Name: Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer directe herprogrammering van muizenembryonale fibroblasten naar geïnduceerde cardiomyocyten met GHMT-transcriptiefactoren. Deze methode kwantificeert atriale, ventriculaire en pacemakersubtypen voor mechanistische studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.F.-P. werd ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder Grant No.2015165336. N.V.M werd ondersteund door subsidies van de NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838) en de March of Dimes (#5-FY14-203). We danken Young-Jae Nam, Christina Lubczyk en Minoti Bhakta voor hun belangrijke bijdragen aan protocolontwikkeling en data-analyse. We danken ook John Shelton voor waardevolle technische input en leden van het Munshi-lab voor wetenschappelijke discussie.

Alle experimentele procedures waarbij dieren praktijken werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op UT Southwestern Medical Center. 1. Isolatie van Hcn4-GFP E12.5 muis embryonale fibroblast (MEF) <ol><li> Opzetten getimede paringen tussen homozygote Hcn4-GFP mannen en CD-1 vrouwtjes. </li><li> Sacrifice zwangere vrouw op E12.5 door kooldioxide euthanasie en de daaropvolgende cervicale dislocatie. <ol><li> Verwijder baarmoederhoorns met ontleden tang zoals eerder beschreven 22, 23, en plaats ze in een petrischaal op ijs met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + of Mg2 +. </li></ol></li><li> Voer alle volgende stappen in de weefselkweek kap met behulp van steriele techniek. <ol><li> Verwijder het embryo van de baarmoeder en vruchtwater sac met een schaar en forceps ontleden. Houd de placenta bevestigd voor een betere behandeling. pregnant CD-1 vrouwtjes meestal baren tussen de 10 en 14 pups. </li><li> Met behulp van ontleden tang, neem de geïsoleerde embryo&#39;s en snel spoel ze twee keer in 70% (v / v) EtOH. NB: De wast moet snel om celdood te minimaliseren. </li><li> Verwijder het hoofd, de ledematen, de staart, en de inwendige organen, zoals het hart van de geïsoleerde embryo&#39;s. </li><li> Plaats de resterende weefsel in een 10-cm schaal met 1 mL 1 x PBS en fijn gehakt met een steriel scheermesje ongeveer 1 mm3 groot. </li><li> Transfer gehakt weefsel in een 50 ml conische buis met PBS. </li><li> Spin bij 300 g gedurende 3 min. Zorgvuldig aspireren overtollige PBS. </li><li> Voeg 1 ml steriel 0,25% trypsine-EDTA per embryo. Incubeer cellen in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Meng de buis om de 4 min. Over-vertering van het weefsel zal aanzienlijk lager de opbrengst. </li><li> Vortex celmengsel op maximale snelheid (3200 rpm) voor 4 s. </li><li> Voeg 2 ml fibroblast media per embryo en meng. filter through een 100 um zeef cel met een pipet om de cellen te helpen door de zeef. Zie tabel 1 voor de formulering van alle latere media. </li><li> Spin bij 300 g gedurende 4 min. Zorgvuldig aspireren supernatant. </li><li> Voeg 10 ml vers fibroblast media per 3 embryo&#39;s en vermaal 6-10 keer. </li><li> Plate de cellen in 1 15-cm weefselkweek schotel voor elke 3 embryo&#39;s voorbereid. Cultuur overnacht in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. </li><li> Na de nacht incubatie, vervang dan de media met verse 30 ml media per plaat. Plaats cellen terug in de incubator &#39;s nachts. LET OP: Controleer Hcn4-GFP + cell besmetting onder een fluorescentiemicroscoop. De cultuur moet GFP zijn - en slechts geworden GFP + bij herprogrammering. </li><li> De volgende dag, oogst cellen met 3 ml verse voorverwarmde 0,25% trypsine-EDTA. Tellen en vries cellen. Gewoonlijk bevriezen cellen op 3 x 10 6 cellen per ml. De verwachte yield moet 3 x 10 6 cellen per embryo. </li></ol></li></ol> 2. Retrovirus Productie en herprogrammeren Let op: De volgende protocol vereist productie en behandeling van besmettelijke retrovirussen. Voer de volgende stappen in een Biosafety Level 2 kabinet onder BSL-2 richtlijnen en steriele techniek. Gebruik 10% bleekmiddel te ontdoen van alle materialen worden blootgesteld aan retrovirussen. <ol><li> Retrovirus productie en MEF voorbereiding Opmerking: Het volgende protocol is retrovirale productie in 6-well platen en MEF infectie in 24-well platen. Voor andere formaten, zie Tabel 2. MEF worden uitgeplaat op dag -1, zodat de timing moet op passende wijze worden gecoördineerd voor elk experiment (zie paragraaf 2.3 en figuur 2). <ol><li> Onderhouden Plat-E (PE) cellen volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Kort cultuur PE cellen in DMEM gesupplementeerd met 10% FBS, 1 ug / ml puromycin, 10 ug / ml blasticidine, penicilline en streptomycine. Passage cellen 1: 4 om de twee dagen dat de kweek 70-90% samenvloeiing bereikt. </li><li> Dag -2: De dag voor transfectie, zaad Plat-E cellen op 1 x 10 6 cellen / putje op 6-wells plaat in transfectiemedium. De cellen moeten 70-80% confluent bij de transfectie worden. </li></ol></li><li> Transfectie met een commerciële transfectie agens. OPMERKING: De commerciële reagentia moeten bij kamertemperatuur (KT) vóór transfectie. Voor de DNA-transfectie, voeg ieder retroviraal plasmide-DNA afzonderlijk (G, H, M en T) een GHMT cocktail 9 vormen. <ol><li> Dag 1: In een 15 ml conische buis polystyreen, meng 60 pl gereduceerd serum medium met 6 pl transfectiereagens per reactie voor een 6-well plaat formaat. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: omdat de transfectiereagens hier gebruikt bindt aan kunststoffen, eendd direct naar gereduceerd serum medium aan een afname van transfectie-efficiëntie te vermijden. </li><li> Voeg een totaal van 2 ug GHMT cocktail per reactie en tik voorzichtig te mengen. Doe niet vortex. Incubeer het reactiemengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg het mengsel uit stap 2.2.3 op de PE-cellen in een druppelsgewijs wijze. </li><li> Incubeer de getransfecteerde Plat-E cellen overnacht in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Noteer de tijd van transfectie. </li></ol></li><li> Seeding van Hcn4-GFP muis embryonale fibroblasten. <ol><li> 1 uur voor plating MEF, voor te bereiden van een 24-wells plaat voor immunocytochemie. <ol><li> Voeg een 12 mm fibronectine dekglaasje per putje. </li><li> Coat putjes met 300 pl collageen oplossing (bijvoorbeeld surecoat) en incuberen in een 37 ° C incubator gedurende 1 uur. </li><li> Zuig coating oplossing onmiddellijk voor MEF plating. </li></ol></li><li> Ontdooi een bevroren flesje Hcn4-GFP MEFs en wassen x1 met voorverwarmde fibroblast media bij 500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van trypan blauw uitsluiting of vergelijkbare kleurstoffen. Bereken het aantal levensvatbare cellen per ml kweek met de volgende formule: % Levensvatbare cellen = [1.00 - (Aantal blauwe cellen / totaal aantal cellen)] x 100 <ol><li> Bereken totaal aantal levensvatbare cellen met behulp van de volgende formule: Levensvatbare cellen =% levensvatbare cellen x verdunningsfactor x 10.000 x totale volume van de celsuspensie </li></ol></li><li> Zaad 3 x 10 4 cellen per putje op een 24-well plaat met vooraf bereide collageen oplossing fibronectine dekglaasje. </li></ol></li><li> Transductie en herprogrammering van MEF LET OP: Volgens de instructies van de fabrikant, goed onderhouden Plat-E cellen produceren een gemiddelde titer van 1 x 10 7 infectie eenheden / ml. Hoewel de titer niet direct gemeten voor elk experiment wordt een GFP controle altijd opgenomen als een surrogaat voor infectie-efficiëntie.Hoge GFP expressie en intensiteit (GFP +&gt; 95%) correleert meestal met succesvolle-GHMT bemiddelde generatie iCLMs. <ol><li> Dag 0: 24 h na transfectie, filtreer de PE retrovirale medium door een 0,45 urn poriegrootte vrij van oppervlakteactieve celluloseacetaatfilter en overbrengen naar een 15 ml conische buis. polybreen voegen tot een eindconcentratie van 8 ug / ml. vullen cellen voorzichtig met 2 ml vers medium transfectie. OPMERKING: Cellen gemakkelijk los te maken van de plaat als media te snel wordt veranderd. </li><li> Zuig het medium van de gekweekte MEF en voeg de vers verzameld retrovirale medium; het moet 1,7 ml van media opbrengst per putje van een 6-wells plaat. Voeg ~ 800 ul per putje van een 24-well plaat. Terug MEF plaat naar de incubator en incubeer overnacht. </li><li> Dag 1: Herhaal stap 2.4.1 en 2.4.2. Gooi cellen na de 2e virus collectie. Terug besmette MEF tot de couveuse en laat ze rusten &#39;s nachts. </li><li> Dag 2: 48 uur na inductie, zuigen de cel geconditioneerde media en wassen x1 met 1x PBS. Voeg 500 ul voorverwarmd iCLM media per putje van een plaat met 24 putjes. </li><li> Vervang iCLM media om de 2-3 dagen. Plate met 14 dagen na virale inductie voor immunocytochemie (ICC) analyse van cardiale herprogrammering. </li></ol></li></ol> 3. Immunokleuring van geherprogrammeerd MEF <ol><li> 14 dagen na inductie voorzichtig zuigen de media. </li><li> Spoel elk putje met 300 pl ijskoude 1x PBS. Aspireren overtollige oplossing. </li><li> Fix cellen met 250 ul van 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing per putje van een plaat met 24 putjes. Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: - 2 weken vóór kleuring vaste cellen voor 1 worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C. </li><li> Doorlaatbaar cellen door wassen x3 putjes met 300 pl 0,1% PBS-Triton 100 (PBST). Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur tussen wasbeurten. Aspireren overtollige oplossing na de laatste wasbeurt. </li><li> Blok 10min bij kamertemperatuur met 1 x Universal Block Buffer bij 300 ul / putje. </li><li> Bereid (ICC) vlekken buffer: Voeg 1: 1 van 1x PBS en 1x Universal blokkerende buffer. Verdunde primaire antilichamen ICC kleurbuffer antilichamen en incubeer overnacht bij 4 ° C. Raadpleeg bij materialen voor de aanbevolen verdunningen. <ol><li> Vlekken op een paar van de dia&#39;s met de muis α-actinine, kip αGFP, en konijn NPPA voor iPM en Iam identificatie. </li><li> Vlekken op een paar van de dia&#39;s met de muis α-actinine, kip αGFP, en konijn Myl2 voor iPM en IVM identificatie. </li></ol></li><li> De volgende dag was x3 putjes met 300 pl 0,1% PBST. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur tussen wasbeurten. Aspireren overtollige oplossing na de laatste wasbeurt. </li><li> Bereid het secundaire antilichaam verdunningen in ICC vlekken buffer. Raadpleeg bij materialen voor de aanbevolen verdunningen. Incubate secundaire antilichamen 1 uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht. <ol><li> Vlekken op alle dia&#39;s met de volgende secundaire antibodies: muis Alexa-555, kip Alexa-488, en konijn Alexa-647. </li></ol></li><li> Was x3 putjes met 300 pl 0,1% PBST. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur tussen wasbeurten. Beschermen tegen licht. </li><li> Voeg 2,4 ul van fixeermiddelen bevattende 1,5 ug / ml 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) een microscoopglaasje. Haal de dekglaasje uit de bron van de 24-well plaat, verwijderen overtollige oplossing, en over te dragen aan het glaasje met montage media. Druk de dekglaasje om overtollige volume en de lucht te verwijderen. </li><li> Seal dia&#39;s met voorkeur nagellak of plastic kit. Store gemonteerde dia&#39;s bij 4 ° C beschermd tegen licht. </li></ol> 4. Identificatie van Cardiac subtypen met behulp van confocale microscopie Opmerking: Voor beeldvorming, een confocale microscoop uitgerust met ten minste 2 fluorescerende detectoren kunnen spectrale detectie bij 405, 488, 555 en 639 nm golflengte is noodzakelijk om IPMS, IAMS en iMVS identificeren. image cellen met een Plan-Apochromat 20X / 0.75 objectief of beter. Met behulp van beeldanalyse van de fabrikant software, scannen zoom beelden kunnen bereiken 40X-olie-immersie kwaliteit foto&#39;s. <ol><li> Beeldbank: neem 8-bits afbeeldingen met DAPI, Alexa-488, Alexa-555 en Alexa-647 kanalen (l.). Pixel verblijftijd van 6 s, 1024 framemaat, lijn stap voor stap 2, en middeling van 2 voldoende is voor beelden met hoge resolutie. </li><li> Voor elke dia, te beginnen van de ene kant en beginnen met het scannen op en neer in de rode fluorescerende kanaal (ch.) Voor α-actinine + sarcomeer + cellen (zie figuur 3 en figuur 5A voor voorbeelden). Sarcomeer strepen worden gemakkelijker visueel identificeren de golflengte 555 nm. <ol><li> Zodra een α-actinine + sarcomeer + cel is geïdentificeerd, over te schakelen naar de groene ch. en houdt opmerking als het positief is (IPM). Schakel over naar de computer om de ver-rode 647 ch beoordelen. (IAM of IVM). OPMERKING: Cellen dieα-actinine + / sarcomeer + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - worden aangeduid als IPMS. GFP expressie wordt gezien gehele cellen (Figuur 4A). </li><li> Vlek dia&#39;s met α-actinine (muis-Alexa555), Hcn4-GFP (kip-Alexa488), NPPA (konijn-Alexa647) en DAPI. Cellen die zijn α-actinine + / sarcomeer + / Hnc4-GFP - / + NPPA zijn IAM. NPPA vlekken verschijnen perinucleaire en gestippelde (figuur 4B). </li><li> Vlek dia&#39;s met α-actinine (muis-Alexa555), Hcn4-GFP (kip-Alexa488), Myl2 (konijn-Alexa647). Cellen positief voor α-actinine + / sarcomeer + / Hnc4-GFP - / + Myl2 zijn IVMS. Myl2 vlekken zal een gegroefde vorm langs de sarcomeer filament vertonen. Door variaties in de kwaliteit van de kleuring en het Z-vlak, strepen niet altijd gemakkelijk zichtbaar (figuur 4C) zijn. </li></ol></li></ol> Opmerking: Om het werkelijke aantal potentieel geherprogrammeerd MEFs beoordelen worden 2 putjes van een plaat met 24 putjes gezaaid parallel aan de experimentele putjes en worden geoogst één dag na uitplaten. Het totale aantal cellen uitgeplaat wordt dan bepaald door het middelen van de twee putten. Dit wordt de werkelijke totale cellen uitgeplaat (totaalVitamine). <ol><li> sarcomeer + <ol><li> Inspecteer visueel elke cel op een dekglaasje voor een goede α-actinine + / sarcomeer + (Rechts panelen Figuur 3) en record (figuur 5B-i). </li><li> Tabelleren het totale aantal α-actinine + / + sarcomeer op elke dekglaasje en delen door de werkelijke totale geplateerde cellen (totaalVitamine) (figuur 5B-iii). Als bijvoorbeeld totaalVitamine = 12.500 cellen en 100 cellen werden a-actinine + / + sarcomeer dan 0,8% van de geïllustreerde MEFs werden geprogrammeerd. Een gemiddeldereprograming experiment opbrengst 1% α-actinine + / + cellen sarcomeer (figuur 5C). </li></ol></li><li> subtype + LET OP: Voor de volgende stappen, zie figuur 5B / C voor een representatieve iCLM kwantificering workflow. Kort voor elke sarcomeer + cel tabelleren als het is uniek voor zowel subtype (figuur 5B-i). Bereken% Subtype (figuur 5B-iii) door het aantal subtype + delende via gemiddelde sarcomeer + cellen x 100 (figuur 5B-i). De absolute subtype% efficiëntie (figuur 5B-iv) berekenen, deelt het subtype + celaantal figuur 5B-i door het totale aantal cellen gezaaid x 100 (figuur 5B-ii). <ol><li> Voor elk van de α-actinine + / + cellen sarcomeer, beoordelen of ze GFP +, NPPA + of Myl2 <sup&gt; +. </li><li> Tabelleren totale aantal α-actinine + / sarcomeer + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinine + / sarcomeer + / Hnc4-GFP - / NPPA + en α-actinine + / sarcomeer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + cellen (Figuur 5B-i). </li><li> Om het percentage van elk subtype te berekenen, verdeel het aantal Subtype + cellen door het totale aantal α-actinine + / sarcomeer + cellen in die goed en vermenigvuldig dat met 100. GHMT genereert IPMS, Iams, en iVMS op ongeveer gelijke verhoudingen (figuur 5B-iii). </li><li> Het absolute aantal subtype + cellen berekenen, deelt het totale aantal subtype + cellen voor de experimentele conditie door totaalVitamine en vermenigvuldig met 100 (figuur 5B-ii). Gemiddeld IPMs vertegenwoordigt 0,3% van de totale geïnfecteerde celpopulatie IAMS 0,3%, eniVMS 0,25% (Figuur 5B-iv). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sissman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+landmarks+in+cardiac+morphogenesis%3A+comparative+chronology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology.</a> Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).</li>
<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).</li>
<li>Ali, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existing+cardiomyocytes+generate+cardiomyocytes+at+a+low+rate+after+birth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).</li>
<li>Lin, Z., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+cardiac+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Strategies for cardiac regeneration and repair.</a> Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231(2014).</li>
<li>Writing Group, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2016+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li>
<li>Fu, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+fibroblasts+toward+a+cardiomyocyte-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state.</a> Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).</li>
<li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1%2Fprotein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+Is+a+Key+Epigenetic+Barrier+to+Direct+Cardiac+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocytes+requires+suppression+of+pro-fibrotic+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling.</a> Nat Commun. 6, 8243(2015).</li>
<li>Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+steady+progress+on+direct+cardiac+reprogramming+toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application.</a> Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).</li>
<li>Atkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+molecular+mapping+of+the+left+and+right+ventricular+His-Purkinje+conduction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).</li>
<li>Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+cardiomyocyte+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Atrial cardiomyocyte calcium signalling.</a> Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).</li>
<li>Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+mouse+ventricular+conduction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of the mouse ventricular conduction system.</a> Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).</li>
<li>Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25406392">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConner%2C+DA+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Ichim, C. V., Wells, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+viral+preparations+by+concentration+using+successive+rounds+of+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation.</a> J Transl Med. 9, 137(2011).</li>
<li>Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nat Commun. 5, 5807(2014).</li>
<li>Muraoka, N., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+myocytes+to+reverse+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis.</a> Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).</li>
<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).</li>
<li>Bass, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+identifies+signaling+pathways+regulating+distinct+signatures+of+cardiac+myocyte+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De huidige studie geeft een directe herprogrammering strategie voor de omzetting van MEF in een gevarieerde set van cardiale subtypes via-retrovirus gemedieerde expressie van het cardiale transcriptiefactoren GATA4, MEF2C, Tbx5 en hand2 (GHMT). Met behulp van een multiplex immunokleuring aanpak in combinatie met een PM-specifieke reporter muis, zijn we in staat om IAM, iVMS en IPMS identificeren enkele resolutie cel. Een dergelijke bepaling maakt een experimenteel in vitro systeem kan isoleren van de individuel...

Het hart is het eerste functionele orgel te ontwikkelen in het embryo 1, 2. In combinatie met de bloedsomloop, levert zuurstof, voedingsstoffen, en een mechanisme afval tijdens de ontwikkeling. Drie weken na de bevruchting, het menselijk hart klopt voor het eerst en het juiste regulering wordt onderhouden door cardiomyocyten (CM). Het onomkeerbare verlies van deze gespecialiseerde cellen is dan ook de fundamentele kwestie onderliggende progressieve hartfalen. Terwijl sommige organismen zoals de zebravis en Xenopus het potentieel voor cardiale herstel, het zoogdierhart volwassene beperkter 3, 5, 6. Aldus gezien de kritische functie van het hart, is het niet verwonderlijk dat hartziekte is de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld is, en 600.000 sterfgevallen in de Verenigde Staten alleen 7. Dewaardo or, op cellen gebaseerde therapieën om efficiënt te repareren of te vervangen de geblesseerde myocard zijn van groot klinisch belang. De oorspronkelijke studie van Yamanaka en collega 8 toonde dat geforceerde expressie van vier transcriptiefactoren voldoende volledig gedifferentieerde fibroblastcellen omzetten pluripotente stamcellen. Echter, het tumorigene vermogen van pluripotente stamcellen strategieën kritisch belang bij het gebruik voor therapeutische doeleinden is. Dit motiveerde de wetenschappelijk gebied om te zoeken naar alternatieve methoden om cellen transdifferentiëren terwijl het vermijden van een pluripotent podium. Onlangs hebben verschillende groepen de haalbaarheid van deze strategie getoond door weergave van de directe omzetting van muizen fibroblasten geïnduceerde cardiomyocyt-achtige cellen (iCLMs) met de ectopische expressie van transcriptiefactoren GATA4, MEF2C, Tbx5 en later hand2 (GMT en GHMT respectievelijk) 9, 10. Furthermore kan dezelfde strategie worden uitgevoerd in vivo en in mensen afgeleide weefsels 9, 11, 12. Recente studies hebben bijkomende factoren of signaleringsroutes die kunnen worden gemoduleerd cardiale herprogrammering efficiëntie 13, 14, 15 verder te verbeteren gemarkeerd. Samengevat, deze studies tonen het potentieel van gerichte transdifferentiatie regeneratieve therapieën. Echter, de lage efficiëntie van CM herprogrammering, het onbekende moleculaire mechanismen, inconsistent reproduceerbaarheid als gevolg van methodologische verschillen 16, en de heterogene aard van iCLMs blijven ongeadresseerde. Om iCLM heterogeniteit direct evalueren, hebben we een discrete en robuuste eencellige assay voor de identificatie van sarcomeer ontwikkeling en cardiale lineage specification-twee noodzakelijke kenmerken functionele cardiomyocyten. Er zijn minstens drie belangrijke types van CM in het hart als gedefinieerd door hun locatie en unieke elektrische eigenschappen: atriale (AM), ventriculaire (VM) en pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. In een georkestreerde combinatie, ze laten de juiste pompen van bloed. Tijdens het hart letsel, misschien één of alle subtypes worden beïnvloed, en de aard van celtherapie nodig zou hebben op een case-by-case basis worden aangepakt. Momenteel hebben de meeste strategieën gericht op de totale productie van hartspiercellen, terwijl weinig werk wordt gedaan om de moleculaire mechanismen die subtype specificatie regelt bestuderen. De volgende studie beschrijft hoe om goed te kwantificeren goed georganiseerde sarcomeren en identificeren van een gevarieerde set van cardiomyocyt subtypes. Met behulp van een pacemaker (PM) -specifieke reporter muis, zijn we in staat om een ​​i toe te passenmmunocytochemical benadering van geïnduceerde atriale-achtige myocyten (IAM), veroorzaakte ventriculaire-achtige myocyten (IVM), en geïnduceerde PM-achtige myocyten (IPMS) 21 te onderscheiden. Op basis van onze observaties, alleen cellen die sarcomeer organisatie vertonen zijn in staat om spontaan kloppen. Deze unieke herprogrammering platform maakt het mogelijk voor de beoordeling van de rol van bepaalde parameters in sarcomeer organisatie, subtype specificatie, en de efficiëntie van CM herprogrammering op single-cell resolutie.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Component van iCLM media, Plat-E media, fibroblast en Transfectie media</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11150059</td><td>Component van iCLM media</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td>Component van iCLM media, Plat-E media, fibroblast en Transfectie media</td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td>Component van iCLM media</td></tr><tr><td>MEM vitamine oplossing</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-052</td><td>Component van iCLM media</td></tr><tr><td>MEM aminozuren</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1601149</td><td>Component van iCLM media</td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td>Component van iCLM media</td></tr><tr><td>Antibioticum-Antimyoticum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Component van iCLM media</td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Component van iCLM media</td></tr><tr><td>Hitte-inactiveerd Paardenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-088</td><td>Component van iCLM media</td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-70</td><td>Component van iCLM media</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1514022</td><td>Component van Plat-E media en fibroblast media</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11139-03</td><td>Component van Plat-E media</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-128P</td><td>Component van Plat-E media</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>Component van Fibroblast media</td></tr><tr><td>Confocal laser scanning LSM700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Voor confocale analyse</td></tr><tr><td>FuGENE 6 transfectiereagens</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>Inductiereagens. Gebruik bij een eindconcentratie van 8 &mu;M/mL</td></tr><tr><td>Platinium-E (PE) Retrovirale Packaging Cell Line, Ecotropic</td><td>CellBiolabs</td><td>RV-101</td><td>Retrovirale pacaking cell line</td></tr><tr><td>Trypsine 0,25% EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Voor MEFs en Plat-E dissociatie</td></tr><tr><td>Muis anti &alpha;-Actinine (Clone EA-53)</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>Antilichaam voor confocale analyse. Gebruik bij 1:200</td></tr><tr><td>Kip anti-GFP IgY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10262</td><td>Antilichaam voor confocale analyse. Gebruik bij 1:200</td></tr><tr><td>Konijn Pab anti-NPPA</td><td>Abgent</td><td>AP8534A</td><td>Antilichaam voor confocale analyse. Gebruik bij 1:400</td></tr><tr><td>Konijn Pab anti Myl2 IgG</td><td>ProteinTech</td><td>10906-1-AP</td><td>Antilichaam voor confocale analyse. Gebruik bij 1:200</td></tr><tr><td>Vectashield oplossing met DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td>Kleurstof voor confocale analyse</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscoop slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25 x 75 x 1,0 mm</td></tr><tr><td>BioCoat Fibronectine 12 mm coverslips</td><td>NeuVitro Corp</td><td>GG-12-1.5</td><td>Coverslips voor confocale analyse</td></tr><tr><td>100 &mu;m cel zeef</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu;m Spritzfilter SFCA 25MM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-740-106</td><td>Voor virus filtratie</td></tr><tr><td>6 mL Spritzen</td><td>Covidien</td><td>8881516937</td><td>Voor virus filtratie</td></tr><tr><td>Geit anti-Kip IgY (H&amp;L) A488</td><td>Abcam</td><td>AB150169</td><td>Secundair antilichaam voor confocale analyse. Gebruik bij 1:400</td></tr><tr><td>Ezel anti-konijn A647 IgG(H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td>Secundair antilichaam voor confocale analyse. Gebruik bij 1:400</td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG(H+L) A555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>Secundair antilichaam voor confocale analyse. Gebruik bij 1:400</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ml</td><td>Voor cel permeabilisatie</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS zonder CaCl2 en MgCl2 (D-PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Power Block 10x Universeel Blocking reagens</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9495720</td><td>Verdun tot 1x in H2O</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde waterige oplossing (PFA)</td><td>Electro Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Gebruik bij 4% verdund in dH2O</td></tr><tr><td>6 cm&nbsp; platen</td><td>Olympus</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>6-well platen</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>24-well platen</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Tissue cultuur schalen</td><td>Corning</td><td>4239</td><td></td></tr><tr><td>15 cm&nbsp; Tissue cultuur schalen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5442</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conische buizen</td><td>Corning</td><td>4308</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conische buizen</td><td>Corning</td><td>4249</td><td></td></tr><tr><td>0,4% Trypan blauw oplossing</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Voor levensvatbaarheid</td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol 200 proof</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>Bleekmiddel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6009</td><td></td></tr></tbody></table>

het beoordelen van cardiomyocyte subtypen na transcriptie factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Directe herprogrammering van één celtype in een ander is recent naar voren gekomen als een krachtig paradigma voor regeneratieve geneeskunde, ziektemodellering en lijnspecificatie. In het bijzonder vertegenwoordigt de omzetting van fibroblasten in geïnduceerde cardiomyocyte-achtige myocyten (iCLM's) door Gata4, Hand2, Mef2c en Tbx5 (GHMT) een belangrijke weg voor het genereren van de novo cardiale myocyten in vitro en in vivo. Recent bewijs suggereert dat GHMT een grotere diversiteit aan hartsubtypen genereert dan eerder werd gedacht, wat de noodzaak benadrukt van een systematische aanpak voor het uitvoeren van aanvullende studies. Voordat directe herprogrammering kan worden gebruikt als een therapeutische strategie, moeten de mechanistische onderbouwingen van lijnconversie echter in detail worden begrepen om specifieke hartsubtypen te genereren. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van iCLM's door GHMT-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten (MEF's). 
We schetsen methoden voor MEF-isolatie, retrovirale productie en MEF-infectie om een efficiënte herprogrammering te bereiken. Om de subtype-identiteit van herprogrammeerde cellen te bepalen, beschrijven we een stap-voor-stap benadering voor het uitvoeren van immunocytochemie op iCLM's met behulp van een gedefinieerde set compatibele antilichamen. Methoden voor confocale microscopie, identificatie en kwantificering van iCLM's en individuele atriale (iAM), ventriculaire (iVM) en pacemaker (iPM) subtypen worden ook gepresenteerd. Ten slotte bespreken we representatieve resultaten van prototypische directe herprogrammeringsexperimenten en benadrukken we belangrijke technische aspecten van ons protocol om een efficiënte lijnconversie te garanderen. Samenvattend zou ons geoptimaliseerde protocol een stapsgewijze aanpak moeten bieden voor onderzoekers om zinvolle cardiale herprogrammeringsexperimenten uit te voeren die identificatie van individuele CM-subtypen vereisen.

Gebruikmakend van de PM-reporter muizen ontwikkelden we een multiplex immunokleuring strategie om diverse endogene myocyten te identificeren als weergegeven in figuur 1. Na de herprogrammering stappen getoond in figuur 2, kan inductie van subtype-specifieke CM al op dag 4 21 worden gedetecteerd, zij het laag-debiet. Overdag 14, kan het experiment gestopt en beoordeeld sarcomeer ordening (figuur 3) en subtype-speci...

Dit manuscript beschrijft een stapsgewijs protocol voor het genereren en kwantificeren van diverse geherprogrammeerde hartsubtypen met behulp van een retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Hand2, Mef2c en Tbx5.

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren en kwantificeren van een diverse set geïnduceerde cardiomyocyten-subtypes. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale, fundamentele vragen over subtype-specifieke lineage-conversie tijdens cardiale herprogrammering, zoals de noodzakelijke signalen die de assemblage van sarcomeren en de subtype-specificatie reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een methode biedt voor het kwantificeren van effecten op de cardio-subtype-specificatie, wat vereist is voor het uitvoeren van mechanisme-studies.Begin met het isoleren van embryonale fibroblasten van muizen uit embryo's in stadium E 12.5. Bewaar deze in vloeibare stikstof zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Oogst vervolgens plat-E-cellen en zaai deze uit in een zeswells plaat met één miljoen cellen per well, zodat de cellen binnen 24 uur een confluentie van 70 tot 80% bereiken.Bedek de cellen met transfectiemedium en incubeer ze onder standaard kweekcondities. Op de dag voor het experiment neemt u een conische polystyreen buis van 15 milliliter en mengt u per reactie 60 microliters medium met gereduceerd serum met zes microliters transfectiereagens. Incubeer het mengsel vijf minuten bij kamertemperatuur.Om elke afname in de transfectie-efficiëntie te voorkomen, voegt u het transfectiereagens direct toe aan het medium met verlaagd serumgehalte. Voeg vervolgens in totaal 2 µg GHMT-cocktail per reactie toe en tik voorzichtig tegen de buis om het te mengen. Incubeer de reactie 15 minuten bij kamertemperatuur en voeg het mengsel vervolgens druppelsgewijs toe aan de plat-E-cellen.Noteer de datum en tijd van de transfectie. Incubeer de getransfecteerde plat-E-cellen een nacht. Eén uur voordat de embryonale fibroblasten van de muis worden uitgeplaat, wordt een 24-wells plaat voor immunocytochemie voorbereid door eerst 12 millimeter met fibronectine gecoate dekglasjes aan elke well toe te voegen.Voeg vervolgens 300 µL bovine collageenoplossing toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende één uur. Aan het einde van de incubatie ontdooit u een bevroren vial met HCN4GFP muis embryonale fibroblasten. Ontdooi de cellen snel, was ze eenmaal met voorverwarmd fibroblastmedium en bepaal de concentratie levende cellen.Aspireer vervolgens de coatingoplossing in de 24-wells plaat en zaai onmiddellijk 30.000 cellen per well op de met collageen en fibronectine gecoate dekglasjes. 24 uur na transfectie wordt het retrovirale medium gefiltreerd door een surfactant-vrij celluloseacetaatfilter met een poriegrootte van 0,45 micron en overgebracht naar een conische buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens polybrene toe tot een eindconcentratie van acht microgram per milliliter.Vul de plat-E cellen voorzichtig aan met twee milliliter vers transfectiemedium. Te snel wisselen van het medium kan ertoe leiden dat de cellen loslaten. Correct onderhouden plat-E cellen produceren gemiddeld tien miljoen infectieuze eenheden per milliliter.Een hoge GFP-expressie en -intensiteit in meer dan 95% van de cellen correleert doorgaans met een succesvolle GHNT-gemedieerde generatie van geïnduceerde cardiomyocyt-achtige myocyten. Aspireer vervolgens het medium van de gekweekte embryonale fibroblasten en voeg het vers verzamelde retrovirale medium toe. Plaats de plaat daarna terug in de incubator en incubeer deze gedurende de nacht.Breng de volgende dag het medium opnieuw over van de plat-E-cellen naar de embryonale fibroblasten. Verwijder de plat-E-cellen na de tweede viruscollectie. Aspireer 48 uur na inductie het conditioneringsmedium van de cellen en was de cellen eenmaal met PBS.Voeg vervolgens 500 µL voorverwarmd medium voor geïnduceerde cardiomyocyt-achtige cellen toe per well van de 24-well plaat. Vervang het medium elke twee tot drie dagen gedurende de volgende 12 dagen. Aspireer 14 dagen na inductie voorzichtig het medium en spoel elke well met 300 µL ijskoude PBS.Verwijder vervolgens de PBS en voeg 250 µL van een 4% paraformaldehyde-oplossing per well toe en incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Permeabiliseer daarna de cellen door de wells drie keer gedurende vijf minuten te wassen met 300 µL van 0,1% tritonex 100 en PBS. Aspireer de overtollige permeabilisatie-oplossing na de laatste wasbeurt en voeg vervolgens een universele blokkeringsbuffer toe in een volume van 300 µL per well.Blokkeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Kleur één paar objectglazen gedurende de nacht met muis anti-alpha actinine, kip anti-GFP en konijn anti-NPPA antilichamen om geïnduceerde pacemaker-achtige myocyten in geïnduceerde atrium-achtige myocyten te identificeren. Was de volgende dag de wells en voeg het juiste secundaire antilichaam toe, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Voeg na aanvullende wasbeurten 2,4 µL monteermedium toe aan een glazen microscoopOBJECTGLAS. Neem een dekglas uit de 24-well plaat en verwijder het overtollige medium. Plaats het dekglas vervolgens op het objectglas met het monteermedium.Begin bij elke slide aan één zijde en scan in het rood fluorescerende kanaal op en neer om alpha-actinine-positieve, sarcomeren-positieve cellen te identificeren. Sarcomerenstriaties zijn het gemakkelijkst te identificeren bij een golflengte van 555 nanometer. Zodra deze zijn geïdentificeerd, schakelt u over naar het groene kanaal en noteert u of de cellen positief zijn.Schakel vervolgens over naar de computer om de ver-rode golflengte van 647 nanometer te beoordelen op NPPA- of MYL2-kleuring. Cellen die alfa-actinine positief, sarcomeer positief, Hnc4-GFP negatief en Nppa positief zijn, zijn geïnduceerde atrium-achtige myocyten. Nppa-kleuring zal paranucleair en punctaat verschijnen.Tel eerst het aantal cellen 24 uur na het uitplaten, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Inspecteer vervolgens visueel elke cel op een dekglas op een correcte kleuring van alpha-actinine en sarcomeren en noteer het aantal cellen dat positief is gekleurd voor beide markers. Deel dit vervolgens door het werkelijke totaal aantal uitgeplaatte cellen.Een gemiddeld herprogrammeringsexperiment levert ongeveer één procent cellen op die zowel positief zijn voor alfa-actinine als voor sarcomeren. Tegen dag 14 kan het experiment worden stopgezet en geëvalueerd op de organisatie van de sarcomeren. Dit wordt geïdentificeerd door de positieve kleuring voor alfa-actinine, hier in het rood weergegeven.Alleen cellen die sarcomerenorganisatie vertonen, zijn in staat tot spontaan kloppen, dus dit is een goede eerste controle. Hier worden geïnduceerde pacemaker-achtige cardiomyocyten van Hcn4-GFP-reportermuizen getoond. Drie cellen in dit beeld vertonen sarcomerenorganisatie.Drie cellclusters die positief zijn voor Hcn4-GFP zijn aanwezig in het centrum van de afbeelding en kunnen worden geïdentificeerd als een pacemakerceltype. Linksonder kan één cel worden waargenomen met alpha-actinine kleuring, maar zonder sarcomerenorganisatie of identificeerbare subtype-marker. In deze populatie van geïnduceerde ventrikelachtige cardiomyocyten vertoont de centrale cel sarcomerenorganisatie; deze cel kleurt tevens positief voor de myosine lichte keten-marker MYL-2, wat een marker is voor ventriculaire cardiomyocyten.Zodra de techniek onder de knie is, kunnen het uitplaten en de transfectie van de plat-E-cellen in één uur worden uitgevoerd. De inductie van de embryonale muis fibroblasten duurt één tot twee uur en de myto-kwantificatie van een volledige 24-wells plaat ongeveer acht uur. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat gezonde embryonale muis fibroblasten en virussen met een hoge titer essentieel zijn voor een succesvol herprogrammeringsexperiment.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u individuele subtypes van geïnduceerde cardiomyocyten kunt genereren en kwantificeren.

assessing-cardiomyocyte-subtypes-following-transcription-factor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Enkele cel expressie profilering maakt een gedetailleerde analyse van genexpressie van individuele cellen. Beschrijven we methoden voor de isolatie van cardiomyocyten, en het voorbereiden van de daaruit voortvloeiende lysaten voor zowel hele transcriptoom microarray of qPCR van specifieke doelen.

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

We beschrijven hier een protocol voor de generatie van iCM's met behulp van retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Tbx5 en Mef2c in een polycistronisch construct. Dit protocol levert een relatief homogene populatie van geherprogrammeerde cellen met verbeterde efficiëntie en kwaliteit en is waardevol voor toekomstige studies van iCM-reprogrammering.

Verbeterde Generatie van geïnduceerde Cardiomyocytes Met behulp van een polycistronisch Construct uitdrukken optimale verhouding van GATA4, MEF2C en Tbx5

Een fijnafstemming regulatie van gentranscriptie ten grondslag ligt aan embryonale cel lot beslissing. Hierin beschrijven we chromatine immunoprecipitatie assays gebruikt om epigenetische regulatie van zowel cardiale differentiatie van stamcellen en cardiale ontwikkeling van muizenembryo's te onderzoeken.

Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor de reproduceerbare isolatie en langdurige kweek van volwassen muis-cardiomyocyten met een hoge opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid.

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten via overexpressie van een minimale set transcriptiefactoren. Deze technologie kan worden toegepast op het menselijk systeem om platforms te bieden voor toekomstig onderzoek naar hematopoëse, hematologische ziekten en hematopoietische stamceltransplantatie.

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Hier presenteren we een robuuste methode om te herprogrammeren primaire embryonale fibroblasten in functionele cardiomyocytes via overexpressie van GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) naast remming van TGF-β signalering. Ons protocol genereert kloppend cardiomyocytes zo spoedig 7 dagen na transductie met korting tot 60% efficiëntie.

Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes

We beschrijven hier de oprichting en toepassing van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aangeduid als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muisreporterlijn voor cardiale herprogrammeringsbeoordeling. Neonatale cardiale fibroblasten (NPF's) geïsoleerd uit de muizenstam worden omgezet in geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's), waardoor een gemakkelijke en efficiënte evaluatie van de herprogrammeringsefficiëntie en functionele rijping van iCM's via calcium (Ca2 +) flux...

In vitro beoordeling van cardiale herprogrammering door het meten van cardiale specifieke calciumflux met een GCaMP3 Reporter

Leer directe herprogrammering van muizenembryonale fibroblasten naar geïnduceerde cardiomyocyten met GHMT-transcriptiefactoren. Deze methode kwantificeert atriale, ventriculaire en pacemakersubtypen voor mechanistische studies.

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Meer video's verkennen