sterilisatie.</li><li> Bereid resazurin werkoplossing door mengen Resazurin voorraadoplossing, H2O en Tween-80 (20% oplossing in H 2 O) in een 2: 1: 1 ratio. Uiteindelijke concentraties 0,4 mg / ml resazurine en 5% Tween-80. </li><li> Met behulp van een plaatlezer, opstelling een programma fluorescentie afgelezen bij 530 nm excitatie en 590 nm emissie elke 30 min gedurende 24 uur bij 37 ° C. Voorverwarmen plaatlezer bij 37 ° C. </li><li> Voeg 20 ul van Resazurin werkoplossing alle relevante putjes (B2 tot G11) van de met geneesmiddel behandelde plaat (stap 4.11) een multi-channel pipet. </li><li> Plaats de plaat op de plaat lezer en start de set-up in stap 5.3 programma. Opmerking: Om de verwerking van grote hoeveelheden testplaten vergemakkelijken, kan worden volstaan ​​met de bepaling in een 37 ° C incubator ontwikkelen en uitvoeren van één leest fluorescentie elke 24 uur. Dit is ook van toepassing op gebruikers die geen toegang hebben tot een plaat reader met kinetische en incubatie bekwaamheden beschikken. </li></ol>

<ol><li>Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+seven+decades+of+antituberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery.</a> Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).</li>
<li>Bass, J. B. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+tuberculosis+and+tuberculosis+infection+in+adults+and+children.+American+Thoracic+Society+and+The+Centers+for+Disease+Control+and+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention.</a> Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).</li>
<li>Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+new+drug+discovery+for+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The challenge of new drug discovery for tuberculosis.</a> Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).</li>
<li>Palomino, J. C., Martin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMC207+becomes+bedaquiline%2C+a+new+anti-TB+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).</li>
<li>Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+for+early-stage+tuberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The future for early-stage tuberculosis drug discovery.</a> Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).</li>
<li>Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+anti-tuberculosis+drug+efficacy%3A+rethinking+bacterial+populations+and+how+we+model+them%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them.</a> Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).</li>
<li>Ekins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+back+to+the+future%3A+predicting+in+vivo+efficacy+of+small+molecules+versus+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis.</a> J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5 (10), e1000645(2009).</li>
<li>Hartkoorn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+drug+susceptibility+of+intracellular+and+extracellular+tuberculosis%2C+and+the+impact+of+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein.</a> Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).</li>
<li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput%2Fhigh-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. (83), e51114(2014).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intracellular+screen+for+new+compounds+able+to+inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).</li>
<li>Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+drug+uptake+in+phenotypically+resistant+nutrient-starved+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).</li>
<li>Dutta, N. K., Karakousis, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+duration+of+tuberculosis+treatment+be+shortened+with+higher+dosages+of+rifampicin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?</a> Front Microbiol. 6, 1117(2015).</li>
<li>van Ingen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Do+We+Use+600+mg+of+Rifampicin+in+Tuberculosis+Treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?</a> Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).</li>
<li>Donald, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+antituberculosis+agents+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children.</a> Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).</li>
<li>Schaaf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrophage+Infection+Model+to+Predict+Drug+Efficacy+Against+Mycobacterium+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis.</a> Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+leucine+and+pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs.</a> Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+transduction+designed+for+precise+high-throughput+unmarked+deletions+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis.</a> MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).</li>
<li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136 (1), 37-49 (2009).</li>
<li>Collins, L., Franzblau, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+alamar+blue+assay+versus+BACTEC+460+system+for+high-throughput+screening+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).</li>
<li>Snewin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben we gedetailleerd beschreven alternatieve Mtb infectiemodel geschikt voor drug werkzaamheid testen. Dit model houdt rekening met twee belangrijke factoren die meer rekening moet worden gehouden tijdens de vroege TB geneesmiddelenontwikkelingsproces: de aanwezigheid van fysiologisch relevante barrières voor penetratie van het geneesmiddel en metabolische veranderingen van Mtb tijdens infectie. Terwijl we eerder de voordelen van onze infectie model hebben laten zien en de mogelijkheid van het ...

<html> Tuberculose (tbc) blijft een ernstige bedreiging voor de wereldwijde gezondheid ondanks de beschikbaarheid van anti-TB chemotherapie regimes voor meer dan 40 jaar 1. Dit is deels te wijten aan de eis voor langere tijd de behandeling van meer dan 6 maanden gebruik van meerdere combinaties van geneesmiddelen, wat leidt tot niet-naleving 2 patiënt. De opkomst van resistente tbc in de afgelopen jaren nog verergerd problemen op een gebied waar de succesvolle ontwikkeling van klinisch goedgekeurde medicijnen is vrijwel non-existent 3. Sterker nog, ondanks uitputtende anti-TB geneesmiddelenontwikkeling slechts één geneesmiddel goedgekeurd door de FDA voor klinisch gebruik in de afgelopen 40 jaar 4. Zo worden nieuwe generaties anti-TB middelen dringend nodig om dit probleem aan te pakken. Een belangrijk probleem bij tuberculose geneesmiddelen is het gebrek aan succesvolle overdracht uit verbindingen met in vitro activiteit werkzaamheid in de klinische setting= &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Aanvankelijk werden doelwit gebaseerde benaderingen gebruikt om te screenen op anti-Mtb drugs 5, die niet aan te vertalen naar hele bacteriële cellen. Zelfs wanneer Mtb cellen worden gebruikt, wordt vaak uitgevoerd met behulp bouillon gekweekt culturen, die niet nauwkeurig kan voorspellen geneesmiddelefficiëntie in vivo 8, 9. Deze problemen zijn erkend en screeningstesten voor geneesmiddelen tegen macrofagen bevattende Mtb of latente Mtb werden met succes 8, 10, 11, 12. Echter, zelfs deze meer geavanceerde assays onvoldoende rekening met de penetratie barrières drugs tegenkomen in de niet-gevasculariseerd pulmonaire laesies en in de necrotische foci op de plaats van infectie. InderdaadZelfs voor de eerste lijn TB geneesmiddel rifampicine is suboptimale dosering ondervraagd door onvoldoende in vivo weefsel en cerebrospinale vloeistof (CSF) penetratie 13, 14, 15 en verminderde werkzaamheid tegen intracellulaire Mtb 8, 9. Als zodanig, nieuwe modellen en testen die rekening zou houden met deze parameters tijdens het voortouw ontwikkelingsproces vroeg zou ongetwijfeld verbeteren TB drug discovery inspanningen. Om aan deze behoefte te pakken, hebben we onlangs een goedkope, snelle en BSL-2 compatibele alternatieve infectie model voor MTB werkzaamheid van het geneesmiddel testen 16. Deze infectie model dichtbevolkte geproduceerd gepakt MTB in grote macrofagen aggregaat structuren, die fysiologisch relevante cellulaire penetratie barrières recapituleerde en genereerde macrofaag-gepasseerd <em&gt; MTB met een veranderde fysiologische toestand die lijkt op latente MTB. Mtb afgeleid van deze infectie model werd gecombineerd met de Resazurin microtiter assay (REMA) om de werkzaamheid van geneesmiddelen, waarvan de resultaten in overeenstemming met andere intracellulaire infectie modellen geproduceerd evalueren en goed gecorreleerd met de gerapporteerde vermogen van gemeenschappelijke TB drugs hoge CSF-concentraties ten opzichte van serumconcentraties bereiken 16. Hier beschrijven we in detail de generatie van MTB / macrofaag aggregaat structuren te produceren macrofaag gepasseerd MTB geschikt voor drug gevoeligheid testen met behulp van REMA. In het bijzonder tonen we hoe deze infectie systeem kan worden aangepast om een ​​96-well formaat voor compatibiliteit met screening van kandidaat anti-TB-geneesmiddelen.

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Volg de aanbevelingen van de fabrikant</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>Bereid 20% stockoplossing in H2O; filter steriliseren</td></tr><tr><td>D-Pantotheenzuur hemicalciumzout</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>Bereid 24 mg/mL stockoplossing in H2O; filter steriliseren</td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>MP Biomedicals</td><td>194694</td><td>Bereid 50 mg/mL stockoplossing in H2O; filter steriliseren</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>EMD Millipore</td><td>400051</td><td>Bereid 200 mg/mL stockoplossing in H2O</td></tr><tr><td>Nalgene Square PETG mediafles</td><td>Thermo Fisher</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 platelezer</td><td>Biotek</td><td></td><td>Uitwisselbaar met elke fluorescente platelezer en microscoop</td></tr><tr><td>Gen5 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Opname en analyse van rezasurin conversie</td></tr><tr><td>Rifampicine&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2679250</td><td>Bereid 10 mg/mL stockoplossing in H2O</td></tr><tr><td>Moxifloxacine Hydrochloride</td><td>Acros Organics</td><td>457960010</td><td>Bereid 10 mg/mL stockoplossing in H2O</td></tr><tr><td>Resazurin natriumzout</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>Bereid 800 &mu;g/mL stockoplossing in H2O; filter steriliseren</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164500</td><td>Bereid 20% stockoplossing in H2O; filter steriliseren</td></tr></tbody></table>

een high-throughput compatible assay te evalueren drug de werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor antituberculosegeneesmiddelen wordt belemmerd door de inefficiënte translatie van verbindingen met in vitro activiteit naar effectiviteit in de klinische setting. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een gebrek aan aandacht voor de fysiologisch relevante cellulaire penetratiebarrières die bestaan in de geïnfecteerde gastheer. We hebben onlangs een alternatief infectiemodel gevestigd dat grote macrofaagaggregatstructuren genereert die dicht gepakte M. tuberculosis (Mtb) in het midden bevatten, wat geschikt was voor geneesmiddelgevoeligheidstests. Dit infectiemodel is goedkoop, snel en het belangrijkste is BSL-2 compatibel. Hier beschrijven we de experimentele procedures om Mtb/macrofaagaggregatstructuren te genereren die macrofaag-gepassageerde Mtb zouden produceren voor geneesmiddelgevoeligheidstests. In het bijzonder demonstreren we hoe dit infectiesysteem direct kan worden aangepast aan het 96-well plate-formaat dat doorvoercapaciteit toont voor het screenen van verbindingsbibliotheken tegen Mtb. Over het algemeen is deze test een waardevolle aanvulling op de momenteel beschikbare Mtb geneesmiddelontdekkingstoolbox vanwege zijn eenvoud, kosteneffectiviteit en schaalbaarheid.

Om de robuustheid van aanpassing van deze infectie model 96-well plaat formaat bevestigen we hier onderzocht de drug gevoeligheid van Mtb afgeleid van onze 96-well aangepast infectiemodel tegen rifampicine (RIF) en moxifloxacine (Moxi) volgens het model weergegeven in figuur 1A. We tonen aan dat het genereren van Mtb / macrofaag aggregaatstructuren sleutel tot deze test betrouwbaar kan worden geproduceerd in een 96-well plaat formaat (Figuur 2),...

Nieuwe modellen en testen die het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor de volgende generatie tuberculosebestrijdende middelen zouden verbeteren, zijn zeer wenselijk. Hier beschrijven we een snelle, goedkope en BSL-2-compatibele test om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis te evalueren, die gemakkelijk kan worden aangepast voor screening met hoge doorvoer.

Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Het algemene doel van deze procedure is om op reproduceerbare wijze aggregaten van met mycobacterium tuberculosis geïnfecteerde macrofagen te genereren in een 96-wellsplaatformaat voor druggevoeligheidstesten met behulp van een levensvatbaarheidskleurstof. Deze methode kan het vroege proces van geneesmiddelenontwikkeling voor anti-tuberculoseverbindingen verbeteren, dat momenteel wordt belemmerd door de onproductieve vertaling van kandidaatverbindingen naar de klinische setting. Het belangrijkste voordeel van dit eenvoudige, goedkope en BSL-2-compatibele infectiemodel is dat het fysiologisch relevante cellulaire penetratiebarrières nabootst, die doen denken aan tuberculosegranulomen.Dit levert resultaten voor geneesmiddelgevoeligheid op die meer voorspellend zijn voor de in vivo effectiviteit. Begin deze procedure door groen fluorescent eiwit-expresserende M.tuberculosis MC squared 6206, hierna aangeduid als MTBGFP, voor te bereiden voor infectie. Houd er rekening mee dat dit een avirulente stam is, waardoor al het werk in het hier beschreven protocol kan worden uitgevoerd in een faciliteit met biosafety level twee.Centrifugeer voor elke 96-wellsplaat die wordt klaargezet 2,8 x 10⁸ MTBGFP bij 3.200 ×g gedurende vijf minuten in een centrifuge met zwaaibekerrotors. Aspireer na het centrifugeren het supernatant en voeg vijf milliliter RPMI toe om de bacteriën te wassen. Pipetteer herhaaldelijk op en neer om de cellen opnieuw te resuspenderen.Centrifuge vervolgens opnieuw. Giet na de tweede spinHet supernatant af en resuspendeer de bacteriële cellen in zeven milliliters RPMIC, en vortex vervolgens gedurende 10 seconden. Centrifuge daarna, voor elke 96-wells plaat die wordt klaargezet, zeven maal 10⁶ THP1 humane monocytaire cellen bij 250 ×g gedurende vijf minuten.Giet na de centrifugatie het supernatant af en resuspendeer de THP1-cellen in zeven milliliter RPMIC. Bereid vervolgens een 96-wells plaat voor op infectie door 200 microliter steriel water toe te voegen aan de wells in rij A en H en kolom 1 en 12. Deze waterrand voorkomt de verdamping van het kweekmedium.Voeg 200 microliter RPMIC toe aan kolom twee, B twee tot G twee, voor de achtergrondcontrole of blanco. Om de THP1-monocyt te infecteren, gebruikt u een pipet om de gehele voorbereide MTBGFP-bacteriële suspensie over te brengen naar de THP1-cel-suspensie en mengt u dit goed door herhaaldelijk op te zuigen en uit te pipetteren. De uiteindelijke THP1-celdichtheid is 5 × 10⁵ per milliliter en de bijbehorende multipliciteit van infectie per well is 40.Giet vervolgens de THP1 MTBGFP-suspensie in een reservoir van 25 milliliter en voeg daarna, met behulp van een multikanalenpipet, 200 µL THP1 MTBGFP-suspensie toe aan alle overige 96 wells, van E3 tot en met G11. Incubeer de plaat bij 37 °C, met 5% CO2 gedurende zeven tot 10 dagen. Vervang tijdens de incubatie elke twee dagen het medium met een multikanalenpipet door voorzichtig 100 µL verbruikt medium van de bovenkant van elke well te verwijderen en voorzichtig 100 µL voorverwarmde RPMIC toe te voegen.Bij het vervangen van het medium is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de MTB-macrofaagaggregaten op de bodem van de wells niet worden verstoord. Inspecteer de wells dagelijks visueel met een fluorescentiemicroscoop, uitgerust met bright-field en GFP-filtersets en een 4x tot 10x objectief. Noteer de grootte van de MTB-macrofaagaggregaten en maak indien gewenst afbeeldingen.Tegen dag zeven tot 10 zouden de MTB-macrofaagaggregaten groot genoeg moeten zijn om door te gaan met het testen van de drugseffectiviteit, zoals later in de video wordt beschreven. Bereid voor het drugstesten twee antituberculosemiddelen in triplo voor op een nieuwe 96-wellsplaat als volgt. Voeg eerst 125 microliters 7H9C-medium toe aan wells B2 tot en met G10.Bereid vervolgens de twee geneesmiddelen voor in een concentratie die tweemaal de hoogste gewenste eindconcentratie bedraagt in één milliliter 7H9C. Voeg met een pipette 250 microliters van elk geneesmiddel toe aan wells B, C en D 11 en vervolgens aan E, F en G 11 voor behandelingen in triplikaat. Verdun vervolgens de testgeneesmiddelen serieel met een factor twee met behulp van een multichannel pipette door 125 microliters van B 11 tot en met G 11 over te brengen naar B 10 tot en met G 10.Meng door vijf keer te pipetteren bij elke stap. Verplaats vervolgens 125 microliters van kolom naar kolom van rechts naar links over de plaat, en stop na kolom vier. Gooi na het mengen van kolom vier 125 microliters weg in een afvalbak.Kolom twee en drie mogen geen geneesmiddelen bevatten. Hierdoor kunnen ze worden gebruikt als achtergrond en voor positieve groeicontroles. Haal vervolgens de 96-wellplaat met de MTB-geïnfecteerde macrofagen uit de incubator.Verwijder zonder de plaat te kantelen met een meerkanaals pipet 150 µL medium uit wells B2 tot en met G11. Kantel de plaat vervolgens zoals hier getoond, steek de pipetpunten in de onderste rand van de wells en verwijder het resterende medium, ongeveer 50 µL. Omdat de MTB-macrofaagaggregaten aan de bodem van de well hechten, mag er geen materiaal verloren gaan.Echter moet het verwijderen van het medium zo voorzichtig mogelijk gebeuren en moet er zorg worden betracht om resuspensie tijdens dit proces te voorkomen. Voeg voorzichtig 100 µL 7H9C-medium toe aan wells B2 tot en met G11 van de plaat, waarin de MTB-macrofaagaggregaten zich bevinden. Breng met een meerkanaals pipet 100 µL van de 96-wellsplaat met het geneidingsmiddel over naar de overeenkomstige wells van de infectieplaat.Plaats de plaat vervolgens in een afgesloten zak en incubeer deze gedurende drie dagen bij 37 °C. De resazurine-assay is gebaseerd op de oxidatieve species die worden geproduceerd door metabolisch actieve MTB om het blauwe resazurine om te zetten in fluorescent roze resorufine. De kleurverandering en fluorescentie kunnen worden gebruikt als surrogaatmarker om de hoeveelheid bacteriële groei te bepalen.Bereid een voorraadoplossing van resazurine met een eindconcentratie van 8 mg/ml in water. Filter deze voor sterilisatie door een PVDF-membraan met een poriegrootte van 22 µm. Bereid een werkoplossing van resazurine door de voorraadoplossing, water en Tween-80 te mengen in een verhouding van twee op één op één.De uiteindelijke concentraties zijn 4 mg/mL resazurin en 5% Tween-80. Stel met een platenlezer een programma in om de fluorescentie te meten bij een excitatie van 530 nm en emissie van 590 nm gedurende 24 uur, elke 30 minuten bij 37 °C. Warm de platenlezer vooraf op tot 37 °C.Voeg met een meerkanaalpipet 20 µL resazurin-werkoplossing toe aan putjes B2 tot en met G11 van de plaat met geneesmiddelbehandelingen. Plaats de plaat in de reader en start het programma. Om de robuustheid van het aanpassen van dit infectiemodel aan het 96-wellsplaatformaat te bevestigen, werd de gevoeligheid van MTB rifampicine RIF voor moxifloxacine moxy beoordeeld zoals beschreven in deze video.Zoals hier wordt aangetoond, zijn MTB-macrofaag-aggregaatstructuren succesvol gegenereerd in een 96-wellplate-formaat, waardoor compatibiliteit met high-throughput-methoden mogelijk werd gemaakt. Om de omzetting van resazurine als indicator voor bacteriële groei kwantitatief te meten, werd de fluorescentie van individuele wells kinetisch gedurende 24 uur gemonitord. De aanwezigheid van levensvatbare MTB-cellen wordt bepaald door de omzetting van de blauwe resazurine-kleurstof naar de roze gereduceerde vorm, wat kwantitatief wordt weerspiegeld door de relatieve fluorescentienetten op het tijdstip van verzadiging.Deze representatieve minigrafieken tonen de resulterende fluorescentie-eenheden op de Y-as tegenover de tijd op de X-as. Om drug-susceptibility killing-curves te genereren, werden de met rifampicine en moxifloxacine behandelde wells genormaliseerd naar de maximale MTB-groei van de controle zonder medicijn als 100% overleving. Achtergrondcontroles van blanco signalen werden van elke monster-well afgetrokken.Het overlevingspercentage werd uitgezet voor elke individuele drugconcentratie om een dodingcurve te genereren. Deze gegevens tonen aan dat de minimale remmende concentratie — gedefinieerd als de laagste concentratie van het antibioticum waarbij een groeiremming van 90% wordt waargenomen — groter is dan 2 µg/mL voor zowel rifampicine als moxifloxacine tegen MTB afgeleid van ons infectiemodel. Bijgevolg is de minimale remmende concentratie van deze twee geneesmiddelen tegen MTB, met gebruik van ons infectiemodel en assay, meer representatief voor de in vivo activiteit van deze middelen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u betrouwbaar en reproduceerbaar MTB-geïnfecteerde macrofaag-aggregaatstructuren kunt genereren voor drugsusceptibiliteitstesten met behulp van de resazurine-assay. Na het volgen van deze procedure kan het drugssjabloon eenvoudig worden aangepast van de getoonde twee drugs naar een library-panel van 58 drugs om high-throughput drugscreening mogelijk te maken.

a-high-throughput-compatible-assay-to-evaluate-drug-efficacy-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an assay to evaluate the efficacy of drugs against Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection. An in vitro infection model containing Mtb/macrophage aggregates is generated that mimics in vivo infection. Upon introducing suitable antibiotics, their efficacy is tested via resuzarin assay to monitor the survival of bacteria with increasing drug concentrations.

An Assay to Evaluate Drug Efficacy against a Mycobacterium tuberculosis Infection Model

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Snelle en efficiënte kwantificering van intracellulaire M. tuberculosis-groei is cruciaal voor het nastreven van verbeterde therapieën tegen tuberculose (TB). Dit protocol beschrijft een op bouillon gebaseerde colorimetrische detectietest met behulp van een geautomatiseerd vloeistofkweeksysteem om de Mtb-groei te kwantificeren in macrofagen die worden behandeld met kandidaat-gastheergerichte therapieën.

Een geautomatiseerd kweeksysteem voor gebruik bij preklinische tests van gastheergerichte therapieën voor tuberculose

De bepaling van kolonievormende eenheden (CFU) is de gouden standaardtechniek voor het kwantificeren van bacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculosis, die weken nodig heeft om zichtbare kolonies te vormen. Hier beschrijven we een micro-CFU voor CFU-bepaling met verhoogde tijdsefficiëntie, lagere laboratoriumruimte en reagenskosten, en schaalbaarheid voor experimenten met gemiddelde en hoge doorvoer.

Microkolonievormende eenheidstest voor evaluatie van de werkzaamheid van vaccins tegen tuberculose

Deze studie ontwikkelde een test voor high-throughput screening tegen Mycobacterium abscessus met een recent gecreëerde dubbele reporterstam, waarbij fluorescentie en luminescentie worden gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën snel te beoordelen. Dit protocol zal relevant zijn voor onderzoekers die nieuwe geneesmiddelen willen screenen op deze resistente bacterie.

Ontwikkeling van tests voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën

Deze studie biedt een protocol voor het evalueren van de interactie van Mycobacterium tuberculosis met de SLAMF1 microbiële sensor. De tests werden uitgevoerd op van menselijke monocyten afgeleide macrofagen met behulp van flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie. De beschreven instrumenten zijn relevant voor het bestuderen van interacties tussen pathogenen en immunoreceptoren.

Fluorescentietesten voor de studie van Mycobacterium tuberculosis Interactie met de immuunreceptor SLAMF1

Mycobacterium tuberculosis vormt drug tolerant biofilms wanneer gekweekt in bepaalde omstandigheden. Hier beschrijven werkwijzen voor het kweken M. tuberculose biofilms en het bepalen van de frequentie van de drug tolerante persisters. Deze protocollen zullen nuttig zijn voor verdere studies naar de mechanismen van tolerantie in M. tuberculose.

Groei Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Tuberculose en malaria zijn twee van de meest voorkomende infecties bij mensen en de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in arme bevolking in de tropen. Wij vestigden een experimenteel model systeem om resultaten van malaria-tuberculose co-infectie te bestuderen in muizen na challenge met beide ziekteverwekkers via hun natuurlijke route van infectie.

Een experimenteel model om te studeren Tuberculose-Malaria Coinfection op Natuurlijke Transmissie van Mycobacterium tuberculosis En Plasmodium berghei</i

Een amplificatie microarray combineert asymmetrische PCR-amplificatie en microarray hybridisatie in een enkele kamer, die aanzienlijk stroomlijnt microarray workflow voor de eindgebruiker. Vereenvoudiging microarray workflow is een noodzakelijke eerste stap voor het maken van microarray-gebaseerde diagnostiek die routinematig kan worden gebruikt in een lagere-resource-omgevingen.

Aantonen van een multiresistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Versterking Microarray

Leer een high-throughput assay voor het testen van geneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis in macrofaagaggregaten. Deze BSL-2 compatibele methode voorspelt in vivo werkzaamheid betrouwbaarder.

Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd

Meer video's verkennen